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Procedimientos que involucran sujetos animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el Institucional utilización, Academia Sinica, Taipei, Taiwán.
1. Preparación de la solución experimental y Equipo para multielectrode grabación de matriz
- Preparar artificial líquido cefalorraquídeo (ACSF; NaCl 124 mM, KCl 4,4 mM, 1 mM NaH 2 PO 3, 2 mM de MgSO4, CaCl2 2 mM, NaHCO3 25 mM y glucosa 10 mM, burbujeado con 95% de O2 y 5% de CO 2).
- Utilizar dos tipos de sondas MEA: 6 x 10 MEA plana y 8 x 8 MEA. La primera sonda abarca la región que comprende la corteza, el cuerpo estriado y el tálamo. Esta última sonda cubre sólo la región cortical.
- Utilice un amplificador de 60 canales con un filtro de paso de banda establecido entre 0,1 Hz y 3 kHz a 1200 de amplificación. Adquirir datos a una velocidad de muestreo de 10 kHz.
- Coloque dos cables de plata recubiertos con AgCl dentro de la cámara de MEA para DCS. Utilice el AgClcables de plata recubiertas para producir campos eléctricos que son generados por un estimulador aislado.
- Colocar un electrodo de tungsteno (diámetro, 127 m; longitud, 7,62 cm; 8 ° CA punta cónica, resistencia, 5 mO) para la estimulación del tálamo, y colocar el electrodo de referencia en la cámara de MEA. Entregar las corrientes del electrodo de tungsteno utilizando un estimulador aislado que es controlado por un generador de impulsos.
2. Preparación de la rebanada del cerebro
- Utilice macho C57BL / 6J, de 4-8 semanas de edad. La casa de los animales en una habitación con aire acondicionado (21-23 ° C; humedad relativa del 50%; 12 h luz / 12 h / ciclo de oscuridad, luces encendidas a las 8:00 AM) con acceso libre a comida y agua.
- Tomar una alícuota de 250 ml de la ACSF que se preparó en el paso 1.1, y colocarlo en un vaso de precipitados que contiene hielo. Al mismo tiempo, el suministro de gas continuo que se compone de 95% de O 2 y 5% de CO 2.
- Cirugía
- Anestesiar al animal con 4% de isoflurano en un vasocaja durante aproximadamente 3 min. Una vez que el animal alcanza una profundidad de la anestesia quirúrgica (indicado por la falta de una respuesta a la pizca dedo del pie), colocarlo en una bandeja poco profunda que está lleno de hielo picado, y quitar la cabeza con unas tijeras.
- Exponer el cráneo, y recorte el músculo restante. A continuación, utilizando unas pinzas, retire la superficie dorsal del cráneo del cerebro. Recorte los lados del cráneo usando unas pinzas. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos con una solución de etanol al 75%.
- Usando una espátula, cortar los bulbos olfatorios y las conexiones nerviosas a lo largo de la superficie ventral del cerebro, y quitar el cerebro. Después de la decapitación, transferir rápidamente el cerebro a un vaso de precipitados lleno de ACSF oxigenada enfriada con hielo.
- Preparación de Medial Tálamo (MT) -ACC cerebro rebanada
Nota: Preparar las rebanadas que contienen la vía de la MT en ACC 13. - Mano-cortar el bloque cerebro con dos cortes sagitales 2,0 mm lateral a la línea media en cada hemisferiopara visualizar la anatomía subcortical. A continuación, hacer dos cortes en ángulo. Hacer que el primero de corte transversal paralelo al tracto de fibra visible en el cuerpo estriado.
- Hacer que el segundo de corte transversal de la conexión entre el cerebelo y la corteza visual en el punto medio entre la comisura anterior y tracto óptico que son ventral y en paralelo a la vía thalamocingulate.
- Coloque el bloque del cerebro a una placa angular (~ 120 °) con adhesivo de cianoacrilato, y haga un corte justo por encima del punto de inflexión de la vía. Despliegue la placa, aplanarlo, y la cola en el escenario de una cámara de vibratome.
- Mediales hacen cortes de cerebro tálamo-ACC (500 m de espesor) y luego les sumergen en helado oxigenados rebanadas aCSF.Transfer a la cámara de grabación, y mantienen a 32 ° C bajo perfusión continua (12 ml / min) con ACSF oxigenada durante 1 hora
3. Preparación de la cámara de perfusión para la grabación de matriz multielectrode
- Preparaciónde cámara de perfusión
- Colocar una sonda de MEA en un sistema multi-canal, y el uso de dos tubos de polietileno separadas para conectar la sonda a una bomba peristáltica. Use un tubo para guiar el LCRa en la cámara de MEA y el otro tubo para guiar el LCRa fuera de la cámara. Finalmente, perfundir continuamente la preparación con cálido LCRa (29-30 ° C) oxigenado (8 ml / min).
- Transferencia de cortes de cerebro de MEA. Mantenga pulsado el corte de cerebro en la MEA con un bastoncillo de algodón húmedo. mover con cuidado el corte de cerebro para asegurar la ACC se orienta por encima de los electrodos.
- Utilice las unidades de anclaje rebanada y pisadores para presionar el corte de cerebro. Este paso asegura una buena conexión eléctrica entre la división y electrodos.
4. Generación de campos eléctricos por DCS
Nota: La definición de la orientación del campo eléctrico se basa en la dirección del eje axodendritic en el ACC. Las orientaciones de los compartimentos de las dendritas y soma eranconfirmada mediante tinción de Golgi 12.
- Coloque el electrodo AgCl (definido como el ánodo) proximal a la ACC, y coloque el otro electrodo (definido como el cátodo) distal a la ACC. Registrar la intensidad de campo que se genera por las dos orientaciones de campo (paralelas y perpendiculares a las fibras axodendritic ACC) por parte de la MEA, y entregar las corrientes de los campos eléctricos a través del estimulador.
- Fijar la distancia de los electrodos AgCl (alrededor de 1,5 a 2 cm), y ajustar la fuerza actual del estimulador para hacer que el DCS entre 0,5 y 2 mA.
5. eléctricamente inducida respuestas corticales sinápticas
Nota: inducir respuestas sinápticas en el CAC por la estimulación eléctrica en el MT, en la que un generador de estímulo eléctrico programable produce pulsos de corriente bifásica rectangular.
- Repetir el apartado 3 anterior.
- Colocar un electrodo de tungsteno en el MT, y entregar impulsos del estimulador a la Thalregión amic de las rodajas a través de electrodos de tungsteno bipolar.
- El uso de diversas intensidades de corriente para determinar el umbral que provoca una respuesta ACC. Aquí, utilizar una intensidad de ± 150 mu y la duración de 200 microsegundos, lo que provocó una respuesta máxima del 80% en la ACC en la mayoría de las rebanadas.
- Mover el electrodo de tungsteno a lo largo de la vía thalamocingulate (de MT al cuerpo calloso) en el segmento de MT-ACC para obtener los perfiles de respuesta óptimos.
- Hacer 10-20 barridos de las respuestas del CAC, y utilizar el software de forma automática a un promedio de la totalidad de la ACC evocado por la estimulación MT. El resultado ISS las respuestas sinápticas en el CAC inducidas por la estimulación por vía MT MT-ACC.
6. inducida eléctricamente episodios de tipo convulsivo
Nota: La actividad convulsiva-como se indujo por la aplicación de 4-aminopiridina (4-AP; 250 mM) y bicuculina (5 M). Anteriores estudios de control de tiempo mostraron que las respuestas máximas y estables aparecieron2-3 horas después de la aplicación del fármaco 14.
- Repita el apartado 5 anterior.
- Añadir fármacos para la solución de perfusión. Utilice 4-AP (250 mM) y bicuculina (5 M). Mezclar los medicamentos de manera uniforme, y continuar la perfusión durante 2-3 horas.
- Para facilitar la actividad convulsiva, mantener la bomba de perfusión a un ritmo relativamente rápido de perfusión (8 ml / min), que también puede ayudar a prevenir la acumulación de un gradiente de pH.
- Colocar un electrodo de tungsteno en el MT, y entregar la estimulación eléctrica (150 mu, 200 microsegundos de duración) para obtener perfiles de respuesta del CAC.
- Hacer barridos 10-20 y un promedio de las respuestas.
- Vuelva a colocar la solución de perfusión con ACSF fresca para lavar las drogas. Repita el paso 6.5.
7. Efecto Ensayos de DCS sobre las respuestas corticales evocados
- Repita las secciones 3 y 4. Asegurar que los campos eléctricos uniformes se generan haciendo pasar corrientes entre dos alambres de plata recubiertos con AgCl paralelas que se colocan dentro de la Mcámara de EA. Si no hay problemas, la DCS se mantiene entre 0,5 y 2 mA.
- Apagar el DCS, y colocar un electrodo de tungsteno para estimular el tálamo (± 150 mu, 200 microsegundos de duración). Para obtener las respuestas sinápticas máximas en el CAC, hacer barridos de 10-20 y un promedio de las respuestas.
- Al mismo tiempo activar la DCS (2 mV / mm Resistencia a la DCS) y la estimulación del tálamo (350 mu, 200 microsegundos de duración). Evaluar los cambios de amplitud de la respuesta evocada por estimulación ACC talámica durante DCS.
- Apagar el DCS, y añadir 4-AP (250 mM) y bicuculina (5 M) a la solución de perfusión. Luego, esperar 2-3 horas. Cuando los medicamentos afectan el corte de cerebro, el corte produce respuestas convulsivos corticales.
- Hacer 10-20 barridos de las respuestas del CAC, y luego medir la amplitud y la duración de las respuestas evocadas corticales convulsiones eléctricas.
- Después del paso 7.5, gire simultáneamente en el DCS (2 mV / mm DCS fuerza) y la estimulación del tálamo (150 mu, 200 duratien microsegundos). Evaluar los cambios en la amplitud y la duración de las respuestas convulsivos corticales evocados durante la aplicación DCS.
- Vuelva a colocar la solución de perfusión con ACSF fresca para lavar las drogas, y repita los pasos 7.2 y 7.3.
- Recoger todos los datos de la grabación, y el grupo de los datos en las diferentes condiciones experimentales. Evaluar la amplitud y la duración de las respuestas de convulsiones corticales bajo diferentes condiciones experimentales.
Análisis de datos 8.
- Utilizar el software (por ejemplo, el software del estante MC) a medio automáticamente las respuestas registradas, y exportar los datos en bruto a una hoja de cálculo. Analizar la amplitud y la duración de los datos en bruto y generar figuras en color.
- Para detectar eventos convulsivos oscilatorios, utilizar software para medir el valor de referencia y las desviaciones estándar (DE). Set 3 SD del nivel de ruido como el umbral. Amplitudes de los picos durante un evento de oscilación que superan este umbral se detectan de manera automáticaed.
- Realizar el análisis estadístico utilizando la prueba t de Student.
- Mediciones rápidas y análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) resultados en el texto como media ± SE, con n que indica el número de cortes estudiaron 12.