HSV mediada por la expresión transgénica de constructos quiméricos para estudiar la función del comportamiento de los GPCR heterómeros en ratones

Summary

En este artículo se describe cómo inyectar vectores virales en la corteza frontal del ratón para probar los ensayos de comportamiento que requieren la formación heteromérica GPCR.

Abstract

El complejo receptor heteromérico entre 5-HT_2A y mGlu2 ha sido implicado en algunos de los fenotipos conductuales en modelos murinos de psicosis^1,2. En consecuencia, la investigación de los detalles estructurales de la interacción entre 5-HT_2A y mGlu2 que afecta a los comportamientos relacionados con la esquizofrenia representa una poderosa herramienta de traducción. Como se ha demostrado anteriormente, la respuesta de espasmos de la cabeza (HTR) en ratones es provocada por drogas alucinógenas y esta respuesta conductual está ausente en los ratones 5-HT_2A knockout (KO)^3,4. Además, al expresar condicionalmente el receptor 5-HT_2A solo en la corteza, se demostró que las vías de señalización dependientes del receptor 5-HT_2A en las neuronas piramidales corticales son suficientes para provocar un comportamiento de contracción de la cabeza en respuesta a drogas alucinógenas³. Por último, se ha demostrado que la respuesta conductual de espasmos craneales inducida por los alucinógenos DOI y dietilamida del ácido lisérgico (LSD) disminuye significativamente en ratones mGlu2-KO⁵. Estos hallazgos sugieren que mGlu2 es, al menos en parte, necesaria para los efectos conductuales similares a los de la psicosis dependientes del receptor 5-HT_2A inducidos por drogas similares al LSD. Sin embargo, esto no proporciona evidencia sobre si el complejo receptor 5-HT_2A-mGlu2 es necesario para este fenotipo de comportamiento. Para abordar esta pregunta, se utilizaron construcciones del virus del herpes simple (VHS) para expresar mGlu2 o mGlu2ΔTM4N (construcción quimérica mGlu2/mGlu3 que no forma el complejo receptor 5-HT_2A-mGlu2) en la corteza frontal de ratones mGlu2-KO para examinar si este complejo heteromérico GPCR es necesario para los efectos conductuales inducidos por las drogas similares al LSD⁶.

Introduction

Alucinógenos, como el LSD, psilocibina y la mescalina causan cambios significativos en la conciencia humana, cognición y la emoción ^7-9. La inactivación de la señalización del receptor de serotonina 5-HT _2A mediante enfoques ya sea genéticos o farmacológicos hace que atenuó marcadamente las respuestas de comportamiento a los alucinógenos, tanto en modelos de roedores y seres humanos ^{3,10 11.} A pesar de los alucinógenos se unen otros subtipos de receptores ^8, el receptor 5-HT _2A se considera necesario para la actividad de comportamiento único de estos productos químicos.

II ....

Protocol

NOTA: Todos los procedimientos para la cría de animales y de los cuidados se llevaron a cabo de acuerdo con el Reglamento del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Escuela de Medicina de Icahn en el Monte Sinaí. Asegúrese de usar guantes estériles durante todo el procedimiento.

1. Drogas y Preparación Virus

1. Preparación de drogas
   1. Preparar 15,0 ml de ketamina / xilazina anestésico por disolución de 1,35 ml de 100 mg / ml de ketamina y 0,75 ml de 20 mg / ml de xilazina en 12,9 ml de 0,9% de solución salina. Mezclar bien la solución.
2. Preparación Virus
   1. Clon....

Results

Resultados anteriores demuestran que la cabeza de contracción-respuesta conductual murino está provocada de forma fiable y robusta por alucinógenos, y es ausente en 5-HT _2A ratones -kō ^3. Además, se ha demostrado que la respuesta de la cabeza de contracción provocada por los alucinógenos agonistas de _5-HT2A DOI y el LSD se redujo significativamente en los ratones KO ^mGlu2-5. Sin embargo, aunque los resultados anteriores demuestran convincenteme.......

Discussion

Junto con los resultados anteriores en ratones mGlu2-KO ^5, los resultados con mGlu2 y mGlu2 / mGlu3 construcciones quiméricas que no forman el complejo receptor _2A -mGlu2 5-HT en células cultivadas sugieren que el _2A 5-HT -mGlu2 complejo receptor heteroméricos en se necesita corteza frontal del ratón para inducir un comportamiento de contracción cabeza por alucinógenos agonistas de los receptores 5-HT _2A LSD. Una limitación de este método es que no mide la proximidad molecular.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
mGlu2 bicitronic virus del herpes simple (VHS)	MIT Core		mGlu2 y mGlu2DTM4N se subclonaron en el vector bicistrónico del virus HSV-GFP p1005+ HSV que expresa GFP bajo el control del promotor del CMV. Las partículas virales fueron producidas por el Viral Core Facility del Instituto McGovern (MIT). Para obtener más información, póngase en contacto con la directora, la Dra. Rachael Neve (rneve@mit.edu)
mGlu2Δ TM4N bicitronic virus del herpes simple (VHS)	MIT Core		mGlu2 y mGlu2DTM4N se subclonaron en el vector bicistrónico del virus HSV-GFP p1005+ HSV que expresa GFP bajo el control del promotor del CMV. Las partículas virales fueron producidas por el Viral Core Facility del Instituto McGovern (MIT). Para obtener más información, póngase en contacto con la directora, la Dra. Rachael Neve (rneve@mit.edu)
GFP bicitronic virus del herpes simple (VHS) vector	MIT Core		mGlu2 y mGlu2DTM4N se subclonaron en el vector bicistrónico del virus HSV-GFP p1005+ HSV que expresa GFP bajo el control del promotor del CMV. Las partículas virales fueron producidas por el Viral Core Facility del Instituto McGovern (MIT). Para obtener más información, comuníquese con la directora, Dra. Rachael Neve (rneve@mit.edu)
Xilacina		Lloyd List n.º 4811-20ml, NADA #139-236, Código(s) NDC: 61311-481-10	1,35 ml de ketamina (100 mg/ml) + 0,75 ml de xilacina (20 mg/ml) se diluyen en 12,0 ml de solución salina al 0,9%
Ketamina	Vedco	KetaVed-10ml, NADA #200-029, Código(s) NDC: 50989-161-06	1,35 ml de ketamina (100 mg/ml) + 0,75 ml de xilacina (20 mg/ml) se diluyen en 12,0 ml de solución salina al 0,9% Gel
oftálmico	Fisher Scientific	NC0550805
Pinzas Burret	Cuchilla quirúrgica Fisher Scientific	NC9268369
Feather	Fisher Scientific
Hidrógeno Peróxido	Fisher Scientific	19-898-919
jeringa Hamilton	Fisher Scientific	14815203
Hamilton™ Agujas extraíbles de cubo pequeño (calibre 33)	Microtaladro inalámbrico Fisher Scientific	14816206
Fisher	Scientific	NC9089241
adhesivo dérmico Dermabond	Fisher Scientific	NC0690470
(±)-Clorhidrato de 1-(2,5-dimetoxi-4-yodofenil)-2-aminopropano (DOI)	Sigma-Aldrich	42203-78-1	Disuelto en solución salina al 0,9% a la concentración de 2,0 mg/kg