Aquí detallamos protocolos específicamente diseñados para monitorear los defectos morfogénicos que ocurren durante las fases tempranas y tardías de la elongación embrionaria del nematodo Caenorhabditis elegans. En última instancia, estos protocolos están diseñados para identificar los genes que regulan estas fases y caracterizar sus requisitos diferenciales a lo largo del eje antero-posterior del embrión.
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Artículo de método
Las métricas para caracterizar nuevos embrionarias Alargamiento del nematodo
En este artículo
Resumen
Resumen
Diseccionar las vías de señalización que controlan la alteración de los procesos morfogénicos durante el desarrollo embrionario requiere métricas robustas y sensibles. La elongación embrionaria del nematodo Caenorhabditis elegans es una etapa tardía del desarrollo que consiste en la elongación del embrión a lo largo de su eje longitudinal. Esta etapa de desarrollo está controlada por la comunicación intercelular entre las células hipodérmicas y los músculos subyacentes de la pared corporal. Estos mecanismos de señalización controlan la morfología de las células hipodérmicas mediante la remodelación del citoesqueleto y las uniones célula-célula. La medición de la letalidad embrionaria y la detención del desarrollo en estadios larvarios, así como la alteración del citoesqueleto y de las estructuras de adhesión célula-célula en células hipodérmicas y musculares, son fenotipos clásicos que se han utilizado durante más de 25 años para diseccionar estas vías de señalización. Estudios recientes requirieron el desarrollo de nuevas métricas dirigidas específicamente a la elongación temprana o tardía y la caracterización de defectos morfogénicos a lo largo del eje antero-posterior del embrión. Aquí, proporcionamos protocolos detallados que permiten la medición precisa de la longitud y el ancho de los embriones en elongación, así como la longitud de las larvas sincronizadas. Estos métodos constituyen herramientas útiles para identificar los genes que controlan la elongación, para evaluar si estos genes controlan tanto las fases tempranas como las tardías de esta etapa y son necesarios de manera uniforme a lo largo del eje antero-posterior del embrión.
Introducción
Durante casi 50 años los nematodo Caenorhabditis elegans se estableció como un poderoso modelo para estudiar cuestiones importantes en el desarrollo, la neurobiología, la evolución, las interacciones huésped-patógeno, etc. 1 La fuerza de este modelo en el estudio del desarrollo radica en: su ciclo de vida corta de 3 días; la facilidad con que estos animales pueden ser alterados genéticamente; su transparencia que permite la observación de los desplazamientos y la morfología celular en los animales vivos y su desarrollo que es en su mayoría extrauterino. Las etapas de desarrollo del nematodo implican la embriogénesis y cuatro etapas de lar....
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Protocolo
1. Caracterización de defectos de elongación tempranos en WT y mutantes Animales
- Los embriones de montaje para Normarski DIC Microscopía
- Preparar los siguientes medios de cultivo y el material:
- M9 Buffer, se disuelven 12,8 g / L de Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 3 g / L KH 2 PO 4, 5 g / L de NaCl, 0,25 g / L MgSO 4 • 7H 2 O en agua destilada y autoclave para esterilizar.
- NGM placas, se disuelven 3 g / l de NaCl, 16 g / l de agar, 2,5 g / L de bactopeptona en ddH2O Autoclave y añadir 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl 2,
- Preparar los siguientes medios de cultivo y el material:
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Resultados
Partida, con maletero y Jefe / Relación de la cola de ancho son métricas robustas.
Los protocolos descritos aquí se han utilizado con éxito para caracterizar la función de los reguladores y efectores de Rho GTPasas pix-1, pak-1 y dejar-502 durante la elongación temprano
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Discusión
Este protocolo describe nuevas métricas para caracterizar principios y fases tardías de la elongación embrionario.
En la sección 1, el paso crítico es la posible presencia de bacterias en la plataforma. Los embriones se encierran herméticamente entre la almohadilla y el cubreobjetos durante la adquisición de imagen. Sellado de la corredera se requiere para evitar la desecación de los animales durante la adquisición que dura más de dos horas. Para nuestro conocimiento, ninguno de los sellador.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería (NSERC) de Canadá y la Fundación Canadiense para la Innovación. Gracias al Dr. Paul Mains (Universidad de Calgary, Calgary, Canadá) por la cepa let-502(sb118ts). Algunas de las cepas fueron proporcionadas por el Centro de Genética de Caenorhabditis, financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarosa Bioshop | AGA001.500 | ||
| CaCl2 (Cloruro de calcio) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Colesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| Solución de limpieza | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| Cubreobjetos de vidrio | Fisherbrand | 12-542B | |
| Portaobjetos de vidrio | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| Partículas de control de alta fluorescencia | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (fosfato de potasio, dibásico) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| K2HPO4 (fosfato de potasio, monobásico) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (sulfato de magnesio) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( fosfato de sodio, dibásico) | Bio Basic Inc. | ||
| NaCl (cloruro de sodio) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Goma de dibujo Pebeo 45 ml | pé bé o | PDG033000 | cualquier tienda de arte/manualidades |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Amortiguador de funda | unión Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | unión Biometrica |
Referencias
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 387-407 (2015).
- Priess, J. R., Hirsh, D. I. Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elong....
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Reimpresiones y permisos
