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Artículo de método

Las métricas para caracterizar nuevos embrionarias Alargamiento del nematodo

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DOI:

10.3791/53712

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28 de marzo de 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry, Pharmaqam, Université du Québec à Montréal

En este artículo

Resumen

Aquí detallamos protocolos específicamente diseñados para monitorear los defectos morfogénicos que ocurren durante las fases tempranas y tardías de la elongación embrionaria del nematodo Caenorhabditis elegans. En última instancia, estos protocolos están diseñados para identificar los genes que regulan estas fases y caracterizar sus requisitos diferenciales a lo largo del eje antero-posterior del embrión.

Resumen

Diseccionar las vías de señalización que controlan la alteración de los procesos morfogénicos durante el desarrollo embrionario requiere métricas robustas y sensibles. La elongación embrionaria del nematodo Caenorhabditis elegans es una etapa tardía del desarrollo que consiste en la elongación del embrión a lo largo de su eje longitudinal. Esta etapa de desarrollo está controlada por la comunicación intercelular entre las células hipodérmicas y los músculos subyacentes de la pared corporal. Estos mecanismos de señalización controlan la morfología de las células hipodérmicas mediante la remodelación del citoesqueleto y las uniones célula-célula. La medición de la letalidad embrionaria y la detención del desarrollo en estadios larvarios, así como la alteración del citoesqueleto y de las estructuras de adhesión célula-célula en células hipodérmicas y musculares, son fenotipos clásicos que se han utilizado durante más de 25 años para diseccionar estas vías de señalización. Estudios recientes requirieron el desarrollo de nuevas métricas dirigidas específicamente a la elongación temprana o tardía y la caracterización de defectos morfogénicos a lo largo del eje antero-posterior del embrión. Aquí, proporcionamos protocolos detallados que permiten la medición precisa de la longitud y el ancho de los embriones en elongación, así como la longitud de las larvas sincronizadas. Estos métodos constituyen herramientas útiles para identificar los genes que controlan la elongación, para evaluar si estos genes controlan tanto las fases tempranas como las tardías de esta etapa y son necesarios de manera uniforme a lo largo del eje antero-posterior del embrión.

Introducción

Durante casi 50 años los nematodo Caenorhabditis elegans se estableció como un poderoso modelo para estudiar cuestiones importantes en el desarrollo, la neurobiología, la evolución, las interacciones huésped-patógeno, etc. 1 La fuerza de este modelo en el estudio del desarrollo radica en: su ciclo de vida corta de 3 días; la facilidad con que estos animales pueden ser alterados genéticamente; su transparencia que permite la observación de los desplazamientos y la morfología celular en los animales vivos y su desarrollo que es en su mayoría extrauterino. Las etapas de desarrollo del nematodo implican la embriogénesis y cuatro etapas de larvas (L1 a L4), seguido de la edad adulta. Durante el desarrollo embrionario, la morfogénesis epidérmica atrajo una considerable atención por su capacidad para permitir una mejor comprensión de cómo epitelial células migran como un grupo, cómo se reorganizan sus uniones y modificar su morfología individual, así como su posición relativa dentro de un epitelio funcional.morfogénesis epidérmico se divide en cuatro etapas: intercalación dorsal que consiste en la reorganización de las células epidérmicas dorsal, referido como la hipodermis; recinto ventral, que consiste en la migración de las células hypodermal ventral hacia la línea media ventral que encierra por lo tanto el embrión en una monocapa de células epiteliales; temprana y tardía de elongación transformar el embrión en forma de frijol en larvas vermiformes. Después de la morfogénesis, la portilla de embriones y larvas L1 comienzan a alimentarse utilizando bacterias disponibles en su entorno inmediato.

por lo tanto la elongación embrionarias es una fase tardía del desarrollo embrionario. Se compone de la extensión del embrión a lo largo de su eje longitudinal y una reducción de su diámetro transversal. Esto implica una modificación dramática de la forma de las células hipodermis. Alargamiento se divide en una temprana y una fase tardía. La primera fase comienza en la fase de coma y termina cuando los músculos del cuerpo de paredes comienzan a contraer en la etapa de 1.75 veces en wde tipo ILD (en peso) de embriones - correspondiente a los embriones que son 1,75 veces mayor en longitud en comparación con los embriones no alargada. Procesos morfogenéticos que se producen en esta fase son impulsados ​​principalmente por la contracción de los haces de actina filamentosa (FB) situados en el polo apical de las células hipodérmicas que impulsan su alargamiento a lo largo del eje antero-posterior del embrión 2. La contracción de los FB es el control por la fosforilación de las cadenas de miosina luz por tres quinasas LET-502 / rock, MrCk-1 y PAK-1 5. La fase tardía de la elongación, comienza cuando los músculos del cuerpo se vuelven funcionales de pared y empiezan contratación. Se trata de la señalización mechanotransduction de los músculos del cuerpo de pared a las células dorsales y ventrales hipodermis y termina cuando los animales salen del cascarón 3.

defectos de elongación se caracterizan generalmente por el porcentaje de animales que mueren como embriones (embriones de letalidad; Emb) y los deteniendo su desarrollo como larvas L1 (fenotipo detención larval; Lva) y ser significativamente más corto que en peso. Identificación de la etapa de detención del desarrollo requiere la observación microscópica de embriones muertos y detenido larvas 3-6.

Recientemente se demostró que varios genes, como el regulador de Cdc42 / Rac y el efector pix-1 y pak-1, el control de los procesos morfogenéticos durante la temprana y tardía de elongación 3,7. También demostraron recientemente que los procesos morfogenéticos difieren a lo largo del eje antero-posterior de los embriones durante la elongación temprana 3 7. Estos hallazgos motivaron el desarrollo de nuevas métricas específicamente dirigidas a las etapas tempranas o tardías de elongación y otras métricas que permiten la caracterización de la morfología de los embriones a lo largo de su eje antero-posterior durante la elongación temprano.

Estos nuevos métodos consisten en la medición de la longitud de los embriones al principio y al final de elongación temprano, así como la anchura de su élanuncios y colas. 7 Dos protocolos también se han desarrollado para medir la longitud de las larvas recién eclosionadas, sincronizada en fase L1 7.

Las cáscaras de huevo de los embriones a proteger contra el tratamiento con hipoclorito alcalino, mientras que las larvas, adultos y bacterias presentes en el medio de cultivo se disuelven por el tratamiento. Este tratamiento se utiliza a continuación para purificar embriones a partir de una población no sincronizada que contiene una mayoría de los bien alimentados adultos 8. la restricción de alimentos se utiliza para sincronizar las larvas recién eclosionadas. La medición de la longitud de estas larvas se usa entonces para detectar defectos de elongación. Esta medición se prefiere sobre la medición de las larvas detenido en placas de cultivo porque las larvas que eclosionan de que no esté totalmente embriones alargados puede recuperar a "longitud normal" cuando la alimentación pero mantendrá su tamaño reducido cuando detenido en la ausencia de alimento.

A continuación, presentamos los protocolos que permitan a la medición de la length de alargarse embriones, así como la anchura de la cabeza y la cola utilizando lapso de tiempo DIC microscopía y análisis de imagen (Protocolo 1). También proporcionamos protocolos detallados para medir la longitud de las larvas sincronizado usando análisis de imágenes (Protocolo 2) y citometría de flujo (Protocolo 3).

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Protocolo

1. Caracterización de defectos de elongación tempranos en WT y mutantes Animales

  1. Los embriones de montaje para Normarski DIC Microscopía
    1. Preparar los siguientes medios de cultivo y el material:
      1. M9 Buffer, se disuelven 12,8 g / L de Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 3 g / L KH 2 PO 4, 5 g / L de NaCl, 0,25 g / L MgSO 4 • 7H 2 O en agua destilada y autoclave para esterilizar.
      2. NGM placas, se disuelven 3 g / l de NaCl, 16 g / l de agar, 2,5 g / L de bactopeptona en ddH2O Autoclave y añadir 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl 2, tampón de fosfato 1 mM y 5 mg de colesterol / ml. Verter 6 ml de NGM por placas de 60 mm. Dejar que el medio se solidifique durante 24 horas a temperatura ambiente. Añadir unas gotas de un cultivo saturado de E. bacterias OP50 coli cultivaron en caldo Luria (LB). Deje que las bacterias crecen durante 48 horas y almacenan las placas a 4 ° C.
      3. Para generar el gusano pick, montar un alambre de platino 0,01 "de diámetro en un corto pipeta Pasteur. Fije el alambre de platino a la extremidad de la pipeta de vidrio por calentamiento de este extremo con un quemador de benceno. Aplanar el extremo del alambre para generar una especie de pala.
    2. Crecer la cepa gusano en 60 mm NGM placas con OP50 a 20 ° C.
      NOTA: alelos termosensibles pueden requerir creciente los animales a temperaturas no permisivas en hasta 25,5 ° C. Las placas deben contener muchos adultos jóvenes y todavía un montón de alimentos con el fin de seguir los protocolos.
    3. Colocar un portaobjetos de microscopio entre dos portaobjetos spacer cubiertos por dos capas de cinta adhesiva (Figura 1A).
    4. Preparar una solución de agarosa al 3% (peso / volumen) en tampón M9 disolviendo 0,6 g de polvo de agarosa en 20 ml de tampón M9 por calentamiento en el microondas durante 30 seg. Deje que la solución se enfríe durante 5 min.
      NOTA: La solución de agarosa se puede utilizar para unos pocos días después de la fusión en un horno de microondas. Esotambién puede ser en alícuotas y se almacena a 4 ° C durante semanas.
    5. Coloque una gota de solución de agarosa al 3% caliente en el portaobjetos de vidrio situada entre los dos espaciadores toboganes. Evitar la formación de burbujas.
    6. Rápidamente cubrir la agarosa con otra diapositiva como se muestra en la Figura 1B y presione hacia abajo suavemente. El carro superior se aplanar la gota de agarosa y generar una almohadilla con el grosor de dos capas de cinta adhesiva.
    7. Dejar que la agarosa solidifique durante al menos 1 min a temperatura ambiente o hasta que los embriones están listos para ser transferidos a la almohadilla.
    8. El uso de un pick gusano, transferir 20 a 30 adultos jóvenes bien alimentados desde el NGM-placa en un tubo de microcentrífuga que contiene 400 l de tampón M9.
    9. Permitir que los gusanos se sedimenten por gravedad durante aproximadamente 5 minutos y eliminar el sobrenadante utilizando una micropipeta. Este paso tiene como objetivo eliminar el máximo de bacterias escogidas con los nematodos.
    10. Añadir 200 l de tampón M9 a cada tubo.
    11. El uso de un pip Pasteurette, transferir el contenido del tubo (tampón y nematodos) a un vidrio de reloj.
    12. Utilice una o dos agujas 25G 5/8 "para cortar los animales en la sección media del cuerpo (entre la espermateca y la vulva).
      NOTA: una hoja de bisturí también se puede utilizar como una alternativa a la aguja (s). Hacer esto en natación nematodos y puede requerir un poco de práctica. La idea es utilizar agujas como tijeras o un cuchillo como dependiendo de cómo se utilizan muchas agujas. Una vez que los animales se cortan abierta, hermafroditas liberan sus embriones en el buffer.
    13. Concéntrese embriones en el centro del cristal de reloj a través de la generación de un vórtice circular dentro del líquido.
    14. Eliminar la mayor parte de la M9 desde el vidrio de reloj utilizando una micropipeta. Deje aproximadamente 30 l de M9 con los embriones.
    15. Retire la corredera que cubre el tampón de agarosa (Figura 1B) deslizándolo fuera de la almohadilla.
    16. Cortar la almohadilla con una hoja de afeitar con el fin de ser capaz de cubrir por completo con un cubreobjetos (Figura 1C).
    17. Utilizando una pipeta Pasteur, transferir todos los embriones (y restos gusano) en la almohadilla de agarosa.
    18. Grupo de los embriones en el centro de la almohadilla usando una pestaña pegada en el extremo de una punta utilizada para micropipetas 200 l.
    19. Lentamente colocar un cubreobjetos sobre la almohadilla para evitar la formación de burbujas y sellarlo.
      NOTA: Varias selladores pueden ser utilizados. Utilizamos la elaboración de las encías encuentra en las tiendas de arte y artesanía (generalmente utilizado como enmascaramiento de goma de la pintura acuarela). Esta goma se utiliza porque es hidrófilo y se solidifica razonablemente rápido y no es tóxico para los gusanos. Los portaobjetos también se puede sellar con esmalte de uñas o valap (mezcla hecha de vaselina, lanolina y cera Parafin).
    20. Permitir que el dibujo seca la goma durante aproximadamente 15 min.
  2. Alargamiento grabación temprana por medio de cuatro dimensiones Normarski DIC Microscopía
    NOTA: El objetivo de este paso es registrar alargamiento temprano de la coma para el inicio de la elongación tarde- Definido como el momento en que los músculos del cuerpo de pared comienzan contratación. También tenemos como objetivo registrar más de un embrión en el momento. Ocho horas de grabación suelen ser necesarios para registrar el alargamiento temprano para un grupo de embriones no sincronizadas.
    1. Coloque la corredera montada en la platina de un microscopio. Asegúrese de que el microscopio está equipado con 10X y 60X objetivos, así como lentes de DIC, prisma, cámara y software de captura que permitan la microscopía de lapso de tiempo y la generación de Z-pilas (automatizado Z-plataforma).
      NOTA: asegúrese de que la temperatura es constante entre 20 y 23 ° C en la sala de microscopía. Una cámara de calentamiento-enfriamiento puede ser requerida en la platina del microscopio, especialmente cuando se utilizan mutantes termosensibles.
    2. Identificar un grupo de embriones en etapas pre-morfogénesis utilizando el objetivo de 10X.
    3. Una vez localizado, deslice el objetivo de 10X y añadir una gota de aceite de inmersión en la diapositiva.
    4. Usando el objetivo 60X, identificar la parte superior y la parte inferior de embryos para configurar los parámetros de imagen Z-Stack.
      NOTA: No dude en establecer la pila Z mayor que el espesor de los embriones. Establecer la distancia entre dos planos adyacentes como 0,8 micras. Esto permitirá que para cubrir la profundidad total de los embriones en 35 a 50 Z-planes.
      NOTA: Si el microscopio contiene una plataforma xy automatizado, los embriones ubicados en diferentes lugares de la almohadilla se podrían registrar simultáneamente. Para ello, ficha coordenadas xy de cada ubicación en la almohadilla que se desea analizar durante el transcurso del experimento. Asegúrese de seleccionar la xy la hora de establecer el parámetro de grabación y seguir el resto del protocolo como se indica. Delgada Z-seccionamiento del embrión durante la grabación no se requiere necesariamente para las mediciones que se detallan en este protocolo. Grabación de desarrollo embrionario de los animales WT y mutantes con la máxima resolución sin embargo, es una buena práctica con el fin de construir una biblioteca de grabaciones capaces de apoyar los análisis adicionales.
    5. Conjuntoel lapso de tiempo con intervalos de 2 min entre dos adquisiciones de duración de 8 horas.
      NOTA: El tiempo de exposición dependerá de la intensidad de la luz establecido para el microscopio. el movimiento celular durante la elongación temprana es muy lento; la exposición a tiempo podría ser de aproximadamente un fotograma por segundo o menos. Si los embriones se encuentran en etapas tempranas (morfogénesis de intercalación dorsal, ventral del recinto), el alargamiento anticipada se registró dentro de 1 hora. Hacer obturación de luz esté cerrada entre cada adquisición.
    6. Ejecutar la adquisición y guardarlo.
  3. La medición de los defectos de elongación tempranas usando análisis de imagen
    1. El software ImageJ Fiji-abierta ( v1.48o - http://fiji.sc/Fiji ).
    2. En el menú seleccione Analizar / mediciones indicadas, seleccione perímetro. Para cada embrión, ajustar la barra Z-escala para centrarse en la faringe del embrión como se muestra en la Figura 2A. Esto asegurará que usted se centra en el centro del embrión.
    3. Para medir la longitud del embrión, ajustar la barra de escala de tiempo para que el embrión de interés en el inicio de la elongación temprano (etapa coma; Figura 2A). Tenga en cuenta el tiempo ( "Time-inicio").
    4. Elija la herramienta de línea segmentada. Dibujar una línea segmentada de la punta de la boca del embrión hasta la punta de la cola después de la línea media del embrión (Figura 2A). Uso de la pestaña del menú Analizar / Medida, obtener la longitud de la línea dibujada ( "principio de longitud").
    5. Repetir la medición para el mismo embrión al final de elongación temprano (momento en que comienzan los músculos de contratación). Tenga en cuenta el tiempo ( "Time-end") y medir la longitud del embrión ( "Largo-end"), como se detalla más arriba (Figura 2B).
    6. Calcular la duración (D) de la elongación temprana y el aumento de la longitud (L) durante esta etapa de la siguiente manera:
      D = "Tiempo de fin" - "Time-inicio"
      & #160; L = "Longitud de extremo" - "Longitud-inicio"
    7. Para medir la anchura de la cabeza, ajustar la barra de escala de tiempo para tener un embrión en la fase de interés (etapa 1.2 veces o al final de elongación temprano). Elija la herramienta de línea recta. Dibuje la línea media transversal (eje dorso-ventral) de la cabeza. Esta sección es la parte más gruesa del embrión (Figura 2C). Mediante el menú Analizar / Medir, obtener la longitud de la línea correspondiente a la anchura de la cabeza.
    8. En el mismo punto de tiempo, repetir este paso dibujando la línea media transversal de la cola (línea media entre la válvula intestinal y la punta de la cola; Figura 2C) y medirlo para obtener el ancho de la cola.
      NOTA: Use esta medida para comparar los embriones en la misma etapa a través de diferentes fenotipos. Para asegurar la reproducibilidad de esta medición, asegúrese de encontrar un lugar situado alrededor de la línea media de la cola del animal que puede ser reconocida fácilmente de un animal a unano ella.
    9. Para el cálculo de la cabeza a anchura de la cola, se divide el ancho de la cabeza por la anchura de la cola.

2. Caracterización de defectos tardío de elongación usando análisis de imagen

  1. Sincronización de L1 larvas mediante tratamiento con hipoclorito alcalino
    1. A partir de una placa no hambre de 60 mm que contiene muchos adultos grávidas, recoger todos los gusanos en un tubo de microcentrífuga de lavado de los nematodos de la placa con 1 ml de tampón M9 con una pipeta Pasteur.
    2. nematodos sedimentario a 3.500 xg durante 3 minutos a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante utilizando una micropipeta sin perturbar el sedimento gusano.
    3. Añadir 1 ml de solución de hipoclorito a cada tubo (0,4 M de hipoclorito, NaOH 0,5 M) y agitar durante 3 min.
      NOTA: La solución de hipoclorito alcalino y se deberá preparar y embriones de que esta solución debe agitarse suavemente pero de forma continua para optimizar la disolución de los adultos y la oxigenación de la EMBRyos. Después de 3 min de agitación, la mayoría de los adultos deben liberar sus huevos en la solución.
    4. Giran a 3500 xg durante 3 min a temperatura ambiente y rápidamente eliminar el sobrenadante utilizando una micropipeta sin perturbar el sedimento.
    5. Lavar cuatro veces con 1 ml de tampón M9 seguido de centrifugación a 3500 xg durante 3 min.
    6. Después de que el cuarto de lavado, quitar los huevos sobrenadante y resuspender en 700 l de tampón M9 sin pipeteando arriba los huevos (como los huevos se pegarían al plástico de la punta).
    7. Tape el tubo en un agitador orbital 3-mm colocado en una incubadora a la temperatura de crecimiento apropiada y agitar a 600 rpm durante la noche.
  2. Medida de longitud de larvas Sincronizada
    1. Centrifugadora detenido larvas L1 a 3.500 xg durante 3 minutos a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante. Resuspender las larvas en 100 l de tampón de M9 y transferirlos a una almohadilla de agarosa usando una pipeta Pasteur (agarosa almohadillas deben preparand como se describe en la sección 1.1.2 a 1.1.8). Colocar un cubreobjetos sobre la almohadilla.
      NOTA: La almohadilla no necesita ser sellado con goma de mascar para este experimento que involucra la adquisición corto.
    2. Utilice un objetivo de contraste de fase y de iluminación 10 veces para medir la longitud de las larvas si se utiliza una cámara de alta resolución. Aumentar la intensidad de la luz para ser capaz de capturar imágenes en unos pocos milisegundos y por lo tanto obtener una imagen clara de las larvas (Figura 2D).
      NOTA: Si bien las basuras de natación de las larvas se reducen por la almohadilla de agarosa, se siguen moviendo. Por lo tanto, la grabación rápida es esencial para obtener una imagen clara.
    3. Abrir Fiji-ImageJ y repita el paso 1.3.1. Para medir la longitud de las larvas, seleccionar la herramienta de línea segmentada. Dibujar una línea segmentada de la punta de la cabeza hasta la punta de la cola siguiendo la línea media de las larvas (Figura 2D, panel derecho).
    4. Usando el menú Análisis / Medida se obtiene la longitud de lalínea trazada correspondiente a la longitud de las larvas en micrómetros.

3. Caracterización de defectos Late elongación mediante citometría de flujo

  1. Las larvas sincronizar
    1. Purificar embriones utilizando el tratamiento con hipoclorito alcalino tal como se describe en la sección 2.1 de platos llenos 100 mm de adultos jóvenes bien alimentados y dejar que la escotilla del embrión y la detención L1 en tampón M9 de 16 a 24 horas a 20 o 25,5 ° C dependiendo de la cepa analizado.
      NOTA: Un plato lleno de adultos bien alimentados por la tensión es suficiente para el análisis se describe a continuación.
  2. Calibración del Clasificador de Gusano
    NOTA: El citómetro de flujo se utiliza aquí es un flujo de partículas grandes citómetro (en lo sucesivo, el clasificador de gusano). El clasificador de tornillo sin fin incluye un láser de diodo de 670 nm de color rojo, que se encuentra frente a un detector de extinción. El clasificador de gusano también contiene un láser de argón de varias líneas para la excitación fluorescente. los sinstrumentos ORMA tienen tres tubos fotomultiplicadores detectores (PMT) de fluorescencia utilizados para detectar emisiones de fluorescencia en las regiones verde, amarillo y rojo del espectro. En el protocolo descrito aquí, TOF se utiliza para medir el tamaño de las larvas, el canal rojo será utilizado para identificar gusanos muertos que se tiñeron con yoduro de propidio (PI). GP (General Purpose) de alta fluorescencia de Control de Partículas utiliza para calibrar el instrumento y como control interno en nuestro experimento de visualización de alta fluorescencia de color verde, amarillo y rojo. Ellos serán los únicos objetos de la muestra analizada con alta emisión detectada en el canal verde y serán posteriormente identificado a partir de esta característica.
    NOTA: Living animales se identifican en base a la ausencia de fluorescencia en el canal verde y rojo, así como en el TOF. emisión autofluorescente desde el intestino de las larvas no es detectable en la fase L1.
    1. Encender el bloque de láser, el ordenador, el de un compresord el instrumento gusano clasificador. Pulse el botón START en el software clasificador de gusano abierto como se indica en el manual de instrucciones del instrumento.
    2. Observe la ventana emergente de control de láser de argón. Seleccione el modo RUN y espere a que las potencias de láser llegan a 10 ± 1 mW. Seleccione Listo en la ventana de control de láser.
    3. Establecer la vaina y las presiones de la muestra a 5,10 ± 0,02 y 5,51 ± 0,01, respectivamente. Deje que la presión se equilibre durante al menos 15 minutos y haga clic en la casilla de verificación Aceptar PRESIÓN.
      NOTA: El caudal depende de la vaina y las presiones de la muestra.
    4. Asegúrese de eliminar todas las burbujas presentes en los túbulos de canales de flujo entre la copa de muestra y la cámara de análisis. Para ello, haga clic en adquirir y golpee suavemente el túbulo hasta que se adquieren sin burbujas (como se ve en la ventana de adquisición).
    5. Configuración de todos los parámetros para la medición y detección de la siguiente manera fluorescente y TOF:
      1. Establecer las escalas de TOF, Ext, verde, amarillo y rojo de256. Conjunto de ganancia como se describe en la Tabla 1. Ajustar control de PMT a 700ºC durante verde y amarillo y 900 para Red.
        NOTA: Dos filtros de excitación están disponibles (488 nm y 514 nm) y se pueden utilizar ya sea para excitar la proteína fluorescente verde (GFP) o la proteína fluorescente amarilla (YFP) o cualquier fluorocromos se excita a estas longitudes de onda con el láser de argón de líneas múltiples. filtros adecuados para que se inserta en la cámara de filtro del equipo. Se utilizó el filtro de 488 nm para el siguiente experimento.
    6. Para calibrar el clasificador de tornillo sin fin, seleccione "partículas de control Ejecutar" en el menú de herramientas. Poner 20 ml de 1x GP (General Purpose) de alta fluorescencia Partículas de control en la taza (estas partículas son partículas fluorescentes de tamaño preciso, que se vende por el fabricante citometría de calibrar sus instrumentos).
    7. Haga clic en el botón ADQUISICIÓN para comenzar la vaina y el flujo de la muestra.
      NOTA: Esperar una media relacionado con el control de la distribución de partículas de 21 ± 6 y acoefficient de variación en torno a esa media (CV) ≤11. Si el CV es> 11 y la media es> 27 intento de limpiar los túbulos haciendo clic varias veces en el botón limpio o con un movimiento rápido del canal de flujo.
  3. Adquisición de Animal TOF
    NOTA: La luz dispersa cuando un objeto pasa por la celda de flujo entre la fuente láser y el detector de extinción. El tiempo que tarda la luz se disperse por el objeto volador (tiempo de vuelo, TOF) se utiliza para medir la longitud axial del objeto. La extensión de la luz enmascarada por el objeto (extinción, EXT) se utiliza como una medida de su opacidad densidad / óptico.
    1. Colocar 10 l de tipo salvaje sincronizado (en peso) L1 en un vidrio de reloj y estimar el porcentaje de muertos-huevos usando un microscopio de disección.
      NOTA: Sincronizado L1 presentan alta EMB (mayor que 20%) en peso no debe ser utilizado para un análisis adicional.
    2. La transferencia sincronizada de L1 de la microcentrífuga (unaproximadamente 700 l de M9 que contiene L1) a un tubo cónico de 15 ml. Añadir yoduro de propidio (PI) a una concentración final de 10 g / ml (dilución 1/100 de una solución madre 1 mg / ml) y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente.
      NOTA: los huevos y larvas muertas se tiñeron utilizando PI y detectados como objetos altamente fluorescentes utilizando el canal rojo.
    3. Añadir 10 ml de tampón M9 para diluir las poblaciones de colores. Tomar 5 ml de las poblaciones diluidas y los diluir cuatro veces mediante la adición de 15 ml de M9. Coloque esta dilución en la copa de muestra.
    4. Ejecutar el flujo de la muestra por ACQUIRE pulsando y observar la velocidad de flujo.
      NOTA: Con el fin de tener una medición precisa, el caudal debe mantenerse entre 15 y 25 objetos / seg.
    5. Si es necesario, ajustar la cantidad de animales en la taza para alcanzar el caudal deseado.
      NOTA: La voluntad velocidad de flujo depende de las presiones (de la vaina y de la muestra) que son constantes como se indica en 3.2.3 y de la concentración de i larvasn la copa. Si el caudal es mayor de 25 objetos / seg añadir un poco de memoria intermedia en la taza. Si es menor de 15 objetos / seg añaden L1 concentrada (de la etapa 3.3.3) en la taza.
    6. Una vez que se alcanza la concentración apropiada de objeto, evaluar el volumen de la taza y añadir 1/4 º de este volumen en una solución de alta fluorescente GP Control de Partículas 4x.
    7. Ajustar el parámetro de compuerta y la clasificación. Para ello, haga clic en "apertura" en el menú y seleccione 'vs. TOF' y 'verde'. Haga clic en "Clasificación" en el menú y seleccione 'TOF vs' y 'Rojo'. Aparecerán entonces de apertura de puerta y los gráficos de clasificación tal como se muestra en la Figura 3A.
      NOTA: Esto permitirá la visualización de las partículas de control (emisión en verde y rojo), animales muertos manchados por PI y las burbujas (emisión en rojo y no verde) y los animales que viven (sin emisión en canales ni verdes ni rojos) (Figura 3A ).
    8. Ejecutar el experimento haciendo clic ACQUIRE.
      NOTA: Para identificar pequeñas diferencias de tamaño entre las larvas, analizar alrededor de 10.000 objetos, por lo que alrededor de 8.000 animales. Detener el experimento y exportar los datos mientras que el formato .txt haciendo clic en GUARDAR.
  4. Medición del tamaño relativo de la vida de los animales en las poblaciones sincronizado
    1. Abra el archivo .txt utilizando un software capaz de gestionar grandes tablas de datos.
    2. A partir de los objetos analizados extraer los valores TOF asociados con partículas de control que se caracterizan por la emisión en el canal verde mayor de 100 unidades arbitrarias (este valor depende de los parámetros establecidos en la sección 3.2.5). Crear una nueva columna y lo llaman "partículas de control '. Crear una columna que contiene todos los otros objetos, excepto las partículas de control llamado "muestra". NOTA: la emisión de fluorescencia de las nuevas necesidades de lotes de partículas para ser verificada antes de iniciar las adquisiciones. Esto fijará el umbral de fluorescencia que permite la identificación departículas de control sobre L1.
    3. Para cada cepa analizada identificar la porción del experimento en el que la velocidad de flujo ha sido alterado (debido a la presencia de un tapón de huevos por ejemplo). Para ello:
      1. Trazar el TOF de partículas '' de control para cada muestra como un factor de tiempo (Figura 3B).
      2. Dibuje la línea de tendencia lineal utilizando la herramienta de línea de tendencia y mostrar la ecuación en el gráfico.
        NOTA: El TOF de partículas de control debe ser constante en el tiempo (línea horizontal, Figura 3B). Teniendo en cuenta la ecuación de la línea de tendencia lineal trazada en los datos y = ax + b, asegúrese de que la 'a' valor es menor que el 10 -4. Todas las mediciones realizadas dentro de secciones de tiempo que muestra una ruptura en la alineación de las partículas de control deben ser retirados del análisis.
    4. La toma de embriones muertos y burbujas (de emisión superior a 15 en el rojo), así como los desechos pequeños y grandes tapones de huevo (TOF inferior a 10 y de altoer del 70, respectivamente) a partir de la medición "muestra".
    5. Trazar la distribución '' partículas de control para cada cepa analizada. Como se ve en la Figura 3C estas distribuciones deben superponer casi perfectamente. Esto asegura que las mediciones TOF obtenidos para diferentes cepas se pueden comparar. NOTA: normalización de elementos de muestra TOF sobre partículas de control pueden ser usados ​​si las distribuciones de partículas de control en una muestra no se superponen con los de las muestras de control. TOF normalizado se calcula como sigue:
      1. Normalizar TOF para el genotipo G = (TOF muestra para G) / ( 'control de partículas' TOF promedio de G) x ( 'partícula de control "promedio TOF de peso), donde p es la muestra de control.
    6. Trazar la distribución de larvas TOF para cada cepa incluida la muestra de control, en nuestro caso, en peso de los animales (Figura 3D). Medir la media y el error estándar de la media (SEM) para cada población ( Figura 5A y B).

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Resultados

Partida, con maletero y Jefe / Relación de la cola de ancho son métricas robustas.

Los protocolos descritos aquí se han utilizado con éxito para caracterizar la función de los reguladores y efectores de Rho GTPasas pix-1, pak-1 y dejar-502 durante la elongación temprano

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Discusión

Este protocolo describe nuevas métricas para caracterizar principios y fases tardías de la elongación embrionario.

En la sección 1, el paso crítico es la posible presencia de bacterias en la plataforma. Los embriones se encierran herméticamente entre la almohadilla y el cubreobjetos durante la adquisición de imagen. Sellado de la corredera se requiere para evitar la desecación de los animales durante la adquisición que dura más de dos horas. Para nuestro conocimiento, ninguno de los sellador...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería (NSERC) de Canadá y la Fundación Canadiense para la Innovación. Gracias al Dr. Paul Mains (Universidad de Calgary, Calgary, Canadá) por la cepa let-502(sb118ts). Algunas de las cepas fueron proporcionadas por el Centro de Genética de Caenorhabditis, financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Agar  BioShopAGR001.500
Agarosa BioshopAGA001.500
CaCl2 (Cloruro de calcio)Bio Basic Inc.CT1330
ColesterolSigma-aldrichC8667
Solución de limpieza union Biometrica300-5072-000
Cubreobjetos de vidrioFisherbrand12-542B
Portaobjetos de vidrioFisherbrand12-552-3
Partículas de control de alta fluorescenciaunion Biometrica310-5071-001
K2HPO4 (fosfato de potasio, dibásico)Bio Basic Inc.PB0447
K2HPO4 (fosfato de potasio, monobásico)Bio Basic Inc.PB0445
MgSO4 (sulfato de magnesio)Sigma-aldrich230391
Na2HPO4( fosfato de sodio, dibásico)Bio Basic Inc.
NaCl (cloruro de sodio)Bio Basic Inc.DB0483
Goma de dibujo Pebeo 45  mlpé bé oPDG033000cualquier tienda de arte/manualidades
PeptoneBioShopPEP403.500
Amortiguador de fundaunión Biometrica300-5070-100
COPAS Biosortunión Biometrica
SDB0487

Referencias

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