Artículo de método

Las proteínas Análisis de inmunofluorescencia de endógenos y exógenos Centrómero-cinetocoro

DOI:

10.3791/53732

⸱

3 de marzo de 2016

 , 
1Center for Childhood Cancer and Blood Diseases, Nationwide Children's Hospital

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí reportamos protocolos para detectar proteínas endógenas y exógenas de centrómero-cinetocoro en células humanas y cuantificar estos niveles de proteínas en centrómeros-cinetocoros mediante tinción inmunofluorescente indirecta mediante el uso de fijación (fijación de paraformaldehído, acetona o metanol).

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Centrómeros" y "cinetocoros" se refieren al sitio donde los cromosomas se asocian con el huso durante la división celular. La visualización directa de las proteínas centrómero-cinetocoro durante el ciclo celular sigue siendo una herramienta fundamental en la investigación de los mecanismos de estas proteínas. Los métodos avanzados de obtención de imágenes en microscopía de fluorescencia proporcionan una resolución notable de los componentes del centrómero-cinetocoro y permiten la observación directa de componentes moleculares específicos de los centrómeros y cinetocoros. Además, los métodos de tinción inmunofluorescente indirecta (IIF) con anticuerpos específicos son cruciales para estas observaciones. Sin embargo, a pesar de los numerosos informes sobre los protocolos IIF, pocos discutieron en detalle los problemas de las proteínas específicas del centrómero-cinetocoro. 1-4 Aquí reportamos protocolos optimizados para teñir proteínas endógenas de centrómero-cinetocoro en células humanas mediante el uso de fijación de paraformaldehído y tinción de IIF. Además, reportamos protocolos para la detección de proteínas CENP-A exógenas marcadas con Flag en células humanas sometidas a fijación de acetona o metanol. Estos métodos son útiles para detectar y cuantificar proteínas endógenas centrómero-cinetocoro y proteínas CENP-A marcadas con Flag, incluidas las de las células humanas.

Introducción

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"Los centrómeros" se define clásicamente como regiones de recombinación meiótica suprimida en genética y más tarde reconocidos como la constricción principal de cromosomas mitóticos, que desempeña un papel esencial en la segregación cromosómica precisa durante la mitosis. "Kinetochores" se describieron como las estructuras de capas múltiples que se unen a los microtúbulos en la superficie de centrómeros, como se revela por microscopía electrónica; "cinetocoros" se definen como más tarde el complejo macromolecular que se localiza en el centrómero de los cromosomas mitóticos. A pesar de una divergencia dramática de secuencias de ADN centroméricas entre los vertebrados, la estructura y composición kinetochore están muy conservadas. Se requiere una interacción dinámica entre los microtúbulos del huso y el cinetocoro fieles a la segregación de los cromosomas durante la mitosis, y defectos en la función del centrómero-cinetocoro plomo a aneuploidía y por lo tanto el cáncer.

El centrómero en la mayoría de los eucariotasno tiene ninguna secuencia de ADN definida, pero se compone de grandes matrices (0,3-5 Mb) de ADN repetitivo alfoide consiste en ADN α-satélite de 171 pb. Excepto en la levadura en ciernes, la identidad centrómero se logra no por la secuencia de ADN, pero por la presencia de un nucleosoma especial que contiene la variante de la histona H3 CenH3 (centrómero Proteína A [CENP-A] en los seres humanos). 5 nucleosomas CENP-A localizar a la placa interior de los cinetocoros de mamíferos y 7 se unen al ADN α-satélite de 171 pb. centrómeros activos requieren que contiene CENP-A-nucleosomas para dirigir el reclutamiento de una red constitutiva centrómero-asociado (CCAN) y las proteínas del cinetocoro, que junto a regular la unión de los cromosomas al huso mitótico y la progresión del ciclo posterior a través del eje de control.

A la luz de la evidencia anterior, se ha propuesto CENP-A sea de la marca epigenética del centrómero 8; sin embargo, el proceso por el cual CENP-A se incorporó into ADN centromérica y los factores responsables de esta incorporación aún no han sido bien caracterizados. Un dominio corto centrómero de segmentación (CATD) reside en la histona región de CENP-A veces, y la sustitución de la región correspondiente de H3 con la CATD es suficiente para H3 directa al centrómero. 9 Varios estudios sugieren papeles funcionales para después de la traducción modificación (PTM) de CENP-A 12-16; sin embargo, aún no se han elucidado los mecanismos moleculares de estos PTMs de CENP-A en la contratación a centrómeros. Hemos informado anteriormente de que se requiere la actividad ligasa Cul4A-RBX1-COPS8 E3 de CENP-A K124 ubiquitinación y localización de CENP-A a los centrómeros. 17

El descubrimiento y caracterización de proteínas kinetochore han dado lugar a una nueva comprensión en cuanto a la segregación cromosómica. 18 Más de 100 componentes del cinetocoro se han identificado en células de vertebrados por varios enfoques. 19,20 Un bajoDe pie de cómo cinetocoros ensamblan y función también viene de la caracterización de las funciones celulares de cada red centrómero-kinetochore proteínas y proteína-proteína dentro de las células. 19 visualización directa y formación de imágenes avanzado métodos en microscopía de fluorescencia proporcionan notable resolución de los componentes centrómero-cinetocoro y permiten la observación directa de los componentes moleculares específicos de los centrómeros y cinetocoros. Además, los métodos de inmunofluorescencia indirecta (IIF) tinción utilizando anticuerpos específicos son cruciales para estas observaciones. Sin embargo, a pesar de numerosos informes acerca de los protocolos IIF, pocos problemas discutidos en detalle de proteínas específicas centrómero-cinetocoro. 1-4 Por lo tanto, el desarrollo y la presentación de informes métodos de tinción IIF y un ensayo cuantitativo IIF un análisis específico de cada proteína centrómero-cinetocoro es extremadamente importante. En la tinción de IIF, se debe proceder con el protocolo de tinción para evitar la pérdida de la proteína de interés oel resto de la célula. Sin embargo, la fijación destruye sitios antigénicos de vez en cuando, y diferentes combinaciones de anticuerpo-antígeno funciona mal con un solo fijador, pero muy bien con otra, 21 y la elección de fijador depende en gran medida de la proteína (s) de interés. Por lo tanto, los diferentes métodos de fijadores son cruciales en la tinción de las proteínas del centrómero IIF-cinetocoro.

Se han desarrollado métodos Aquí optimizadas de inmunofluorescencia indirecta (IIF) tinción y un ensayo para abordar localización de las proteínas del centrómero-kinetochore endógenos, incluyendo CENP-A y las proteínas de CENP-A exógenos bandera de etiquetado, y la cuantificación de estas proteínas en las células humanas. Estos métodos se pueden aplicar al análisis de proteínas centrómero-kinetochore en otras especies.

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Protocolo

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1. Cultivo de células y transfección

  1. Ponga una tapa de vidrio (22 mm x 22 mm) en una placa de poliestireno de 6 pocillos. escudo opcionalmente una cubierta de vidrio con poli-L-lisina, 0,1% w / v, en agua (ver Lista de Materiales / Equipo) para mantener las células mitóticas en la cubierta de vidrio siguiendo los siguientes pasos:
    Nota: Las condiciones óptimas deben determinarse para cada línea celular y aplicación.
    1. superficie de cultivo capa asépticamente con poli-L-lisina, 0,1% w / v, en agua (0,4 ml / pocillo de una placa de 6 pocillos de poliestireno). Agite suavemente para asegurar un recubrimiento de la superficie de cultivo.
    2. Después de 5 minutos, retirar la solución por aspiración y enjuague a fondo la superficie con el tejido estéril agua de calidad para cultivo.
    3. Seca al menos 2 horas antes de la introducción de células y medio.
  2. Las células HeLa o células de semillas 17 17,22 en una cubierta de vidrio (22 mm x 22 mm) poner en una placa de poliestireno de 6 pocillos HeLa Tet-Off. Compruebe que la densidad celular es de 5,4 x 10 5 por pocillo. células de cultivoen DMEM de alta glucosa con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina.
    Nota: Para obtener resultados óptimos, empíricamente determinar la densidad de las células para utilizar en la siembra.
  3. Se incuban las células a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5% durante 18 horas.
    Nota: En el caso de las células HeLa Tet-Off, la transcripción del gen exógeno es activo en ausencia del inductor (es decir, tetraciclina / doxiciclina), por tanto, las células de cultivo sin tetraciclina / doxiciclina y transfectar de forma transitoria con el vector de sobreexpresión pTRM4 (Tabla 2 ), cuya transcripción está regulada por el promotor TRE (ver abajo).
  4. Dieciocho horas después de la siembra de células, transfectar como sigue:
    1. Hacer la solución A mediante la mezcla de 1,5 l de siRNA oligo (20 mM de valores recocido, Tabla 1) y / o 2,0 g de plásmido (Tabla 2) en 50 l medio con suero reducido (véase la lista de materiales / Equipo), e incubar a temperatura ambiente durante 5 min .
      Nota: En este análisis,CA-UTR siRNAs (una mezcla de 5 'y 3' UTR siRNA; Tabla 1) fueron co-transfectadas para uso en los Protocolos 3 y 4 (véase la discusión).
    2. Hacer la solución B mezclando 0,75 reactivo de transfección l I (véase la Lista de Materiales / Equipos) en 50 l reducidos medio con suero, y se incuba a temperatura ambiente durante 5 min.
      Nota: Un paso opcional es la adición de 1,0 l de reactivo de transfección II (véase la lista de Materiales / Equipos).
    3. Mezclar las soluciones A y B juntos, y se incuba a TA durante 15 min.
    4. Se lavan las células cultivadas una vez con PBS, y luego añadir 500 l reducidos medio de suero a cada pocillo de la placa de poliestireno de 6 pocillos. Añadir la mezcla de soluciones A y B (es decir, ARN y / o complejo de ADN-lípido) directamente a cada una de la persona así.
      Nota: La concentración final es de 3,3 mg / ml (plásmido); 50 nM (siRNA).
    5. Se incuban las células a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5% durante 4,5 horas. Cambiar el medio de alta glucosa DMEM ingenioh 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina.
    6. Se incuban las células a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5% durante 48-72 horas después de la transfección.
      Nota: Para obtener resultados óptimos, el período de incubación para el crecimiento celular antes de la fijación debe determinarse empíricamente, y el agotamiento de la proteína y / o expresión debe ser confirmada por análisis de Western blot (véase el Protocolo 6).
    7. Si el análisis celular mitótico es de interés, añadir paclitaxel (10 nM) a las células cultivadas 24 horas antes de la fijación, o añadir TN16 (0,5 M) a las células cultivadas 2,5 hr antes de la fijación.

2. Fijación de la célula y tinción de inmunofluorescencia para detectar las proteínas endógenas Centrómero-cinetocoro (paraformaldehído fijación)

  1. Preparación de fijador, tampones y reactivos.
    1. Recién preparar 50 ml de solución de paraformaldehído al 4% en PBS, pH 7,4.
      1. Añadir 40 ml de PBS 1X a un vaso de precipitados de vidrio sobre una placa de agitación en una campana ventilada. Calor mientras stirring a aproximadamente 60 ° C. Añadir 2 g de polvo de paraformaldehído a la climatizada PBS.
      2. Levante lentamente el pH mediante la adición de 1 ml de NaOH 1 N en total, debido a que el polvo no se disuelve inmediatamente.
        Nota: La solución borra después de la adición de NaOH.
      3. Una vez que se haya disuelto paraformaldehído, enfriar y filtrar la solución.
      4. Ajustar el pH con HCl 1 N a pH 7,4 y el volumen de la solución con 1 × PBS a 50 ml.
        Nota: Las alícuotas de la solución se pueden congelar o almacenar a 2-8 ° C durante el tiempo que de 1 semana. La solución debe ser o se almacena a 4 ° C enfriado en hielo hasta que se va a utilizar.
    2. Preparar 50 ml de tampón de KB1, que consiste en 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; NaCl 150 mM; 0,5% de BSA; y 0,5% de Triton X-100.
      Nota: BSA debe estar recién añadido.
      Nota: La serie KB memoria intermedia se basan en KB tampón descrito en informes anteriores 1,2,4.
    3. Preparar 50 ml de tampón de KB2, que consiste en 10 mM Tris-HCl,pH 7,5; NaCl 150 mM; y 0,5% de BSA.
      Nota: BSA debe estar recién añadido.
    4. Preparar 1 ml de tampón que contiene KB3 DAPI (50 ng / ml).
    5. Preparar 100 ml de medio de montaje, que consiste en 1 mg / ml de p-fenilendiamina; 10% PBS, y 90% de glicerol.
      1. Ajustar el pH de 1 × PBS a 9,8 con NaOH 1 N, se disuelven p-fenilendiamina en la solución, y luego añadir glicerol.
      2. Tienda alícuotas de 1 ml a -80 ° C. Proteger de la luz.
  2. Retire el medio de cultivo por aspiración al 48-72 h después de la transfección (véase el Protocolo 1) para la fijación celular. Las células se lava una vez con PBS. Aplicar PBS a un lado de los pocillos de cultivo para evitar molestar a la superficie de las células.
    Nota: El punto de tiempo óptimo para la fijación de células se debe determinar empíricamente.
  3. Fijar las células en 4% de paraformaldehído en PBS durante 30 min a 4 ° C. Enjuagar las células dos veces con tampón para eliminar KB2 suficientemente residual 4% de paraformaldehído.
  4. permeabiLizé las muestras en KB1 tampón durante 30 min a RT. Enjuagar las células una vez con tampón de KB2, y añadir KB2 tampón durante 5 min a RT para bloquear los sitios adicionales de unión no específica.
    Nota: Buffer KB1 también contribuye significativamente a la de bloqueo.
  5. Quitar una cubierta de vidrio (22 mm x 22 mm) de una placa de poliestireno de 6 pocillos con unas pinzas. Con un marcador de barrera hidrofóbica (ver Lista de Materiales / Equipos), dibujar un cuadrado o un círculo de color verde pálido para formar una barrera hidrofóbica alrededor de cada muestra de vidrio cubierta. No toque ni se acerque demasiado a las células con la pluma barrera hidrofóbica. Ponga la cubierta de vidrio en una nueva placa de poliestireno de 6 pocillos.
  6. Diluir un anticuerpo primario a centrómero o proteína kinetochore (relación de dilución de 1: 100 a 1: 200; véase también la Lista de Materiales / Equipment) y, o bien un anticuerpo anti-CENP-B (relación de dilución de 1: 400) o un anti- anticuerpo centrómero (ACA) (relación de dilución de 1: 2000) como un marcador de ubicación centrómero en KB2 buffer.
    Nota: Para obtener resultados óptimos, la concentración final dela del anticuerpo primario en esta solución debe ser determinada empíricamente.
  7. Aplicar un volumen suficiente (aproximadamente 30 l) del anticuerpo primario diluido para sumergir la muestra de células. Incubar la muestra de células durante 1 hora a 37 ° C. Enjuagar las células 3 veces con tampón KB 2.
  8. Usando KB2 tampón, se diluye un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo (relación de dilución de 1: 100 a 1: 200) dirigido contra cada anticuerpo primario.
    Nota: Para obtener resultados óptimos, la concentración final del anticuerpo secundario en esta solución debe ser determinada empíricamente.
  9. Aplicar un volumen suficiente (una gota de ca. 30 l en el cristal de cubierta) del anticuerpo secundario diluido para sumergir la muestra de células. Incubar la muestra de células durante 1 hora a 37 ° C. Enjuagar las células 5 veces con tampón de KB2 durante un período de 30 min (cinco 6 min lavados).
    Nota: Para obtener resultados óptimos (es decir, para una mínima pérdida de células), la condición de lavado óptimo debe determinarse EmpiricaLLY.
  10. Aplicar un volumen suficiente de KB3 tampón que contiene DAPI (50 ng / ml) para sumergir la muestra de células. Incubar la muestra de células durante 5 min a RT. Enjuagar las células 1-2 veces con tampón KB2.
  11. Montar la cubierta de vidrio que contiene la muestra de células en el portaobjetos de micro.
    1. Colocar una gota de medio de montaje en el centro de la corredera micro.
    2. Retire el líquido de la muestra de células y, utilizando las manos o los fórceps, la posición de la muestra en el centro de la diapositiva micro. Evitar las burbujas de aire.
    3. Eliminar el exceso de medio de montaje con una toalla de papel.

3. Fijación de la célula y Inmunofluorescencia La tinción de C-terminal Bandera de etiquetado CENP-A Proteínas (Acetona fijación)

  1. Preparación
    1. Preparar helado de acetona al 75%.
    2. Recién preparar 50 ml de PBS (pH 7,4) que contiene 0,5% de leche desnatada y 0,5% de BSA.
    3. Recién preparar 50 ml de PBS (pH 7,4) que contiene 0,1% de leche desnatada y 0,1% de BSA.
    4. Preparar 1 ml de PBS (pH 7,4) que contiene DAPI (50-100 ng / ml).
    5. Preparar 100 ml de medio de montaje como se describe en 2.1.5.
  2. Retire el medio de cultivo por aspiración al 48-72 h después de la transfección (véase el Protocolo 1) para la fijación celular. Las células se lava una vez con PBS. Aplicar PBS al lado del pocillo de cultivo para evitar molestar a la superficie de las células.
    Nota: El punto de tiempo óptimo para la fijación de células se debe determinar empíricamente.
  3. Fijar las células en helado de 75% de acetona, y se incuban las células durante 10 min a -20 ° C. Las pilas secas en la cubierta de vidrio en una campana de humos durante 30-60 minutos a temperatura ambiente.
    Nota: Para obtener resultados óptimos, la longitud de tiempo necesario para la fijación y la célula de secado debe ser determinada empíricamente.
  4. Uso del lápiz barrera hidrofóbica (ver Lista de Materiales / Equipos), dibujar un cuadrado o un círculo de color verde pálido para formar una barrera hidrofóbica alrededor de cada muestra de vidrio cubierta. No toque ni se acerque demasiado a las células con la pluma barrera hidrofóbica.
  5. bloque nonspecific sitios en las células de unión mediante la adición de PBS que contenía 0,5% de leche desnatada y 0,5% de BSA durante 5 min a TA.
  6. El uso de PBS que contenía 0,1% de leche desnatada y 0,1% de BSA, se diluye un anticuerpo anti-Flag (1: 1.000 relación de dilución) y, o bien un anticuerpo anti-CENP-B (relación de dilución de 1: 200) o ACA (1: relación de dilución 2000 ) como un marcador de ubicación centrómero.
    Nota: Para obtener resultados óptimos, la concentración final del anticuerpo primario en esta solución debe ser determinada empíricamente.
  7. Aplicar un volumen suficiente (aproximadamente 30 l) del anticuerpo primario diluido para sumergir la muestra de células. Incubar la muestra de células durante 1 hora a 37 ° C. Enjuagar las células 5 veces con el tampón de bloqueo durante un período de 30 min.
    Nota: Las células pueden ser enjuagados con PBS. Para obtener resultados óptimos (es decir, para evitar la pérdida de las células), las condiciones de lavado óptimos deben determinarse empíricamente.
  8. Diluir un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo (relación de dilución de 1: 100 a 1: 200) dirigido contrala cada anticuerpo primario en PBS que contenía 0,1% de leche desnatada y 0,1% de BSA.
    Nota: Para obtener resultados óptimos, la concentración final del anticuerpo secundario en esta solución debe ser determinada empíricamente.
  9. Aplicar un volumen suficiente (aproximadamente 30 l) del anticuerpo secundario diluido para sumergir la muestra de células. Incubar la muestra de células durante 1 hora a 37 ° C. Enjuagar las células 2 veces con PBS que contenía 0,1% de leche desnatada y 0,1% de BSA.
    Nota: PBS solo también puede ser utilizado para lavar las células.
  10. Aplicar un volumen suficiente de PBS que contenía DAPI (50-100 ng / ml) para sumergir la muestra de células. Incubar la muestra de células durante 5 min a RT. Enjuagar las células 1-2 veces con PBS.
  11. Montar la cubierta de vidrio que contiene la muestra de células en el portaobjetos de micro como se describe en 2.11.

4. Fijación de la célula y Inmunofluorescencia La tinción de N-terminal Bandera de etiquetado CENP-A Proteínas (metanol fijación)

  1. Preparación
    1. Preparar metanol enfriado con hielo.
    2. Preparar TBS (pH 7,4) que contiene 4% de suero de cabra.
    3. Preparar 1 ml de TBS (pH 7,4) que contiene DAPI (50-100 ng / ml).
    4. Preparar 100 ml de medio de montaje como se describe en 2.1.5.
  2. Retire el medio de cultivo por aspiración al 48-72 h después de la transfección (véase el Protocolo 1) para la fijación celular. Las células se lava una vez con TBS. Aplicar TBS a un lado de los pocillos de cultivo para evitar molestar a la superficie de las células.
    Nota: El punto de tiempo óptimo para la fijación de células se debe determinar empíricamente.
  3. Fijar las células en metanol enfriado con hielo, y se incuban las células durante 6 min a -20 ° C. Enjuagar las células dos veces con TBS para eliminar suficientemente metanol residual.
  4. Con un marcador de barrera hidrofóbica (ver Lista de Materiales / Equipos), dibujar un cuadrado o un círculo de color verde pálido para crear una barrera hidrofóbica alrededor de cada muestra de vidrio cubierta. No toque ni se acerque demasiado a las células con la pluma barrera hidrofóbica.
  5. Bloquear los sitios de unión no específicos en el cells por TBS añadiendo que contienen 4% de suero de cabra. Incubar durante 10 min a TA.
  6. Diluir un anticuerpo anti-Flag (dilución 1: 1000) y, o bien un anticuerpo anti-CENP-B (relación de dilución de 1: 200) o ACA (1: 2.000 relación de dilución) como un marcador de ubicación centrómero en TBS que contenía 4% de suero de cabra .
    Nota: Para obtener resultados óptimos, la concentración final del anticuerpo primario en esta solución debe ser determinada empíricamente.
  7. Aplicar un volumen suficiente (aproximadamente 30 l) del anticuerpo primario diluido para sumergir la muestra de células. Incubar la muestra de células durante 1 hora a 37 ° C. Enjuagar las células 5 veces con el tampón de bloqueo durante un período de 30 min. Para obtener resultados óptimos (es decir, la pérdida mínima de células), la condición de lavado óptimo debe determinarse empíricamente.
  8. Diluir un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo (relación de dilución de 1: 100 a 1: 200) dirigido contra cada anticuerpo primario en TBS que contenía 4% de suero de cabra.
    Nota: Para obtener resultados óptimos, la FINAl concentración del anticuerpo secundario en esta solución debe ser determinada empíricamente.
  9. Aplicar un volumen suficiente (aproximadamente 30 l) del anticuerpo secundario diluido para sumergir la muestra de células. Incubar la muestra de células durante 1 hora a 37 ° C. Enjuagar las células 3 veces con el tampón de bloqueo.
  10. Aplicar un volumen suficiente de TBS que contenía DAPI (50-100 ng / ml) para sumergir la muestra de células. Incubar la muestra de células durante 5 min a RT. Enjuagar las células 1-2 veces con TBS.
  11. Montar la cubierta de vidrio que contiene la muestra de células en el portaobjetos de micro como se describe en 2.11.

5. La inmunofluorescencia Observación de imágenes, adquisición, cuantificación y análisis

  1. Observar la muestra de células a través de un microscopio de fluorescencia motorizado equipado con una lente de 63X y 100X de inmersión en aceite, una fuente de luz compacta externa, y una cámara digital CCD.
  2. Realizar la adquisición de imágenes y procesamiento, incluyendo deconvolución, mediante el uso de softwareUna o Softwares B1 y B2 (ver Lista de Materiales / Equipos). Por favor, vea el Código Suplementario de Archivos (5.2.1) para todos los comandos utilizados en Software A. Para todos los comandos utilizados en Softwares B1 y B2, véase (5.2.2) en los archivos de código suplementario.
  3. Use un método descrito previamente 23-25 ​​para cuantificar las señales de las proteínas del centrómero-cinetocoro (por ejemplo, señales de CENP-A en el centrómero restante) con las siguientes modificaciones de menor importancia:
    1. Seleccionar zona de las proteínas de centrómero-cinetocoro y la del fondo de la siguiente manera:
      1. celular mitótico: (región centrómero-cinetocoro) Seleccionar área de superposición con los cromosomas teñidos con DAPI; (región de fondo) y la zona exterior cromosomas pero dentro de la única célula idéntica (es decir, región, citosólica).
      2. interfase celular: (región centrómero-cinetocoro) Seleccionar área de superposición con la cromatina se tiñeron con DAPI; (Región de fondo) y la zona exterior de la cromatina, pero dentro de la única célula idéntica ( es decir, la región citosólica).
        Nota: Consulte los archivos de código también Suplementario (5.2.1.4.3) o (5.2.2.6.4) para la selección de software Una zona con software o B2, respectivamente.
    2. Cuantificar el porcentaje de señales restantes en los centrómeros mediante el uso de software de A o B. Para esta tarea, utilice la siguiente fórmula:
      Restante señales de proteína-centrómero cinetocoro en el centrómero-cinetocoro
      figure-protocol-1
      donde s es el brillo de la señal de la zona seleccionada, que se confirma por ACA o tinción CENP-B; b es el brillo de la señal de fondo; muestra de r es las señales de ACA de referencia o CENP-B para siRNA (s) células tratadas; y r es el ctrl señales CENP-B ACA referencia o de las células transfectadas con siRNA Luc.
      Nota: En este análisis, se utilizaron señales CENP-B como señales de referencia para Cul4A y RBX1 como se describe en los informes anteriores.
    3. Utilice un archivo de Excel para este cálculo después de copiar y pegar los datos en bruto de la señal de software de cuantificación se ha descrito anteriormente. Ver también los archivos de código suplementario: (5.2.1.4) y (5.2.2.6) para obtener más información. Un ejemplo de cálculo se muestra en la Tabla 3.
  4. Analizar al menos 20 células para eliminar la variación en la tinción y adquisición de imágenes para cada nivel de medición. utilizar opcionalmente "valor medio" de permanecer señales del centrómero-cinetocoro para cada analizaron las células para comparar estos valores entre diferentes proteínas del centrómero-cinetocoro.

6. Análisis de transferencia Western de las proteínas totales

  1. Resuspender las células en tampón desnaturalizante A (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; NaCl 50 mM; 0,5% de Nonidet P-40; 0,5% desoxicolato; 0,5% de SDS; EDTA 1 mM; y completa de la proteasa cóctel inhibidor libre de EDTA), 26 sujeta la suspensión a un tratamiento con ultrasonidos y el proceso de congelación-descongelación, y medidalas concentraciones de proteína como sigue:
    1. Para el proceso de sonicación, se añaden 50 l de tampón A a las células recogidas a partir de dos pocillos de una placa de poliestireno de 6 pocillos a 48 a 72 h después de la transfección (véase el Protocolo 1). Operar un aparato de ultrasonidos equipada con el cuerno disruptor y micropunta (ver Lista de Materiales / Equipo) para una duración total de 15 seg-pulso intermitente (ciclo de trabajo del 50%) por cada muestra.
    2. Para el proceso de congelación-descongelación, congelación de células con nitrógeno líquido y descongelar las células a TA.
    3. Medir las concentraciones de proteína usando un ensayo de proteína reactivo I o II comercial (ver Lista de Materiales / Equipos).
      Nota: Los lisados ​​se diluyen con relación de 1:10 en la medición de las concentraciones de proteína, ya sea con el reactivo I o II. A esta dilución, el SDS presente en tampón A muestra poca o ninguna interferencia en esta medición.
  2. Mezclar el lisado que contiene 20 a 30 g de proteína total con tampón de carga 2 × o 4 × SDS-PAGE. 27 hervir las muestras para5 min y luego cargarlos en un 12.0% -15.0% de desnaturalización en gel de poliacrilamida-SDS para electroforesis.
  3. La transferencia de las proteínas separadas por SDS-PAGE a una membrana de PVDF usando un método de inmunotransferencia de tipo Western descrito anteriormente. 17,24,27-31
    1. Bloquear los sitios de unión no específicos en la membrana con leche no grasa al 5% en 1 x PBS, y luego se incuba la membrana con soluciones de anticuerpos primarios diluidos durante 1 hora a RT. Ver Lista de Materiales / Equipos para obtener información detallada (por ejemplo, relación de dilución) de cada anticuerpo primario.
    2. Después de lavar la membrana 3-4 veces (cada uno de 3 a 5 minutos de incubación con agitación) con tampón de PBS-T (1 x PBS y 0,1% Tween-20), incubar la membrana en una mezcla de infrarrojo cercano (IR) anticuerpos secundarios de tinte conjugado fluorescentes (relación de dilución de 1: 20000), anticuerpos secundarios conjugados DyLight (relación de dilución de 1: 20.000), y / o peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpos secundarios (diluido en PBS-T; dilutien proporción de 1: 10000) durante 1 hora a RT. Ver Lista de Materiales / Equipos para obtener información detallada (por ejemplo, relación de dilución) de cada anticuerpo secundario.
  4. Lavar la membrana 3 veces, y luego escanear la membrana para analizar las proteínas con el sistema de imágenes de infrarrojos y / o el generador de imágenes de quimioluminiscencia para la detección de inmunotransferencia (véase la lista de materiales / equipo).
    1. Para poder utilizar el sistema de imágenes por infrarrojos, véase (6.4.1) en los archivos de código suplementario.
    2. Para poder utilizar el reproductor de imágenes de quimioluminiscencia, véase (6.4.2) en los archivos de código suplementario. Utilizar un sustrato ultrasensible mejorado de quimioluminiscencia (ECL) (véase la lista de materiales / Equipo) para este sistema.

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Resultados

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El análisis de inmunofluorescencia de endógena CENP-A es compatible con la hipótesis de que se requiere Cul4A-E3 ligasa para la localización de CENP-A a centrómeros
Nuestros estudios recientes demostraron que se requiere la actividad ligasa Cul4A-RBX1-COPS8 E3 para la ubiquitinación de la lisina 124 (K124) en el CENP-A y localización de CENP-A a los centrómeros. 17 Inicialmente, el complejo de interfase-centrómero (ICEN) fue aislado por anti-CENP-a: inmun...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En los últimos años muchos estudios han desarrollado diferentes ensayos de microscopía cuantitativa de células fijadas. 42 El progreso en la biología centrómero-kinetochore a menudo requiere una comprensión de la función específica del centrómero o-kinetochore específico de proteínas de las cuales subcelular regulación espacial-temporal refleja las cambiantes funciones de estas proteínas durante el ciclo celular. Por lo tanto, aquí hemos desarrollado métodos de tinción de IIF y un ensayo cuantitativo IIF para...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por el NIH GM68418 subvención.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Lipofectamin 2000Life Technologies/Invitrogen11668reactivo de transfección I
Lipofectamin RNAiMAXLife Technologies/Invitrogen13778reactivo de transfección II
Opti-MEM ILife Technologies/Invitrogen31985Medios de suero reducidos, calientes en 37 grados; C baño de agua antes
de usar DMEM con alto contenido de glucosa (Dulbecco' Águila modificada' s medio)Life Technologies/BioWhittaker12-604DMEM de alta glucosa, caliente en 37 ° C baño de agua antes de usar
Suero fetal bovino, certificado, inactivado por calor, origen de EE. UU.Life Technologies/Gibco10082FBS (suero fetal bovino)
Poly-L-Lisina SOLUCIÓNSIGMA-SLDRICHP 8920Poly-L-Lisina, 0,1% p/v, en agua
Agua destilada ultrapuraLife Technologies/Invitrogen/Gibco10977Agua estéril de grado de cultivo de tejidos 
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) Surgipath105Cubertor de vidrio (22 mm x 22 mm) 
Clúster de cultivo celular de 6 pocillosFisher/Corning Incorporated07-200-83placa de poliestireno de 6 pocillos 
Penicilina, Estreptomicina; LíquidoFisher/Gibco15-140Penicilina-estreptomicina
PAP PEN Sitio de uniónAD100.1Pluma de barrera hidrofóbica (para una barrera repelente al agua en la tinción inmunofluorescente)
Paclitaxel (Taxol)SIGMA-SLDRICHT7402Taxol para el análisis de células mitóticas
TN-16, inhibidor de microtúbulos (TN16)Enzo Life SciencesBML-T120TN16 para el análisis de células mitóticas
BSA (albúmina sérica bovina)SIGMA-SLDRICHA7906Reactivo bloqueante
Triton X-100SIGMA-SLDRICHT8787Detergente para permeabilización
ParaformaldehídoSIGMA-SLDRICHP6148Fijador
DAPISIGMA-SLDRICHD9542Para tinción nuclear
p-fenilendiaminaSIGMA-SLDRICHP6001Para medio de montaje
VWR Micro Slides, esmeriladosVWR International48312-013Micro portaobjetos 
Anticuerpo anti-CENP-AStressgen/Enzo Life SciencesKAM-CC006Anticuerpo monoclonal de ratón; relación de dilución de 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)
Anticuerpo anti-CENP-BNovus BiologicalsH00001059-B01PAnticuerpo monoclonal de ratón; relación de dilución de 1:200 (IIF, fijación de metanol/acetona)-1:400 (IIF, fijación de paraformaldehído)Anticuerpo
anti-CENP-B abcamab25734Anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:200 (IIF, fijación de metanol/acetona)-1:400 (IIF, fijación de paraformaldehído)
Anticuerpo anticentrómero (ACA)Fitzgerald Industries International, Inc.90C-CS1058Antisuero de centrómero humano; relación de dilución de 1:2000 (IIF)
Anticuerpo anti-CENP-HBethyl LaboratoriesBL1112 (A400-007A)Anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:200 (IIF)
Anticuerpo anti-CENP-HBD612142Anticuerpo monoclonal de ratón; relación de dilución de 1:200 (IIF)
Anticuerpo anti-CENP-IN/A, Dr. Katusmi KitagawaN/A, Dr. Katusmi KitagawaAnticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006)
Anticuerpo anti-KNL1Novus BiologicalsNBP1-89223Anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:100 (IIF)
Anticuerpo anti-Hec1Novus Biologicals / GeneTexNB 100-338 / GTX70268Anticuerpo monoclonal de ratón; relación de dilución de 1:100 (IIF)
Anticuerpo anti-Hec1GeneTexGTX110735anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:100 (IIF)
Anticuerpo anti-Ska1abcamab46826Anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:100 (IIF)
Anticuerpo anti-FlagSIGMA-ALDRICHF3165Anticuerpo monoclonal de ratón; relación de dilución de 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anticuerpo anti-FlagSIGMA-ALDRICHF7425Anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anti-CUL4A anticuerpoN/A, Dr. Pradip RaychaudhuriN/A, Dr. Pradip RaychaudhuriAnticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999)
Anticuerpo anti-RBX1Cell Signaling4397Anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:2000 (WB)
Anticuerpo anti-GAPDHChemiconMAB374Anticuerpo monoclonal de ratón; relación de dilución de 1:5000 (WB)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgGLife Technologies/InvitrogenA11001anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos (anticuerpo secundario purificado por afinidad)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgGLife Technologies/InvitrogenA11005anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos (anticuerpo secundario purificado por afinidad)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgGLife Technologies/InvitrogenA11008anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos (anticuerpo secundario purificado por afinidad)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgGLife Technologies/InvitrogenA11012anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos (anticuerpo secundario purificado por afinidad)
Leche en polvo descremada (sustituto aprobado de la leche en polvo de clavel)Fisher Scientific NC9255871(Reorden n.º 190915; Lote # 90629)
Microscopio de fluorescencia motorizado Leica DM IRE2 de leche descremada Microscopio de fluorescencia motorizadoLeica
Lente de inmersión en aceite HCX PL APO 63xLeica LEICAHCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS63X lente de inmersión
aceite HCX PL APO 100x Lente de inmersión en aceiteLeica LEICAHCX PL APO NA 1.40 OIL PHE100X Lente de inmersión en aceite
Leica EL6000 Fuente de luz compactaLeicaFuente de luz compacta externa para excitación fluorescente
ORCA-R2 Cámara CCD digital HamamatsuC10600-10B 
Openlab versión 5.5.2 Software de imágenes científicas Perkin Elmer/ImprovisionPara la observación, adquisición, cuantificación y análisis de imágenes
Velocity versión 6.1.1 Software de análisis de imágenes 3D Perkin Elmer/ImprovisionPara la observación, adquisición, cuantificación y análisis
de imágenes Cóctel completo de inhibidores de proteasa sin EDTARoche11873580001/11836170001Comprimidos de cóctel de inhibidores de proteasa
PlusOne 2-D Quant KitAmersham Biosciences80-6483-56Reactivo de ensayo de proteínas comercial I para la medición de la concentración de proteínas (compatible con SDS
al 2%)Bio-Rad Protein AssayBio-Rad500-0006Reactivo de ensayo de proteínas comercial II para la medición de la concentración de proteínas (compatible con SDS al 0,1%)
Immobilon-FLEMD Millipore IPFL00010membrana de PVDF para la transferencia
IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgGLI-COR Biosciences926-32210IR anticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente (anticuerpo secundario purificado por afinidad); relación de dilución de 1:20000 (IIF)
IRDye 680 IgG anti-conejo de cabra Li-CorBiosciences926-32221Anticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente IR (anticuerpo secundario purificado por afinidad); relación de dilución de 1:20000 (IIF)
DyLight 549Fisher ScientificPI35507DyLightAnticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente IR (anticuerpo secundario purificado por afinidad); relación de dilución de 1:20000 (IIF)
Anticuerpo secundario conjugado con DyLight 649Fisher ScientificPI35565DyLightAnticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente IR (anticuerpo secundario purificado por afinidad); relación de dilución de 1:20000 (IIF)
AnticuerpoCruzSC-2005anticuerpo secundario conjugado con HRPanticuerpo secundario conjugado con dyLightAnticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente IR (secundario purificado por afinidad anticuerpo); relación de dilución de 1:10000 (IIF)
IgG-HRP anti-conejode cabra Santa CruzSC-2004Anticuerpo secundario conjugado con HRPanticuerpo secundario conjugado con dyLightAnticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente IR (anticuerpo secundario purificado por afinidad); relación de dilución de 1:10000 (IIF)
Openlab versión 5.5.2. Software de Imágenes Científicas Improvision/PerkinElmerSoftware A
Volocity versión 6.3 Software de análisis de imágenes 3D (Volocity Acquisition)PerkinElmerSoftware B1
Volocity versión 6.3 Software de análisis de imágenes 3D (Cuantificación de volocity)PerkinElmerSoftware B2
Branson SONIFIER 450Sonicator
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Sólido, Rosca de 9,5 mmVWR Scientific Products Inc.  33995-325Bocina disruptora para sonicación
Branson Ultrasonics sonicador Microtip Tapered 6,5 mmVWR Scientific Products Inc.  33996-185Microtip para sonicación
Odyssey CLx Sistema de imágenes infrarrojas LI-COR Biosciences Sistema deimágenes infrarrojas para la detección de
Software de análisis de estudio de imágenes Ver 4.0 LI-COR BiosciencesSoftware C
Sistema Versadoc MP4000 Generador de imágenes de quimioluminiscenciaBio-Rad
Cantidad Un software de análisis 1-D Bio-RadSoftware D
SuperSignal West Femto Sustrato de máxima sensibilidadThermo34095Sustrato quimioluminiscente mejorado (ECL) ultrasensible
  en Cámara CCD digital Anticuerpo secundario conjugado secundario conjugado con HRP Santa inmunoblotGenerador de imágenes moleculares para la detección de inmunoblot

Referencias

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