Análisis de retrotransposition LINE-1 en el Núcleo Un piso

Resumen

Aquí empleamos la metodología FISH para realizar un seguimiento de retrotransposition LINE-1 a nivel individual en el cromosoma núcleos diferenciales de líneas de células HepG2 que expresan de forma estable LINE-1 sintético.

Resumen

elemento nuclear intercalado de largo (Línea-1 o L1) representa aproximadamente el 17% del ADN presente en el genoma humano. Si bien la mayoría de los L1s están inactivos debido a truncamientos 5', ~ 80-100 de estos elementos permanecen competentes para la retrotransposición y se propagan a diferentes lugares en todo el genoma a través de intermediarios de ARN. Si bien se cree que las L1 más antiguas se dirigen a regiones ricas en AT del genoma, los objetivos cromosómicos de las L1 más nuevas y activas siguen estando mal definidas. Aquí describimos la metodología de hibridación fluorescente in situ (FISH) que se puede utilizar para rastrear los patrones de inserción de L1 y las tasas de incorporación ectópica de L1 a nivel de núcleo único. En estos experimentos, se emplearon sondas de neomicina marcadas con isotiocianato de fluoresceína/cianina-3 (FITC/CY3) para rastrear la retrotransposición de L1 in vitro en células HepG2 que expresan L1 ectópica de manera estable. Esta metodología evita errores en la estimación de las tasas de retrotransposición planteadas por la toxicidad y tiene en cuenta la ocurrencia de múltiples inserciones en un solo núcleo.

Introducción

Humana largos períodos de actividad nuclear Elemento-1 (Line-1 o L1) es un elemento móvil autónomo que se propaga dentro del genoma a través de un "copiar y pegar" mecanismo de retrotransposition. A L1 humana típica es ~ 6 kb de largo y consiste en una 5'UTR (región no traducida) que sirve como un promotor, dos marcos de lectura abierta (ORFs): L1 y L1 -ORF1 -ORF2, y una 3'UTR con un polyA . cola de la proteína L1 -ORF1 tiene tres dominios distintos: un dominio de bobina de la bobina, el reconocimiento de ARN motivo y dominio C-terminal, mientras que la proteína L1 -ORF2 tiene endonucleasa, la tra....

Protocolo

NOTA: Todas las etapas debe llevarse a cabo a temperatura ambiente a menos que se especifique lo contrario. Por favor refiérase a la sección Reactivos para obtener más información sobre cómo preparar reactivos individuales.

1. Etiquetado L1 Sondas

NOTA: Las sondas pueden marcarse mediante marcaje químico o PCR.

1. etiquetado químico
   1. Hacer 0,7-1% en gel de agarosa en tampón Tris-acetato-EDTA (TAE), el calor en el microondas hasta que se derrita, permita que el gel se enfríe, y luego añadir bromuro de etidio (0,5 mg / ml). Vierta la mezcla en la bandeja de gel, añadir p....

Resultados

Un diagrama esquemático del vector retrotransposition L1 se presenta en la Figura 1. El vector consiste en un gen de la neomicina en la orientación antisentido con respecto a L1 ORFs que está interrumpido por un intrón de globina en la orientación sentido y emparedada por SD y SA sitios. Cuando se integra de forma estable en un cromosoma, L1 mRNA se transcribe a partir del CMV y el promotor combinado L1-5'UTR (Figura 1). Du.......

Discusión

Metodologías como la secuenciación del genoma completo, PCR inversa y transferencia de Southern se han empleado para estudiar L1 retrotransposition. A pesar de estas metodologías son extremadamente valiosos en la localización donde se producen L1 inserciones dentro de los genomas, un desafío de confusión para todos ellos es la necesidad de la programación en silico para volver a montar secuencias. La metodología FISH aquí descrito está diseñado para complementar estos métodos, especialmente en.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Labeling Probes
Go Tag DNA polimerasa	Promega	M3178
GO Tag 10x tampón incoloro	Promega	M3178
Individual dNTP	Sigma	DNTP10	Ajuste la concentración de dATP, dGTP, dCTP a 2  mM y dTTP a 1.5  mM en agua libre de nucleasas.
dUTP-16-Biotina (0.5  mM)	Roche	11093070910
dUTP-FITC (0.5  mM)	Thermo Scientific	R0101
dUTP-CY3 (0.5  mM)	Sigma	GEPA53022
Kit de etiquetado MIRUS FISH Kit	MIRUS	MIR3625
MIRUS FISH Kit		MIRUS
NucleoSpin	Qiagen	1410/0030	Se puede utilizar cualquier reactivo de limpieza de PCR en lugar de la máquina
		PCR	Cualquier máquina termocicladora se puede utilizar para amplificar el producto de etiqueta.
Agarosa	Sigma	A9539
Preparando Spreads de cromosomas
Colcemid	Life Technologies	15212-012	Añada Colcemid directamente al medio de crecimiento hasta una concentración final de 0,4  y micro; g/ml
1  M KCl	Sigma	P9541	Diluido 1  M Solución de KCl a 75  mM solución para hacer solución hipotónica
Solución fijadora Carnoy Mezcle			3 volúmenes de metanol y 1 volumen de ácido acético para hacer la solución fijadora Carnoy. Hazlo fresco cada vez.
Metanol	Sigma	322415
Ácido acético	Sigma 320099
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	Disuelva Hoechst-33342 en PBS hasta una concentración final de 1  mg/ml.
Marcador de punta de diamante	Thermo Scientific	750
Portaobjetos esmerilados	Thermo Scientific	2951-001
Tripsina-EDTA (0,25%)	Life Technologies	R001100	Para destechar las células, incubar la célula en tripsina durante 5 min e inactiva con el mismo volumen de medio completo.
Portaobjetos	VWR	48366067
Coplin Jars	Thermo Scientific	107
Heat Block			Cualquier bloque de calor se puede utilizar para este fin, aunque se recomiendan los bloques instalados para calentar los bloques.
Vaso de precipitados (600  ml)	Sigma	CLS1003600	Llene el vaso de precipitados con agua, caliente hasta hervir, use el vapor caliente para reventar los cromosomas.
Microscopio	Nikon Nikon	125690	Se puede utilizar cualquier microscopio para observar la calidad de la propagación.
Reactivos y materiales para FISH
trisódico	Sigma	S1804
Cromido de sodio	Sigma	S3014
Formamida	Sigma	F9037
Tween-20	Sigma	F1379
Detran Sulfato	Sigma	D8906
	SDS Sigma	L3771
Tecnologías de vida de ADN de esperma de salmón		15632-011
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma	A8531
HCl (N)	Sigma	38283
Alcohol etílico	Sigma	459844
metanol	Sigma 322415
DPBS	Life Technologies	14190-250
NaOH	Sigma	S8045
Rnase A	Sigma	R4642
Pepsin	Sigma	P6887
Paraformaldehído (PFA)	Sigma	P6148
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	Disolver Hoechst-33342 en PBS hasta una concentración final de 1  mg/ml.
Cemento de caucho/sellador Cytobond		2020-00-1
Siete frascos Coplin	Thermo Scientific	107
Dark	Sigma	CLS2551
Portaobjetos de cubierta	VWR	48366067
Bloque de calor digital seco	VWR	13259
Microscopio
20x Citrato de sodio salino (20x SSC)			Combine 175 g de NaCl y 88.2  g de citrato trisódico con 800 ml de H2O. Remover ajustando a pH 7. Una vez que todas las sales se disuelvan, ajuste el volumen a 1 L y filtre a través de 0.22 µ m Papel de filtro. Almacenar a 4 °C.
1  mg/ml de Rnasa A			Diluya 20x tampón SSC a 2x tampón SSC. Disuelva la RNasa A en tampón SSC 2x hasta una concentración final de 1  mg/ml. Prepare una solución nueva cada vez.
Pepsina			Disuelva la pepsina (W/V) en 10 mM de HCl hasta una concentración final de solución al 1%. Hazlo fresco cada vez.
4% Paraformaldehído (4% PFA)			Pesar 4,0 g de PFA en la campana extractora, agregar 50 ml de 1xPBS, calentar a 60  ° C mientras remueve y ajuste el pH con gotas de NaOH hasta que todo el PFA se disuelva y la solución se vuelva clara. Ajuste el volumen a 100   ml, filtro a través de 0.22 y micro; m Papel de filtro y almacene alícuotas de 5 ml a -20  °C. Descongelar la alícuota de PFA en 37 ° C durante 10-15 min para usos posteriores. Ajuste el tamaño del filtro en función de la cantidad de paraformaldehído.
Combine			100 ml de formamida (20%) con 2,5 ml de SSC 20x, ajuste a pH 7 con 1,0 M HCl y lleve el volumen a 500 ml con grado molecular H2O.
Combine			50% de formamida, 10% de sulfato de dextrano, 0,1% de SDS y 300 ng/ml de ADN de esperma de salmón en 2x tampón SSC. La cantidad de formamida determina qué tan enfocadas están las cromátidas; Titula la cantidad.
Tampón			: diluya el tampón SSC 20x a 4x y agregue 0.2% Tween-20 para crear tampón de detección.
Combine			5% de albúmina sérica bovina (BSA) con un 0,2% de Tween-20 en 4 tampones SSC.
Solución deshidratante Prepare			soluciones de etanol al 70%, 80% y 95%.

de etiquetado de limpieza de PCR MIR3225 de del kit de limpieza de PCR NucleoSpin fuerte> Cámara humidificada de fluorescencia al 1% de detección un