Utilizando metodologías combinadas para definir el papel de la membrana plasmática de entrega Durante Axon ramas y morfogénesis neuronal

Resumen

Las técnicas de microscopía óptica junto con ensayos bioquímicos dilucidan la implicación de la exocitosis mediada por SNARE en la ramificación de los axones dependiente de la netrina. Esta combinación de técnicas permite identificar los mecanismos moleculares que controlan la ramificación de los axones y el cambio de forma de las células.

Resumen

Durante el desarrollo neuronal, los axones en crecimiento se extienden a múltiples socios sinápticos mediante la elaboración de ramas axonales. La ramificación de los axones es promovida por señales de guía extracelular como la netrina-1 y da como resultado aumentos dramáticos en el área superficial de la membrana plasmática axonal. La ramificación del axón dependiente de la netrina-1 probablemente implica el control temporal y espacial de la expansión de la membrana plasmática, cuyos componentes se suministran a través de la fusión de vesículas exocíticas. Estos eventos de fusión están precedidos por la formación de complejos SNARE, que comprenden un v-SNARE, como VAMP2 (proteína de membrana asociada a vesículas 2) y t-SNAREs de membrana plasmática, sintaxina-1 y SNAP25 (proteína 25 asociada a sinaptosomasoma). En este trabajo se detalla un enfoque múltiple utilizado para examinar el papel de la exocitosis mediada por SNARE en la ramificación de los axones. La fortaleza del enfoque combinado es la adquisición de datos en un rango de resoluciones espaciales y temporales, que abarcan desde la dinámica de los eventos de fusión de vesículas individuales en neuronas individuales hasta la formación del complejo SNARE y la ramificación de axones en poblaciones de neuronas cultivadas. Este protocolo aprovecha los enfoques bioquímicos establecidos para analizar los niveles de complejos SNARE endógenos y la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) de neuronas corticales que expresan VAMP2 marcadas con una GFP sensible al pH (VAMP2-pHlourin) para identificar cambios dependientes de la netrina-1 en la actividad exocítica en neuronas individuales. Para dilucidar el momento de la ramificación dependiente de la netrina-1, se utiliza la microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) de lapso de tiempo de neuronas individuales del orden de horas. La inmunofluorescencia celular fija emparejada con neurotoxinas botulínicas que escinden la maquinaria SNARE y bloquean la exocitosis demuestra que la ramificación del axón dependiente de la netrina-1 requiere actividad exocítica mediada por SNARE.

Introducción

Estimaciones recientes sugieren que el cerebro humano contiene 10¹¹ neuronas con 10¹⁴ conexiones sinápticas¹, lo que destaca la importancia de la ramificación de los axones in vivo. Las señales de guía de los axones extracelulares, como la netrina-1, guían los axones a los socios sinápticos apropiados y estimulan la ramificación axonal, aumentando así la capacidad sináptica^2-5. La arborización axonal dependiente de netrina-1 implica una expansión sustancial de la membrana plasmática⁶, que hipotetizamos requiere la entrega de componentes adicionales de la membrana a través de la fusión de vesículas exocíticas dependientes del complejo SNARE⁷.

Investigar el papel de la exocitosis mediada por SNARE en la ramificación de los axones dependientes de netrina-1 es complicado por varios factores. En primer lugar, la heterogeneidad de las neuronas corticales aumenta el tamaño de la muestra necesaria para identificar efectos significativos, lo que complica las técnicas unicelulares como la obtención de imágenes. En segundo lugar, aunque las técnicas bioquímicas permiten observar los cambios que ocurren a nivel poblacional, carecen de la resolución temporal y espacial necesaria para localizar la expansión de la membrana plasmática en el axón en el marco temporal de la ramificación del axón. Por último, aunque las ramas axónicas se forman a lo largo de las horas, los cambios celulares que contribuyen a la extensión axonal pueden comenzar en cuestión de minutos y ocurrir en el orden de segundos, ampliando así el alcance temporal para la consideración experimental.

Describimos un enfoque multitécnico que aborda estas diversas escalas temporales y espaciales de exocitosis y ramificación de axones, y por lo tanto mejora nuestra comprensión de los mecanismos celulares fundamentales. El uso de estos enfoques proporciona evidencia que respalda un papel crítico de la exocitosis mediada por SNARE en la ramificación de los axones.

Protocolo

Declaración de ética de la investigación: Todos los experimentos con animales que se detallan en este documento están sujetos a las reglas y regulaciones del Comité de Cuidado de Animales UNC y con las normas del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

1. Preparación y revestimiento del disociada de las neuronas corticales

1. La eutanasia a las mujeres embarazadas oportunas por inhalación de CO ₂ seguido por dislocación cervical. Retire todo el cerebro de los cráneos de embriones día 15.5 (E15.5) ratones y microdissect cortezas de cada hemisferio. Para obtener instrucciones detalladas relativas a la microdisección de la corteza de embriones de ratón consulte Viesselmann et al ^8.
2. Colocar no más de 4 cortezas en 1 ml de medio de disección estéril en un microtubo de 1,6 ml. Añadir 120 l de 10x tripsina y se invierte el tubo de 3 - 5 veces para mezclar.
3. El uso de un hemocitómetro, contar las células para sembrar placas de cultivo celular. Nota: 1 hemisferio cortical proporciona aproximately tres millones de células.
   1. Para el ensayo de la bioquímica complejo SNARE SDS-resistente, placa de seis millones de células por placa de 35 mm y utilizar dos platos por condición. Nota: Esto se simplifica mediante el uso de placas de 6 pocillos al comparar varias condiciones.
   2. Para los ensayos de ramificación, las neuronas de placas en ácido nítrico lavaron los cubreobjetos circulares a una densidad de 250.000 células por placa de 35 mm, por DIC imágenes de axón de ramificación placa a una densidad de 150.000. Estas densidades de evitar el hacinamiento y simplificar el análisis.
4. Para la microscopía TIRF vivo de células, volver a suspender dos millones de neuronas por transfección en nucleofection solución a temperatura ambiente.
   1. Añadir 100 l de suspensión celular a microtubo que contiene 10 g de VAMP2-pHlourin plásmido de expresión y electroporación con un nucleofector acuerdo con el protocolo del fabricante ^9.
   2. Después de transfecciones añadir inmediatamente 500 l de tripsina temple medios, anular la suspensión de células cubetas y placas en una cuevasidad de 400.000 células por 35 mm de vidrio recubierta con PDL plato inferior.
5. Plate todas las neuronas corticales en 2 ml de medio libre de suero.

2. SNARE Ensayo de Formación de complejos

Nota: los complejos SNARE SDS-resistentes fueron procesados ​​y analizados como se describe originalmente ¹⁰ con las modificaciones que se detallan a continuación. Para los anticuerpos validados alternativos a los que se usan aquí, consulte la sección de materiales.

1. Estimular las neuronas corticales E15.5 2 días in vitro (DIV) con 250 netrina-1 o simulada de control ng / ml durante 1 hora antes de la lisis.
2. Antes de procesamiento de muestras, centrífuga fría a 4 ° C, y ajuste la temperatura del baño de agua a 37 ° C, y el bloque de calor a 100 ° C.
3. Sacar los recipientes de células de la incubadora y colocar en hielo.
   1. Aspirar los medios de comunicación a partir de células, reemplazan solución salina tamponada con ~ 2 ml de hielo frío de fosfato (PBS) suavemente 2 veces para 1 - 2 min por lavado.
   2. Para este ensayo, utilizar 2 pocillos por condition.
   3. Aspirar PBS desde el primer pocillo de una condición y reemplazar con 250 l tampón de homogeneización. Deja en hielo durante 5 min, y a continuación, utilizando un elevador de células, homogeneizar las células en hielo.
   4. Aspirar el PBS del siguiente pozo de la misma condición y añadir la mezcla homogeneizada recientemente al pozo. Esto aumentará las concentraciones de proteína. Repita este procedimiento para todas las condiciones.
   5. Al finalizar, la pipeta solución a un pre-enfriado 1,6 ml microtubo homogeneizó en hielo y añadir 20% Triton X-100 para llegar a una concentración final de 1% Triton X-100. Se tritura la mezcla 10 veces con una pipeta 1.000 l minimizando al mismo tiempo las burbujas.
4. Incubar los tubos en hielo durante 2 min para solubilizar proteínas. Después de la incubación, se centrifuga durante 10 min a 6010 RCF a 4 ° C para sedimentar el material no solubilizado. Mueva sobrenadante lisado en un nuevo tubo de 1,6 ml enfriado en hielo.
5. Realizar un análisis de la concentración de proteína usando el ensayo de Bradford ¹¹ y diluir las muestras a una final concentración de proteína de 3-5 mg / ml con tampón de homogeneización suplementado con 1% Triton X-100 y 5x tampón de muestra suplementado con B-Mercaptethanol (BME) restante.
6. Divide cada muestra experimental uniformemente en 2 tubos. Incubar una muestra a 37 ° C durante 30 min (complejos SNARE), y el otro a 100 ° C durante 30 min (monómeros SNARE). Invertir los tubos de forma intermitente para mantener las muestras en solución.
7. Congelar las muestras a -20 ° C hasta el momento de separar por medio de SDS-PAGE. Antes de ejecutar muestras mediante electroforesis usando técnicas estándar, re-ebullición muestras previamente hervida durante 5 minutos a 100 ° C, pero descongelar 37 ° C las muestras a temperatura ambiente.
8. duplicados serie de muestras (30 - 40 g de proteína por muestra) tanto en un 8% y un 15% en gel; el 8% proporciona la separación ideal del complejo, mientras que el 15% se utiliza para cuantificar monómeros de proteínas SNARE (SNAP-25 ~ 25 kDa, VAMP2 ~ 18kDa, sintaxina-1 ~ 35 kDa). Mantener la fuente de alimentación a 70 V hasta que la línea de tinte es a través del STACgel de rey y aumento de tensión a 90V. Correr geles hasta que el colorante se escapa.
9. Para preservar monómeros, transferir las proteínas a 0,2 micras membrana de nitrocelulosa en hielo usando tampón de transferencia en frío con 20% de metanol (MeOH) añadido, a 70 V durante 45 min.
10. membrana seca en un recipiente cubierto durante 2 horas a O / N a TA (O / N proporciona los mejores resultados).
11. Bloquear SNARE membranas complejos en 10% albúmina de suero bovino (BSA) durante 1 hora a RT.
12. Preparar anticuerpos primarios (que reconocen componentes específicos complejos SNARE) a una dilución de 1: 1000 y la sonda de O / N a 4 ° C en un agitador rotatorio.
    1. Enjuague borrones en Tris Buffered Saline más 0,1% de Tween-20 (TBS-T) 3 veces durante 5 min cada uno.
13. Preparar soluciones de anticuerpos secundarios fluorescentes a una dilución de 1: 20.000 en 1% de BSA en TBS-T y la sonda para 1 hr, cubierto a TA. Repita el paso 2.12.1 Después de 1 hora.
14. Las transferencias de imagen en una máquina de escaneo fluorescente equipados con la suite de software y cuantificar tanto la co proteínas SNAREmplex (bandas inmunorreactivas por encima de 40 kDa) y bandas de monómero (bandas inmunorreactivas a 25 kDa, 18 kDa, 35 kDa para la SNAP-25, VAMP2 y sintaxina-1, respectivamente) utilizando las instrucciones del fabricante para la elaboración de ROI rectangular.

3. Imaging exocytic eventos mediante microscopía TIRF

Nota: Este protocolo requiere un equipo de microscopía especializado incluyendo una cámara ambiental para mantener la temperatura, la humedad y CO _2, un microscopio TIRF invertido equipado con una iluminación epifluorescente, una gran ampliación / alta apertura numérica (NA) objetivo TIRF, una etapa XYZ automatizado, y un detector sensible dispositivo de carga acoplada (CCD). Este protocolo utiliza un microscopio invertido totalmente automatizado equipado con un objetivo de un sólido de estado 491 nm láser 100x 1.49NA TIRF y un CCD multiplicador de electrones (EM-CCD). Todo el equipo es controlado por un software de imagen y control del láser. Antes del comienzo del poder protocolo de formación de imágenes en el medio amben materia de medio de cámara, el escenario, la lámpara, el ordenador y la cámara.

1. Elija un objetivo en el software de imágenes. Una vez que el objetivo está en su lugar, fijar el calentador objetivo alrededor del collar.
2. Confirmar que el objetivo es bajado por completo antes de asegurar la incubadora etapa en la ranura etapa. Vierta agua destilada en las entradas de la etapa de la incubadora de manera uniforme para evitar derrames.
3. Encienda el sistema de incubación. Abrir la válvula al depósito de CO ₂ y confirme la presión es adecuado para el sistema según las instrucciones del fabricante. Permitir cámara de un cierto tiempo para alcanzar el 5% de _CO2 y 37 ° C. Antes de añadir el plato de imagen, coloque un plato vacío en la incubadora para evitar la condensación de agua en el objetivo.
4. Energía de la fuente de láser.
5. incubadora de carga abierta y añadir aceite de inmersión de la lente. Coloque la muestra en la incubadora y estabilizar con los brazos de estabilidad o un peso plato. Elevar el objetivo hasta que el aceite se pone en contacto con la parte inferior de la muestra. switch de iluminación de luz transmitida y encontrar plano focal neuronal a través de los oculares.
6. Iniciar el software de láser y conectar con el software de control de láser. iluminación de campo amplio y seleccionar el objetivo que se usa set (100X 1.49 NA TIRF se recomienda). Cambiar el índice de refracción de la muestra (células ~ 1,38). Ajustar la intensidad del láser desmarcando "TTL" para el láser de 491 nm. Ajuste el control deslizante a 100 y luego traerlo de vuelta a un valor entre 20 - 40%. Vuelva a revisar "TTL".
7. Centrarse en la muestra de nuevo en la iluminación de luz transmitida. Ir al software de imagen y seleccione iluminación láser 491 nm y obturador abierto. Fine ajustar el punto focal del láser en el techo y centrar el punto al centro del diafragma campo cerrado con el condensador eliminado. Coloque el condensador boca abajo sobre el banco óptico, de manera que no lente de cero.
8. Reemplazar el condensador y vaya al software TIRF y establecer la profundidad de penetración (PD) a 110 nm. Interruptor de la iluminación de campo amplio de Illum TIRFmodo minación para formación de imágenes.
9. Encuentra VAMP2-pHluorin las células que expresan a través de los oculares de campo amplio uso de epifluorescencia con fuente de luz de epifluorescencia.
   1. Ajustar los parámetros de imagen (tiempo de exposición, la ganancia y la potencia del láser) para maximizar la relación señal-ruido y rango dinámico utilizando el tiempo de exposición mínima y la intensidad del láser para reducir photobleaching y fototoxicidad (por ejemplo: una exposición de entre 50 - 100 ms, con un 15 - 30 obtener al 30% como máximo la potencia del láser).
   2. Ajuste de enfoque automático continuo por célula. Adquirir una imagen de conjunto con Timelapse de adquisición se produce cada 0,5 segundos durante 5 minutos. Para la condición de netrina-1 estimulada, añadir 500 netrina-1 ng / ml a placa de células en una campana de flujo laminar y devolver el plato a la incubadora durante 1 h antes de la formación de imágenes.
10. Para cuantificar la frecuencia de eventos exocytic normalizados por área de la celda y el tiempo, las pilas de imágenes abiertas en ImageJ arrastrando el archivo a la ventana o ir a Archivo> Abrir> Nombre de archivo (Figura0; 2A recuadro 1).
    1. Para eliminar las señales fluorescentes estables que no representan eventos de fusión de vesículas, cree una proyección promedio z de toda la pila usando Imagen> Pila> Z-Proyecto> Tipo de proyección: Intensidad Media. Restar esta imagen media de cada imagen en el timelapse usando procesos> Calculadora de imágenes> Imagen1: Operación su pila: restar Image2 proyección z promedio de nueva creación. Esto pone de relieve los acontecimientos exocytic (Figura 2A de la inserción 2 - 3).
    2. Contar los eventos de fusión exocytic por ojo. Eventos exocytic se definen como la aparición de una señal de fluorescencia de difracción limitada, que se difunde rápidamente como VAMP2-pHluorin se difunde dentro de la membrana plasmática (Figura 2A recuadro 6).
    3. Utilice el comando Umbral para resaltar la primera imagen usando Imagen> Ajustar> Umbral> ajustar el control deslizante hasta que toda la célula es resaltada umbral (Figura 2A Recuadro 7 - 8).
    4. bajo Analizar, seleccionar y comprobar SetMeasurements área y etiqueta de visualización. Seleccione el área celular de umbral utilizando la herramienta varita rastreo y presione 'm' para medir (Figura 2A Recuadro 7 - 8).
    5. Mezclar las dos cuentan los eventos de fusión exocytic, las mediciones de área celular, y el tiempo transcurrido de imágenes a una hoja de cálculo para calcular el número de eventos exocytic / ^mm2 / hora (Figura 2A recuadro 9).

4. contraste de interferencia diferencial (DIC) Timelapse Microscopía de Axon ramificación

Nota: Un protocolo completo y demostración de un enfoque general de formación de imágenes DIC está disponible ^12. Mientras que este protocolo utiliza DIC, otros métodos de microscopía de luz transmitida pueden utilizarse para los mismos fines (por ejemplo: de contraste de fase).

1. A las 2 DIV, el plato de cristal lugar de imágenes de fondo que contiene las neuronas transfectadas en cámara ambiental pre-calentado para mantener un env húmedoironment con 5% de _CO2 y 37 ° C. Utilizar un microscopio equipado con un Plan de 60X-Apocromático, 1.4 lente objetivo NA DIC y alta del condensador NA para la mejor calidad de imagen y resolución.
2. Ajustar el plano focal para encontrar las neuronas a través de los oculares utilizando iluminación de luz transmitida.
3. Uso de la función multi adquisición zona en software de imágenes, encontrar y salvar a los lugares XYZ de al menos 6 células. Coloque el escenario para que las neuronas de interés quepan dentro del campo de visión para obtener los mejores resultados.
   1. Estimular con 250 ng / ml netrina-1 y pulse 'iniciar la adquisición de múltiples área'. adquirir imágenes secuencialmente en cada posición cada 20 segundos durante 24 horas, haciendo una pausa adquisición y reorientación como sea necesario.
4. Revisar las imágenes en el software de imágenes utilizando Aplicaciones> revisión de datos> nombre de archivo abierto Multi Dimensional. Identificar las ramas del axón estables (20 m de largo) que se forman durante la sesión de imágenes. Utilice la herramienta de línea de drenaje para medir una branc stableaxonh desde la base en el axón hasta la punta para asegurar que se cumpla la longitud de calificación de 20 micras.
   1. En una hoja de cálculo, registre el número de trama después de la estimulación netrina cuando protuberancias de la membrana inician en zonas en las ramas más tarde forman, así como el número de trama después de la estimulación netrina cuando nacientes ramas alcanzan los 20 m de longitud.
   2. Multiplicar el número de fotogramas entre la protrusión y la formación de la rama por 20 segundos para calcular el tiempo de formación por cada rama.

5. Las manipulaciones toxina y Inmunofluorescencia teléfono fijo

1. A las 2 DIV, el tratamiento de las neuronas en condiciones experimentales con 250 ng / ml netrina-1 y / o 10 nM de toxina botulínica A (TBA), que escinde la proteína SNARE SNAP25 y efectivamente inhibe la exocitosis mediada por SNARE ^13, más 250 ng / ml netrin- 1. Deja un conjunto de neuronas no tratadas como condición de control.
   PRECAUCIÓN: BoNTA requiere el uso de protección ocular y respiratoria cuando la preparación y usosoluciones. Mantener todos los materiales contaminados como material de riesgo biológico y autoclave tan pronto como sea posible.
2. A las 3 DIV (tratamiento post 24 h) medios de aspirado, y vuelva a colocar inmediatamente con al menos 1 ml de solución PHEM (véase la Tabla 1 para más detalles) se calienta a 37 ° C. Incubar durante 20 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
3. Enjuagar 3 veces con PBS (para una futura utilización del sello con parafilm y se almacena a 4 ° C).
4. Coloque los cubreobjetos en la cámara de tinción oscura, humidificado y permeabilizar las membranas de las células durante 10 min en recién diluido 0,2% Triton X-100 en PBS (hecho de 10% Triton X-100 de valores).
5. Retire la solución de permeabilización y enjuague con 50 l de 1x con PBS. Bloquear durante 30 min en ~ 50 l de 10% de albúmina sérica bovina en PBS (BSA-PBS) o 10% hervidos burro suero en PBS a RT.
6. Enjuague con 1x PBS de nuevo. Incubar cubreobjetos en 50 l de anticuerpo primario (1: 1000 βIII tubulina, para confirmar la identidad neuronal) en 1% BSA-PBS durante 1 hora a RT, en la oscuridad.
7. Realizar 3 x 5 min lavados en PBS. Incubar cubreobjetos en 50 l de anticuerpo secundario espectralmente distinta de la tubulina (1: 400), y faloidina fluorescente (varía por excitación: 488 faloidina a 1: 400, 647 faloidina en 1: 100) en 1% BSA-PBS durante 1 hr .
8. Lavar 3x 5 min en 1 x PBS y montar los cubreobjetos sobre portaobjetos en medio de montaje.
9. el exceso de vacío del material de montaje de los bordes del cubreobjetos y el sello con esmalte de uñas transparente.
10. Recoger las imágenes de campo amplio de epifluorescencia en un microscopio invertido con un objetivo de 40X 1.4NA, las capacidades de epifluorescencia y EM-CCD.
    1. analizar manualmente ramificación usando ImageJ. Pilas de imágenes abiertas en ImageJ arrastrando el archivo a la ventana o ir a Archivo> Abrir> Nombre de archivo (Figura 4A recuadro 1).
    2. El uso de la línea> línea segmentada, trace el axón, que se define como la neurita más larga que se extiende desde el soma (Figura 4A recuadro 2 - 3).
    3. Utilizando Análisis> Herramientas> Administrador de retorno de la inversión, guardar el axón de rastreo como una región de interés. Rastrear y guardar cada rama axón, que se define como una de las neuritas ≥20 micras de longitud. Incluir ramas solamente primarios (excrecencias que brotan directamente desde el axón) en el análisis (Figura 4A inserción 3-4).
    4. Pulse 'm' para medir las regiones guardados de interés, y la transferencia de longitudes en píxeles a una hoja de cálculo para calcular la longitud en cm.
    5. Se divide el número de ramificaciones del axón ≥20 micras de longitud, por la longitud del axón en micras dividido por 100 para obtener el número de ramificaciones del axón por 100 m de longitud.

Resultados

Utilizando técnicas bioquímicas in vitro para ensayar la cantidad de complejos SNARE SDS-resistentes en una población de neuronas. La figura 1 muestra la transferencia de Western resultante después de la terminación de la SNARE complejo de ensayo SDS-resistente probaron para SNAP-25, y Sintaxina1A VAMP2.

Microscopía TIRF en la membrana celular basal proporciona imágenes de alta resolución de los event...

Discusión

La ramificación de los axones es un proceso fundamental del neurodesarrollo y sustenta la vasta neuroconectividad del sistema nervioso de los mamíferos. Comprender los mecanismos involucrados en la expansión localizada de la membrana plasmática es parte integral de nuestra comprensión del neurodesarrollo normal y patológico. El uso de un enfoque múltiple que incorpora metodologías a nivel de población y a nivel de célula única mejora la reproducibilidad y aumenta la resolución espacial y temporal sin comprometer el análi...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas tratadas con cultivo de tejidos de 6 pocillos	Olympus Plastics	25-105
cubreobjetos de vidrio	Fisher scientific	12-545-81	12CIR-1.5; deben tratarse con ácido nítrico durante 24 horas, enjuagarse con agua desionizada 2 veces y secarse antes de su uso. Debe recubrirse con 1 mg/ml de poli-d-lisina y enjuagarse antes de la siembra de las celdas.
Amaxa nucleofección	solución	Lonza VPG-1001	100 ml/transfección
Amaxa Nucleofector/electroporador	Lonza		program O-005
35 mm Placas de imagen de células vivas con fondo de vidrio	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	debe recubrirse con 1 mg/ml de poli-d-lisina y enjuagarse antes de la siembra de las células
Microscopio invertido Olympus IX81-ZDC2	Olympus
Lámpara de xenón Lambda LS	Sutter Instruments Company
Incubadora superior de etapa ambiental	Tokai Hit
100x 1.49 NA Objetivo TIRF	Olympus
Andor iXon EM-CCD	Andor
Odyssey Licor Sistema de imágenes infrarrojas	LI-COR	Odyssey CL-X	Se utiliza para escanear manchas
Estudio de imagen paquete de software	LI-COR		Se utiliza para escanear en el sistema de infrarrojos Odyssey; Image studio lite utilizado para el análisis fuera de línea de manchas
Metamorph para Olympus	Molecular devices, LLC	versión 7.7.6.0	Software utilizado para todas las imágenes y el análisis de DIC timelapse Software de
control CELL TIRF	Olympus		Software utilizado para controlar láseres para imágenes TIRF
Fiji (Imagen J)	NIH	ImageJ Versión 1.49t
60x Plan Apochromat 1.4 NA objetivo	Olympus
40x 1.4 NA Plan Objetivo apocromático	Olympus
Medios neurobasales	GIBCO	21103-049	Solución base para medios de enfriamiento sin suero y tripsina
Suplemento B27	GIBCO	17504-044	500 ml/50 ml Medios sin suero y medios de enfriamiento con tripsina
L-Glutamina		35050-061	1 ml/50 ml Medios sin suero
Albúmina sérica bovina	Bio Basic Incorporated	9048-46-8	Solución al 10% en 1x PBS para el bloqueo de cubreobjetos; solución al 5% en TBS-T para el bloqueo de membranas de nitrocelulosa.
10x  tripsina	Sigma	59427C
HEPES	CELLGRO	25-060-Cl
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)+ Ca + Mg	Corning	21-030-cm
Suero fetal bovino	Corning/CELLGRO	35-010-CV
Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)	Corning/CELLGRO	20-021-CV
NaCl	Fisher científico	BP358-10
EGTA	Fisher científico	CAS67-42-5
MgCl2	Fisher científico	BP214-500
TRIS HCl	Sigma	T5941-500
TRIS base	Fisher científico	BP152-5
N-galato de propilo	MP Biomedicals	102747
Glicerol Grado fotométrico	Acros Organics	18469-5000
Glicerol (grado no óptico)	Fisher scientific	CAS56-81-5
B-mercaptoethonal	Fisher scientific	BP176-100
SDS	Fisher scientific	BP166-500
Agua destilada	GIBCO	152340-147
Poly-D-Lisina	Sigma	p-7886	Disuelto en agua estéril a 1 mg/ml
Toxina botulínica A Lista BoNTA	Laboratorios Biológicos	128-A
Conejo policlonal anti VAMP2	humano Señalización celular	11829
Ratón monoclonal anti rata Sintaxina1A	Santa Cruz Biotechnology	sc-12736
Cabra policlonal anti humano SNAP-25	Santa Cruz Biotechnology	sc-7538
Ratón monoclonal anti humano y beta; III-tubulina	Covance	MMS-435P
Alexa Fluor 568 y Alexa Fluor 488 faloidina, o Alexa Fluor 647	Invitrogen
LI-COR IR-dye anticuerpos secundarios	LI-COR	/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022	800 burro anti-ratón, 680 burro anti conejo, 680 burro anti cabra
0.2 μ m tamaño de poro membrana de nitrocelulosa	Biorad	9004-70-0
Tween-20	Fisher scientific	BP337-500
Metanol	Fisher scientific	S25426A
Bromphenol Blue	Sigma	B5525-5G
Sacarosa	Fisher scientific	S6-212
Paraformaldehído	Fisher scientific	O-4042-500
Triton-X100	Fisher scientific	BP151-500
TEMED	Fisher scientific	BP150-20
40% Bis-Acrylimida	Fisher scientific	BP1408-1
Name	Company	Número de catálogo	>Comments
>Alternative Validated Antibodies
Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clon	Sigma Aldrich	S0664
Sinaptobrevina 2 monoclonal de ratón (VAMP2)	Sistemas sinápticos	104-211
sinápticos	monoclonales de ratón SNAP25	111-011