Artículo de método

Gradiente de tensión Chip para estimulantes comportamientos celulares en hidrogel cargadas de celulares

DOI:

10.3791/53715

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8 de agosto de 2017

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1Institute of NanoEngineering and MicroSystems, National Tsing Hua University, 2Department of Engineering and System, National Tsing Hua University

En este artículo

Resumen

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Este artículo presenta un enfoque simple para proporcionar cepas estática gradiente discontinua en un hidrogel celular cargado concéntrico regular alineación de celda para ingeniería de tejidos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Orientación artificial para alineación celular es un tema candente en el campo de la ingeniería de tejidos. La mayoría de la investigación anterior ha investigado solo alineación celular inducida por la cepa en un hidrogel cargadas de célula mediante complejos procesos experimentales y sistemas de control de masas, que se asocian generalmente a problemas de contaminación. Así, en este artículo, proponemos un enfoque simple para construir una gradiente tensión estática usando un chip neumático con una cubierta plástica de PDMS y un sustrato de vidrio transparente UV para la estimulación del comportamiento celular en un hidrogel 3D. Prepolímero de células foto-patternable sobrecarga en la cámara de neumático puede generar una membrana PDMS curva convexa en la cubierta. Después de la reticulación UV, a través de un micropattern circular concéntrica bajo la membrana PDMS curvada y tampón de lavado, un microambiente para la investigación de la célula comportamientos bajo una variedad de cepas degradadas es uno establecido en un único chip fluídico, sin instrumentos externos. Células NIH3T3 fueron demostradas después de observar el cambio en la tendencia de alineación celular bajo dirección de geometría, en cooperación con el estímulo de la cepa, que varió de 15-65% de los hidrogeles. Después de una incubación de 3 días, la geometría de hidrogel había dominado la alineación celular bajo tensión compresiva baja, donde las células alineación a lo largo de la dirección de alargamiento de hidrogel bajo alta tensión a la compresión. Entre éstos, las células demostraron alineación al azar debido a la disipación de la radical orientación de elongación de hidrogel y la orientación de la geometría del hidrogel con dibujos.

Introducción

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Servir como un material del bloque que imita un microambiente nativo, un hidrogel que contiene la matriz extracelular (ECM) puede reconstruir biomiméticos tejido andamios para apoyar el crecimiento de la célula. Poseer las funciones de un tejido, alineación de celda organizado es un requisito esencial. Varios 2D (es decir, las células cultivadas en una superficie) y 3D (es decir, las células encapsuladas en un hidrogel) alineaciones de celda se han obtenido por cultivo o encapsular las células o en substratos flexibles con micro- o nano-patrones1. Alineación 3D celular en microarquitectura es más atractiva, como el microambiente está más cercano del tejido propio constructo2,3,4. Un enfoque común para la alineación celular 3D es la localización geométrica de hidrogel forma2,3. Debido al espacio restringido para la proliferación celular en la dirección de eje corto, células objetivo alinear a lo largo de la dirección de eje largo en un hidrogel de micro-patrón. Otro enfoque es aplicar stretch extensible a los hidrogeles para lograr alineación de celdas paralela a la dirección de estiramiento4,5.

Estimulación biofísica en hidrogeles de ECM, como la tensión compresiva o un campo eléctrico, puede regular funciones celulares para la integración adecuada del tejido, proliferación y diferenciación1,2,3. Mucha investigación se ha realizado para investigar el comportamiento celular mediante la aplicación de una condición de tensión a la vez utilizando múltiples control mecánico unidades4,6,7,8,9. Por ejemplo, el uso de motores paso a paso mecánica apretado o estirado en un hidrogel de colágeno de células encapsuladas 3D ha sido un común enfoque7,10. Sin embargo, dicho equipo de control requiere un espacio extra y enfrenta el problema de la contaminación en la incubadora9,7,11,12. Además, el instrumento grande no puede dar un ambiente de control preciso para proporcionar alta reproducibilidad13.

Teniendo en cuenta que hidrogeles cargados de celular se emplean generalmente en la escala micro para aplicaciones biomédicas, es ventajoso combinar técnicas de MEMS para generar un rango de tensión/estiramiento del estímulo a investigar simultáneamente el comportamiento celular en 3D biomiméticos construcciones en vitro2,14,15,16,17,18. Por ejemplo, usando la presión del gas a deformar la membrana PDMS en chips de microfluídica puede dar lugar a varias cepas, conduce la diferenciación celular a diferentes linajes9,16. Sin embargo, hay muchos desafíos técnicos, tales como procesos de fabricación de chips complicados en un cuarto limpio y la integración de software control de motores, bombas, válvulas y gases comprimidos.

En este trabajo, demostramos un enfoque simple para obtener un chip de microfluidos gradiente de tensión estática autosostenible mediante el empleo de un patrón de hidrogel circulares concéntricos y una membrana flexible de PDMS. A diferencia de la mayoría de los enfoques existentes, nuestra plataforma es un dispositivo miniatura portátil y desechable que puede ser fabricado fuera de un salón amarillo y que posee uno mismo-generar tensiones degradadas concéntricos hidrogeles encapsulado en celular, sin equipos mecánicos externos durante la incubación. Comportamientos de células de fibroblastos 3T3 influenciado por una combinación de forma de hidrogel y una variedad de señales de orientación elástico resistencia a la tracción fueron demostrados durante la observación de la alineación celular dentro de entornos 3D ECM-mimético en el chip de gradiente de presión durante 3 días.

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Protocolo

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1. Síntesis de GelMA

  1. Pesar 10 g de gelatina en polvo y añadirla a un matraz de vidrio con 100 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco. Coloque una barra de agitación magnética en el matraz y coloque el matraz en una placa caliente de agitación.
  2. Cubra el matraz con papel de aluminio para evitar la evaporación del agua. Ajuste la temperatura de la placa caliente a 50-60 °C y el agitador a 100 rpm durante 1 h para disolver bien la gelatina en polvo.
  3. Una vez que la gelatina se haya disuelto, agregue 8 mL de anhídrido metacrílico muy lentamente (una gota por segundo) con una pipeta. Déjalo reaccionar a 60 °C durante 3 h.
  4. Añada DPBS precalentado (40 °C) al matraz hasta un volumen final de 500 ml y deje que esta mezcla se mezcle bien durante 15 minutos para detener la reacción.
  5. Mientras tanto, corte una membrana de diálisis (peso molecular de corte de 14 kDa) en varios tubos de 25 cm de largo. Sumérjalos en agua desionizada (DI) durante 15 minutos y haga un nudo para cerrar un extremo de los tubos de diálisis.
  6. Cargue la cantidad adecuada (30 a 60 ml) de la solución polimérica en los tubos de diálisis y cierre el otro extremo. Colócalos en un vaso de plástico de 5 litros con agua desionizada durante una semana. Renueve el agua desionizada dos veces al día y mantenga la solución a 40 - 50 °C durante el proceso de diálisis.
  7. Recoja la solución del tubo en un frasco de vidrio de 500 ml. Vierta ~ 450 - 500 mL de solución en un vaso de filtro de 500 mL (tamaño de poro de 0,22 μm) y aplique un vacío al vaso de filtro para forzar que la solución pase a través de la membrana del filtro para la esterilización.
  8. Transfiera el polímero esterilizado a varios tubos esterilizados de 50 ml y guárdelos en un congelador a -80 °C durante 3 a 5 días.
  9. Liofilizar el polímero a -80 °C durante 1 semana con un liofilizador para formar GelMA. Almacene el GelMA en un congelador a -80 °C.

2. Modificación del metacrilato de 3-(trimetoxisilil)propilo (TMSPMA)

  1. Corte los portaobjetos de vidrio comercial en dos piezas pequeñas (25 mm x 37,5 mm) y sumérjalos en una solución de NaOH 0,5 M durante 4 h. Lave los portaobjetos con una gran cantidad de agua desionizada.
  2. Coloque el portaobjetos en una rejilla dentro de un recipiente de vidrio con etanol al 95% y límpielo con un ultrasonido a 43 kHz durante 15 min. Seque al aire el portaobjetos.
  3. Sumerja los portaobjetos de vidrio en TMSPMA al 5% en etanol al 99,5% durante 1 h.
  4. Lave los portaobjetos con etanol al 95%, seque al aire y recoca el recubrimiento de TMSPMA en un horno a 80 °C durante 2 h.

3. Fabricación de chips

  1. Tome una placa de polimetilmetacrilato (PMMA) de 2 mm y otra de 0,3 mm de grosor, aplique cinta adhesiva de doble cara en un lado de la superficie de PMMA y suelte el revestimiento en un lado. Deje dos placas de PMMA de 2 mm de grosor y una placa de 1 mm de grosor sin cinta adhesiva de doble cara.
  2. Corte con láser una placa de PMMA de 2 mm de espesor sin cinta adhesiva de doble cara a 42 mm x 30 mm para hacer la placa inferior. Corta una placa de PMMA de 2 mm de espesor con cinta adhesiva de doble cara para hacer el marco delimitador, con unas dimensiones exteriores de 42 mm x 30 mm y unas dimensiones interiores de 37,5 mm x 25 mm.
  3. Corte con láser la placa de PMMA de 0,3 mm de espesor con cinta adhesiva de doble cara en un círculo central de 12 mm con dos canales de flujo de 2 mm de ancho y 8 mm de largo en lados opuestos del círculo (Figura 1a).
  4. Para preparar el molde de PMMA para fundir la cubierta de PDMS, ensamble las tres piezas de componentes de PMMA de los pasos 3.2-3.3 (Figura 1b) utilizando cinta adhesiva de doble cara.
  5. Corte con láser una placa de PMMA de 2 mm de espesor con cinta adhesiva de doble cara en una pieza de 5 cm x 5 cm con una matriz de 3 x 3 de rectángulos huecos de 8,5 mm x 8,5 mm. Corta otra pieza de 5 cm x 5 cm con una matriz de círculos huecos de 4 mm de 3 x 3. Corte con láser una placa de PMMA de 1 mm de espesor sin cinta adhesiva de doble cara en una placa inferior de PMMA de 5 cm x 5 cm.
  6. Prepare el molde de PMMA para fundir el tapón de PDMS ensamblando las tres piezas de componentes de PMMA del paso 3.5 (Figura 1c) utilizando cinta adhesiva de doble cara.
  7. Prepare la cubierta y el tapón de PDMS mezclando adecuadamente 30 g de elastómero de PDMS y 3 g de agente de curado de PDMS; desgasifique la mezcla en una cámara de vacío durante 1 h.
  8. Vierta 1,8-2,0 g de la mezcla en el molde de PMMA para la cubierta de PDMS y use la cantidad adecuada para llenar cada cavidad del molde de PMMA para el tapón de PDMS. Mezcle 10 g de mezcla de PDMS sin curar en un plato de plástico de 10 cm en blanco. Coloque estos moldes en una cámara de vacío para desgasificar durante 30 min.
  9. Cura el PDMS durante 2 h a 80 °C. Después de enfriar el PDMS curado en el molde, separe las cubiertas del PDMS y los tapones del PDMS de los moldes de PMMA.
  10. Perfore dos orificios con diámetros de aproximadamente 3 mm en los extremos de los canales de flujo de las cubiertas PDMS.
  11. Corta la lámina de PDMS moldeada a partir de la placa de plástico de 10 cm en muchos cubos de 1 cm x 1 cm y haz un agujero de 3 mm en cada cubo de PDMS. Pegue dos cubos de PDMS de 1 cm x 1 cm sin curar en las aberturas de la cubierta de PDMS (para que sirvan como depósitos medios y para ayudar en el proceso de curado de los patrones de hidrogel circular degradado) y cure durante 1 h a 80 °C.
  12. Pega las cubiertas de PDMS con los dos depósitos de PDMS en un portaobjetos recubierto de TMSPMA mediante el tratamiento previo del lado de unión de la cubierta de PDMS y el portaobjetos recubierto de TMSPMA bajo una máquina de plasma de oxígeno (30 W de potencia de RF (modo alto) y 600 mTorr de aire comprimido) o un generador de corona electrónico de alta frecuencia (115 V, 50/60 Hz, 0,35 A) durante 90 s de tratamiento con plasma deO2.
  13. Póngase en contacto con la superficie tratada con plasma de las cubiertas de PDMS y el portaobjetos TMSPMA y presiónelos estrechamente para una unión permanente a través de la formación de un enlace Si-O-Si.
    NOTA: Colocar el chip en un horno a 80 °C durante 1 h puede mejorar aún más la fuerza de unión.
  14. Después de enfriar, sumerja las virutas en etanol al 95% durante 15 minutos y séquelas al aire. A continuación, esteriliza las virutas bajo irradiación UV durante 1 h y guárdalas en una caja envuelta en papel de aluminio en la cubierta laminar.

4. Deformación de gradiente estático en el hidrogel cargado de células

  1. Imprima y corte un trozo de fotomascarilla, de 25 mm x 37,5 mm de tamaño, imprimiendo el diseño en Figure 2b en una película transparente. Ajuste el tamaño impreso de Figura 2b para que coincida con la dimensión en Figura 2a.
  2. Prepare 100 mL de medio DMEM con 10% de FBS, 1% de Pen-Strep y 250 mL de DPBS en un baño de agua a 37 °C para usar como medio de cultivo celular.
  3. Pesar 25 mg de GelMA liofilizado en 0,3 mL de medio de cultivo celular precalentado (37 °C) en un tubo de microcentrífuga negra de 1,5 mL. Coloque el tubo de microcentrífuga en un agitador/placa calefactora de laboratorio hasta que el GelMA se disuelva en el medio.
  4. Pesar 50 mg de fotoiniciador en 1 ml de DPBS en un tubo de microcentrífuga y colocarlo en un horno a 80 °C durante 15 min o hasta que el fotoiniciador se haya disuelto.
  5. Tome 25 μL del fotoiniciador al 10% del paso 4.4 y añádalo al tubo de microcentrífuga del paso 4.3. Pipetear varias veces para mezclar bien.
  6. Cuente 3 x 106 células NIH 3T3 utilizando un contador de células automatizado. Centrifugar la suspensión a 200 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante y volver a suspender las células en 175 μL de medio de cultivo celular.
  7. Agregue la solución celular del paso 4.6 al tubo de microcentrífuga del paso 4.5 para obtener una solución celular de prepolímero de 5% de GelMA, 0.5% de fotoiniciador y ~ 6 x 106 3T3 celdas / mL. Después de mezclar, cargue 100 μL de prepolímero celular en una microjeringa de 100 μL.
  8. Alinee manualmente (ver Figura 3a) una pieza de la fotomáscara en la corredera inferior del chip de deformación de gradiente esterilizado y simplemente fije la posición usando una pequeña gota de agua desionizada en el medio. Conecte la microjeringa de 100 μL cargada con solución de celda de prepolímero a la entrada del chip.
  9. Coloque (ver Figura 3b) 50 μL de solución de celda de prepolímero en el canal de flujo usando la micro-jeringa y luego conecte la salida usando un enchufe PDMS. Inyecte 40 μL adicionales de solución para crear una protuberancia convexa en la membrana circular de PDMS.
  10. Mueva el chip con la fotomáscara (abajo), la microjeringa (entrada) y el enchufe PDMS (salida) desde el paso 4.9 bajo una lámpara UV (365 nm, 9 mW/cm2) y expóngalo durante 30 a 45 s para reticular el hidrogel circular concéntrico en la cámara de fluidos.
  11. Retire el tapón del PDMS y la microjeringa para liberar la presión del líquido (consulte Figura 3c). Utilice una jeringa de 1 ml cargada con DPBS precalentado para lavar las resinas no reticuladas 3 veces enjuagándolas desde la entrada hasta la salida.
  12. Llene el canal de flujo con unos 100 μL de medio de cultivo celular.
  13. Coloque el chip en una placa de cultivo esterilizada y el cultivo en una atmósfera de 5% deCO2 a 37 °C durante una semana. Refresca el medio todos los días.
  14. Toma de imágenes de tres chips el día 0 después de 4 h de incubación, como grupo de control, y tres chips el día 3, como conjunto experimental, utilizando un microscopio con un objetivo 20X. Mida el ancho de línea de cada hidrogel desde la línea 1 hasta la línea 12 utilizando un software (por ejemplo, ImageJ) para calcular las deformaciones de compresión ( Figura 4).
    NOTA: El porcentaje de elongación se calcula dividiendo el valor de la diferencia de ancho de línea entre 40 μL y 0 μL por el ancho de línea a 40 μL.

5. Tinción celular para el análisis de alineación

  1. Utilice una jeringa para inyectar paraformaldehído (PFA) al 4% en DPBS en RT en el chip de flujo durante 15 minutos para la fijación del hidrogel cargado de células.
    NOTA: Precaución. El PFA es tóxico y debe manipularse con cuidado.
  2. Reemplace la solución con una solución permeante de membrana celular al 0,5% en DPBS durante 10 minutos para permeabilizar la membrana celular en RT.
  3. PBS lave las muestras 3 veces con un intervalo de 5 a 10 minutos entre lavados (usando una jeringa cargada, como en el paso 5.1).
  4. Cargue la solución de BSA al 1% en el canal fluídico durante 45-60 min en RT (usando una jeringa cargada a través del puerto de entrada).
  5. Añada 1,5 mL de metanol en el vial con faloidina Alexa Fluor 488 para obtener una concentración final de 6,6 μM de solución madre.
  6. Tome 5 μL de faloidina Alexa Fluor 488 del paso 5.5 y dilúyalo en 200 μL de DPBS con 0.1% BSA para formar una concentración final de 0.165 μM Alexa Fluor 488 faloidina.
  7. Añadir 200 μL de la solución de la mezcla al canal fluídico con una micropipeta e incubar el chip a 37 °C durante 45 - 60 min para la tinción con actina. PBS lavar (como se indicó anteriormente) las muestras 3 veces.
  8. Prepare 1 μg/mL de DAPI en PBS, hágalo fluir a través del chip y tiña los núcleos celulares a 37 °C durante 5 min.
  9. Pipetee DPBS en el canal fluídico para lavar la solución de tinción y vuelva a llenar la cámara fluídica con solución de PBS para tomar imágenes con un microscopio de fluorescencia.
  10. Capture las imágenes fluorescentes de las células 3T3 en los hidrogeles utilizando un microscopio de fluorescencia invertida con un aumento de 40X con un detector CCD y conjuntos de filtros ex/em a 488/520 nm y 358/461 nm para Alexa Fluor 488 faloidina (actina) y DAPI (núcleo), respectivamente.

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Resultados

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Para comparar las variaciones mecánicas entre cada hidrogel circular en el chip de estimulación completa tensión degradado, medimos el ancho de línea de cada hidrogel circular en dos de las virutas del mismo, con los volúmenes de inyección de 0 μL (figura 4a) y 40 μl (Figura 4b), respectivamente. El alargamiento porcentual en cada círculo se calcularon dividiendo el alargamiento en el chip 40 μl inyectado por las anchuras de líne...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este papel, Divulgamos sobre un enfoque simple para comparar comportamiento de alineación de celda después de hidrogel forma orientación y tramo extensible. Una membrana PDMS flexible crea una curvatura en forma de cúpula para generar diferentes alturas de hidrogeles circulares concéntricos. Después de soltar la presión, la membrana PDMS automáticamente aplica fuerza a los hidrogeles micro-patrón para formar el gradiente tensión/alargamiento, con un máximo en el centro y un mínimo en el límite exterior. Como la formac...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este proyecto fue apoyado por el graduado estudiante de estudio al exterior programa (NSC-101-2917-I-007-010); el programa de Ingeniería Biomédica (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); y el programa nacional de nanotecnología (NSC-101-2120-M-007-001-), Consejo Nacional de ciencia de R.O.C., Taiwán. Los autores desean agradecer a Prof. Ali Khademhosseini, Gulden Camci-Unal, Arghya Paul y Ronglih Liao en Harvard Medical School para compartir la tecnología de encapsulación de hidrogel y de la célula.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de microcentrífuga negro de 1,5 mLArgos Technologies 03-391-161Este puede ser reemplazado por un tubo de color neutro de 1.5 mL cubierto con papel de aluminio
10x DPBSSigma-Aldrich56064C
Alexa Fluor 488 faloidina InvitrogenA12379 
BSASigmaA1595
Sonda molecularde calceínaC1430Para el etiquetado de células viables
CCDPCO. ImagenPixelfly qe
Solución permeable de membrana celularSigma-AldrichX1000.5% Triton X-100 para permear membrana celular
DAPISigma-AldrichD8417Tinción de núcleo celular
Membrana de diálisisSigma-AldrichD9527Corte de peso molecular = 14.000
DMEMGibco11995-065
Cinta adhesiva de doble cara3M8003
FBSHycloneSH30071.03
GelatinaSigma-AldrichG2500fuerza de gel 300, tipo A, de piel porcina Generador electrónico de
corona de alta frecuenciaProductos electrotécnicosMODELO BD-20
Anhídrido metacrílicoSigma-Aldrich276685
Micro jeringaHamilton8050150 μ L 
MicroscopioOlympusIX71Incluye dos juegos de filtros: LF405/LP-B-000 y LF488/LP-C-000 de Semrock
Máquina de plasma de oxígenoHarrick plasmaPDC-001
ParaformaldehídoSigma-AldrichP6148Para la fijación de la célula
PDMSDOW CORNINGSylgard 184Mezcla para la fabricación de moldeo de chips PDMS
Pen-StrepGibco10378-016penicilina/estreptomicina
FotoiniciadorCIBAIrgacure 2959
Yoduro de propidioSigma-AldrichP4170Para el etiquetado de células muertas
Vaso de filtraciónestéril MilliporeSCGPT05RE
TMSPMASigma-Aldrich440159Para la inmovilización de hidrogel
UltrasonidoDeltaD150H150W, 43kHz
luz ultravioletaDAIHANWUV-L10
liofilizadorFIRSTEK150311025
NIH3T3 (fibroblasto)Instituto de Investigación y Desarrollo de la Industria Alimentaria (FIRDI)08C0011
MOXI Z Mini Contador de Células AutomatizadoORFLOMXZ001

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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