Este protocolo describe un ensayo de alto rendimiento para probar las preferencias de puesta de huevos de Drosophila melanogaster a una resolución de un solo animal. Este ensayo proporciona una plataforma simple, eficiente y escalable para identificar genes y componentes de circuitos que controlan un proceso de toma de decisiones simple.
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Artículo de método
Ensayo de Alto Rendimiento para el Examen de Preferencias de la puesta de huevos individual
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Resumen
Resumen
Recientemente, la preferencia de la puesta de huevos de Drosophila se ha convertido en un modelo manejable de forma genética para estudiar la base neural de los procesos de toma de decisiones simples. Cuando la selección de sitios para depositar sus huevos, las moscas hembras son capaces de clasificar el atractivo relativo de sus opciones y elegir el "mayor de dos bienes." Sin embargo, la mayoría de los ensayos de preferencia que ponen huevos no son prácticos si se quiere adoptar un enfoque sistemático para la detección genética buscar la base de circuito que subyace a este sencillo proceso de toma de decisiones, ya que son laboriosos y configurar basado en la población. Para aumentar el rendimiento de estudiar las preferencias puesta de huevos de las hembras individuales, desarrollamos cámaras personalizadas que cada uno puede al mismo tiempo de ensayo preferencias de la puesta de huevos de hasta treinta individuo moscas, así como un protocolo que asegura cada mujer tiene una alta tasa de puesta de huevos (de modo que su preferencia es fácilmente discernible y más convincente). Nuestro enfoque es sencillo de ejecutary produce resultados muy coherentes. Además, estas cámaras pueden equiparse con diferentes accesorios para permitir la grabación de vídeo a los animales ovíparos y para suministrar luz para los estudios de la optogenética. Este artículo proporciona los planos para la fabricación de estas cámaras y el procedimiento para la preparación de las moscas para ser ensayadas en estas cámaras.
Introducción
Drosophila melanogaster es un poderoso organismo modelo genético para estudiar las bases neuronales de los comportamientos. El rápido desarrollo de herramientas genéticas para manipular las neuronas de manera dirigida y la aparición de sofisticadas herramientas de análisis conductual han mejorado significativamente nuestra capacidad para diseccionar los mecanismos de los circuitos que subyacen a los procesos de transformación sensorio-motora de varios comportamientos innatos y aprendidos.
La puesta de huevos de Drosophila es un modelo adecuado para estudiar las bases neuronales de procesos simples de toma de decisiones. En particular, se ha demostrado que las hembras de Drosophila poseen la capacidad de comparar y clasificar sus opciones antes de "comprometerse" a depositar un huevo en una opción dada4-8. Por ejemplo, cuando se les da solo un sustrato simple (sin sacarosa) o solo un sustrato que contiene sacarosa, las hembras aceptan fácilmente cualquiera de las opciones para la puesta de huevos. Sin embargo, cuando se les presentan ambas opciones, las hembras rechazan robustamente el sustrato de sacarosa en algunos contextos7,9,10. Sin embargo, se sabe relativamente poco sobre los mecanismos neuronales que permiten a las hembras "elegir el mayor de dos bienes". Un obstáculo importante ha sido la falta de un método eficiente para evaluar las preferencias de puesta de huevos, de modo que se pueda utilizar un enfoque sistemático de detección genética para estudiar este problema.
En este informe, describimos el protocolo que desarrollamos que permite analizar las preferencias de puesta de huevos de las hembras con una resolución de un solo animal y con un rendimiento y consistencia sustancialmente mejorados en comparación con los métodos anteriores. Específicamente, proporcionamos los planos para construir las cámaras que diseñamos, el protocolo para preparar a las hembras para que cada una esté preparada para poner muchos huevos y el protocolo para usar las cámaras.
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Protocolo
1. Preparación de moscas a ensayar
- Cultura vuela de melaza estándar / media de harina de maíz en incubadora a 25 ° C y 65% de humedad. Tenga cuidado de no saturar los viales. Por ejemplo, poner 8 mujeres y 6 hombres en un vial de alimentos estrecho.
Nota: El "estrecho vial comida" usado aquí tiene un diámetro interior de 2,3 cm. Nosotros generalmente pueden obtenerse unos 10 ml de alimentos mosca en cada vial. La receta de comida mosca hemos utilizado se describe aquí: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html. - 2 - 3 días después de la eclosión hembras, preparar viales con pasta de levadura fresca como se muestra en la Figura 1E. Hacer pasta de levadura fresca mediante la mezcla de 6 g de levadura activa con 10 ml de ácido propiónico 0,5%. Utilice una espátula para aplicar la pasta de levadura sobre la pared lateral de los viales de alimentos. Recoger 30 - 35 hembras eclosed junto con 20 - 25 machos en los viales.
- En general, recoger los machos de las mismas viales donde se recogen las hembras(Con el fin de ahorrar tiempo y esfuerzo). Sin embargo, si hay preocupación acerca de la fertilidad de los machos, machos WT utilizar en su lugar. Además, la pasta de levadura es importante para estimular la producción de huevos, por lo tanto prepararlo fresco todos los días.
- Mantener las hembras / machos recolectados a 25 ° C, 65% de humedad, a menos que las moscas son sensibles a la temperatura.
- Después de ~ 4 - 5 días, consulte los viales para ver si las hembras están listas para experimentos que ponen huevos. Están listos cuando la superficie del medio de comida es mojado de larvas madriguera activamente en la comida (véase la Figura 1E - F).
Nota: Las hembras normalmente retienen poner huevos una vez que la superficie del alimento se humedece y se arrastra con larvas. Este paso asegura que las mujeres estarían dispuestas a poner muchos huevos cuando se encuentran con sustratos con textura deseada (por ejemplo., ~ 1% de agarosa).
2. Cámara de la Construcción, montaje, instalación de Ensayo
- Tener un taller mecánico construir cámaras de la puesta de huevos de acrílico (Fifigura 1A - D). El dibujo de ingeniería de diferentes piezas se muestra en la Figura 1 complementario -. 3 imágenes de alta resolución también se pueden encontrar aquí (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Inserte láminas de plástico en la carga (arriba) pieza de la cámara como se muestra en la Figura 1C. Esto sirve como la superficie inferior de carga, mientras que vuela en los ámbitos individuales que ponen huevos.
- Anestesiar a las hembras en un cojín de CO 2 y cargarlos individualmente en cada campo de la puesta de huevos. Permitir ~ 30 minutos para que las moscas se recuperan de las emisiones de CO 2 y se aclimate al nuevo entorno.
- Preparar los sustratos de agarosa.
- Para mayor comodidad, tenga una botella de prefabricados de fundido de agarosa al 1% en un baño de agua a 55 ° C.
- Añadir la cantidad deseada de solución de sacarosa (2 M) en un tubo cónico de 50 ml y se mezcla con la cantidad apropiada de agarosa. Por ejemplo, para preparar el 150 mM sustrato sacarosa, place 750 l de solución 2 M de sacarosa en el tubo y luego llenar el tubo con agarosa para la marca de 10 ml.
- Preparar el sustrato liso de la misma manera pero añadir agua destilada en lugar de solución de sacarosa.
Nota: La concentración final de agarosa en este protocolo es ligeramente menor que 1%. En nuestra experiencia, la concentración exacta de agarosa no importa con tal de que se controla para estar dentro de ~ 0,9 a 1,1% y que los dos sustratos son de la misma concentración de agarosa.
- Tomar la pieza de sustrato (parte inferior) de la cámara y la pipeta 1.000 l de sustrato de agarosa en cada cubeta como se ve en la Figura 1D.
- Permitir agarosa para solidificar durante ~ 30 min.
- Una vez que los sustratos de agarosa y las moscas están listos, el montaje de las tres piezas de la cámara de la puesta de huevos y luego sacar las láminas de plástico.
- Colocar las cámaras en las incubadoras de moscas.
Nota: La longitud de los experimentos que ponen huevos puede variar dependiendo de experimentales necesidades. normalmente se corre el experimento S / N (14 - 16 h). Además, no se observó efecto significativo de tiempo circadiano de las preferencias de la puesta de huevos. - Anestesiar a las hembras mediante la inyección de CO 2 en la cámara. Desmonte la cámara, desechar las moscas anestesiadas en la morgue mosca (es decir., Una lata vacía de café llena con un poco de aceite de maíz). Tome fotografías de los resultados de gestión de registros (véase la Figura 2).
- Contar el número de huevos de forma manual y calcular los índices de preferencia para su análisis. Calcular el índice de preferencia como (N a - N b) / (N + un N b) donde N A y N b representan el número de huevos en el sitio de un sitio vs. b, respectivamente.
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Resultados
Las cámaras de la puesta de huevos se componen de varias piezas: una pieza de sustrato (parte inferior), una pieza divisora (centro), una pieza de carga (parte superior), y 2 puertas correderas (Figura 1 A - D). Estas piezas se utilizan para moscas de forma independiente de configuración y los sustratos antes de los experimentos que ponen huevos. Figura 1F muestra cómo viales deben buscar cuando las moscas hembras están listas para la puesta de huevos....
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Discusión
Las cámaras y los protocolos descritos aquí tienen varias mejoras con respecto a los ensayos de la puesta de huevos anteriores. En primer lugar, que aumentan el rendimiento del ensayo de las preferencias de los animales individuales de manera significativa. Cada cámara puede ensayar 30 hembras individuales y se tarda menos de una hora de configurar. En segundo lugar, aumentan la consistencia de las preferencias de la puesta de huevos respecto a los métodos anteriores. La estandarización de las dimensiones de la arena, e...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a la Tienda de Física de Duke, especialmente a Phil Lewis, por ayudarnos a construir el aparato de comportamiento y los accesorios y crear el dibujo. Este trabajo está financiado por los Institutos Nacionales de Salud bajo el premio número R01GM100027.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agarosa ultrapura | Invitrogen | 16500-500 | |
| Sacarosa | Sigma | S0389 | |
| Baño de agua | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema webcam | Microsoft | H5D-00013 | |
| LEDs rojos | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| Cámaras de puesta de huevos Soportes de | hechos a medida | ||
| Soportes de LED | medida | ||
| Genesee | 32-116 a.C |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
