Artículo de método

Transcriptoma de perfiles de In-Vivo Productos fabricados preimplantación de embriones bovinos mediante plataforma de microarrays de dos colores

DOI:

10.3791/53754

⸱

30 de enero de 2017

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1Department of Agricultural, Food and Nutritional Science, University of Alberta, 2Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry, 3Laboratory of Functional Genomics of Early Embryonic Development, Université Laval

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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La tecnología de microarrays permite la medición cuantitativa y el perfil de expresión génica de transcripciones en todo el genoma. Por lo tanto, este protocolo proporciona un procedimiento técnico optimizado en una matriz bovina personalizada de dos colores utilizando embriones bovinos de día 7 para demostrar la viabilidad de usar una baja cantidad de ARN total.

Resumen

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La pérdida embrionaria temprana es un gran contribuyente a la infertilidad en el ganado. Además, el bovino se convierte en un modelo interesante para estudiar el desarrollo embrionario preimplantacional humano debido a su proceso de desarrollo similar. Aunque se sabe que los factores genéticos afectan el desarrollo embrionario temprano, el descubrimiento de tales factores ha sido un serio desafío. La tecnología de microarrays permite la medición cuantitativa y el perfil de expresión génica de los niveles de transcripción en todo el genoma. Una de las principales decisiones que hay que tomar a la hora de planificar un experimento de microarrays es si se va a utilizar un enfoque de uno o dos colores. El diseño de dos colores aumenta la replicación técnica, minimiza la variabilidad, mejora la sensibilidad y la precisión, así como permite tener diseños de bucle, definiendo las muestras de referencia comunes. Aunque los micromatrices son una poderosa herramienta biológica, existen posibles escollos que pueden atenuar su poder. Por lo tanto, en este documento técnico demostramos un protocolo optimizado para la extracción, amplificación, etiquetado, hibridación del ARN amplificado marcado a la matriz, escaneo de la matriz y análisis de datos utilizando la estrategia de análisis de dos colores.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La pérdida embrionaria temprana en vacas lecheras de alta producción es uno de los principales retos en la industria láctea 1, 2. Bovina se ha convertido en un modelo interesante para estudiar el desarrollo de preimplantación de embriones humanos debido a su proceso de desarrollo similares 3, 4. Sin embargo, se requiere más investigación para tener una mejor comprensión acerca de los genes implicados en el desarrollo embrionario temprano bovina.

Después de veinte años desde la primera tecnología de microarrays desarrollaron en 1995 5, el desarrollo de más sofisticada tecnología de sonda de fabricación reducidos errores de impresión y la variabilidad de los chips de matriz dentro y entre las diferentes plataformas de microarrays 6. La tecnología de microarrays mejorada dio como resultado una amplia aplicación de esta tecnología en la investigación clínica 7 y, más recientemente, en embrión temprano qevaluación uality 8.

La gran cantidad de material necesario para la tecnología de microarrays es la razón principal por la que la tecnología de microarrays inicialmente no introduzca un número de campos de investigación tales como el desarrollo embrionario temprano. Más recientemente, los métodos de amplificación de ARN se han mejorado para amplificar linealmente ARN hasta el nivel de microgramos de sub-nanogramos material de partida 9 ARN. Hay varios kits de amplificación de ARN comerciales disponibles en el mercado; sin embargo, las más populares kits bien desarrollados están relacionados con Ribo-cebador único amplificación isotérmica 10 y 11 impulsadas promotor T7 métodos. El más popular de amplificación del ARN antisentido utiliza la transcripción in vitro con un cebador oligo dT que une a un promotor de T7 en el extremo 5 12. Esta tecnología permite mantener la mayor parte de las transcripciones antisentido representativas después de la amplificación lineal fo matrices de hibridación 13. Este método ha sido adaptado para amplificar el nivel de picogramos de ARN total extraído de embriones bovinos 8.

Sistema de elevador universal (ULS) es el método de marcaje que incorpora directamente el ADN o ARN amplificado con colorante fluorescente de platino ligado ya sea Cyanine 547 o Cyanine 647, formando un enlace de coordinación en la posición N7 de la guanina 14. Este método fue adaptado en la investigación de embriones para generar más estable amplificada Arna sin modificaciones en comparación con el aminoallyl modificó Arna generado por el método enzimático 15. Ambos métodos único colorante y etiquetado dos colorantes se han adaptado utilizando Sistema de Enlace Universal de microarrays. Un amplio estudio de microarrays comparaciones fue que existe una buena correlación entre la calidad de datos entre las plataformas de gama de uno y de dos colores 6.

Recientemente, tanto en coche T7 promotormétodos n RNA antisentido de amplificación y etiquetado ULS se han desarrollado para proporcionar un protocolo más fiable para generar una cantidad suficiente de materiales de alta calidad marcado ARNa para microarrays de hibridación 8, 16. Por lo tanto, este estudio proporciona un protocolo para demostrar algunas de las etapas importantes de la extracción de ARN para el análisis de datos de microarrays involucrado en dos colores usando Día 7 embriones bovinos como un ejemplo.

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Protocolo

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La parte animal de este estudio se llevó a cabo en la Unidad de Investigación Metabólica de la Universidad de Alberta, Edmonton, Canadá, con todos los procedimientos experimentales animales aprobados (Protocolo # AUP00000131) por la Universidad de Alberta Cuidado de Animales y el empleo, y los animales atendidos de acuerdo al Consejo canadiense de manejo de estos animales (1993).

1. Embriones producción, aislamiento de ARN total y tratamiento con DNasa

  1. Para los protocolos experimentales animales y recogida de embriones consulte en nuestras publicaciones anteriores 17, 18.
  2. Piscina y congelamiento rápido embriones etapa similar de cada vaca en nitrógeno líquido y luego mantener a -80 ° C hasta la extracción de RNA.
  3. Extraer el ARN total a través de un kit de extracción de ARN basado en columnas, que permite extraer el ARN de muestras de pico-escala (kit de información está disponible en la lista de materiales).
    NOTA: Se recomienda kit contiene: Tampón acondicionado, extracción Buffer, etanol al 70%, tampón de lavado 1, el tampón de lavado 2, tampón de elución, columnas de purificación de ARN con tubos de recogida y tubos de microcentrífuga.
  4. Añadir 10 l tampón de extracción de embriones que contienen los tubos e incubar durante 30 minutos a 42 ° C. Tubo de centrífuga a 800 xg durante 2 min para recoger extracto de células en el tubo de microcentrífuga.
  5. Pipetear 250 l acondicionado Buffer sobre la membrana de filtro de la columna de purificación. Incubar la columna de purificación de ARN con acondicionado Buffer durante 5 min a temperatura ambiente. Centrifugar la columna de purificación en el tubo de recogida a 16.000 xg durante 1 min.
  6. Pipeta de 10 l de 70% de etanol en la mezcla de tampón de extracción de ARN y embriones. Mezclar bien pipeteando arriba y abajo. mezcla de la pipeta en la columna de purificación previo de adaptación.
  7. Para enlazar ARN, centrífuga de la columna de purificación de 2 min a 100 xg y seguir inmediatamente por una centrifugación a 16.000 xg durante 30 s para eliminar el flujo a través.
  8. Pipetear 10081; L de tampón de lavado 1 en la columna de purificación y centrifugar durante 1 min a 8.000 x g.
    Se recomienda DNasa tratamiento si la realización de la transcripción inversa o amplificación después de aislamiento de ARN: NOTA.
  9. Digerir el ADN genómico de la derecha después del paso 1.8.
    NOTA: Se recomienda DNasa kit está disponible en la lista de materiales. Set recomendado contiene: DNasa I y solución madre de tampón.
  10. Preparar la mezcla de incubación ADNasa mediante la mezcla de 5 l DNasa I de solución madre con 35 l de tampón. Mezclar suavemente por inversión.
  11. Pipetear la mezcla de incubación 40 l de DNasa directamente en la membrana de la columna de purificación. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
  12. Pipeta de 40 l de tampón de lavado 1 en la membrana de la columna de purificación y centrifugar a 8000 xg durante 15 s.
  13. Pipetear 100 l de tampón de lavado 2 a la columna de purificación y centrifugar durante 1 min a 8.000 x g.
  14. Pipetear otros 100 l de tampón de lavado 2 en la columna de purificación y centrifugardurante 2 minutos a 16.000 x g.
  15. Transferir la columna de purificación a un nuevo tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Pipetear 11 l de tampón de elución directamente sobre la membrana de la columna de purificación. Para asegurar la máxima absorción de tampón de elución en la membrana, toca suavemente la punta de la pipeta a la superficie de la membrana mientras dispensa el tampón de elución.
  16. Incubar la columna durante 1 min a temperatura ambiente. Centrifugar la columna durante 1 min a 1000 xg para distribuir tampón de elución en la columna, y luego girar durante 1 min a 16.000 xg para eluir el ARN.
  17. Utilice instrumento Bioanalyzer de acuerdo con las instrucciones del fabricante para evaluar la calidad y la cantidad 19 de ARN.
  18. Almacenar la muestra de ARN a -80 ° C hasta su uso.

2. La amplificación de ARN y etiquetado de los análisis de microarrays

NOTA: Para el usuario por primera vez que trabaja con procedimientos de amplificación de ARN y etiquetado, utilizar cinco ng de ARN espiga-en along con las muestras reales ARNa para supervisar la medición de control de calidad de la amplificación del ARN y la hibridación. La espiga-en la mezcla de ARN contiene diez sintetizados, polyadenylated transcripciones in vitro en relaciones predeterminadas. Cuando el procedimiento se realiza correctamente, los transcritos marcados se hibridan específicamente sólo para sondas de control complementarios en las matrices y los datos pueden ser escaneados para realizar un seguimiento de garantía de control de calidad con auto mínima o la hibridación cruzada. Más detalles sobre el procedimiento descripción de pinchos-en intensidades de control y normalización después de escanear la matriz y el análisis de datos se refiere a las publicaciones anteriores 20, 21. El siguiente procedimiento se da a los usuarios de microarrays de rutina.

  1. Preparar (valor de número de RNA de Integridad (RIN) al menos> 7,0) 100 pg de alta calidad de la muestra de ARN en un volumen total de 10 - 11 l.
  2. Amplificar las muestras de ARN con un kit de amplificación de podertrabajar con muestras de pico-escala (tan poco como 100 pg).
    NOTA: Se recomienda kit de amplificación de la información está disponible en la lista de materiales y sigue las instrucciones del fabricante, sin ninguna modificación.
  3. Utilice una cuantificación basada en fluorescencia para evaluar el perfil de la gama de tamaños de la ARNa amplificado.
  4. Utilizar el aparato espectrofotómetro (basado en la absorbancia a 260 y 280 nm) para medir la concentración del ARNa amplificado.
  5. Almacenar el ARNa amplificado a -80 ° C hasta que esté listo para el etiquetado.
  6. Utilizar 2 g de ARN amplificado para el marcaje fluorescente de acuerdo con ULS Arna guía de usuario del equipo de etiquetado.
    NOTA: Desde Cyanine 547 y 647 de tinte de cianina son sensibles a la fotodegradación y Cyanine 647 colorante se degrada fácilmente por el ozono, el procedimiento se lleva a cabo el etiquetado en una cantidad mínima de luz y bajo un ambiente libre de ozono.
  7. Encienda la caja de ozono (Figura 1A) hasta que el nivel de ozono es de 0.001 ppm.
  8. do la configuración de la reacción dentro de la caja de ozono (Figura 1B) mediante la adición de 2 l de Cyanine 547 o Cyanine 647, 2 l de tampón de etiquetado, y luego ajustar a un volumen final de 20 l con agua libre de RNasa bajo la luz de seguridad. Añadir filtro de cuarto oscuro para la fuente de luz.
  9. Mezclar suavemente y se incuban los tubos en un termociclador a 85 ° C durante 15 min. Colocar las muestras en hielo durante al menos 1 min. Centrifugar para recoger el contenido de los tubos antes de proceder con el kit de extracción de ARN, excepto pasos relacionados con el tratamiento de DNasa (1,9 a 1,11), para limpiar el ARN amplificado marcado con Cy-tinte.
  10. Utilizar el aparato espectrofotómetro para medir y determinar la concentración de ARN amplificado marcado y mantener el ARNa marcado a -80 ° C como máximo durante 3 días antes de su uso.

3. microarrays de hibridación y lavado

NOTA: Los siguientes pasos importantes se adaptan de acuerdo a protocolo de análisis de dos colores basados ​​en microarrays de expresión de genes (versión6.5, mayo de 2010).

  1. Añadir la misma cantidad de 825 ng de cada Cyanine 547- 647 y Cyanine marcado con Arna y mezclar con 25x 10x fragmentación y tampones de bloqueo.
  2. Se calienta la mezcla a 60 ° C durante 15 minutos y dejar enfriar sobre hielo durante 1 min.
  3. Añadir la misma cantidad de tampón de hibridación 2x ​​y mezclar bien.
  4. Centrifugar a 13.000 rpm, a continuación, la mezcla está lista para la hibridación.
  5. Cargar 100 l de la mezcla sobre el portaobjetos matriz y sellar la diapositiva dentro de la cámara de hibridación.
  6. Carga de la cámara montada en el horno de hibridación durante 17 horas a 65 ° C que gira a 10 rpm en el horno.
  7. Se lavan las matrices de acuerdo con el protocolo de tratamiento con la protección del ozono mediante la sumersión en la estabilización y la solución de secar durante 30 s.
  8. Retire las matrices de la solución y asegúrese de que la superficie de la matriz es seco, sin partículas de polvo

4. Digitalización de microarrays de diapositivas

  1. Mantenga las matrices en un lugar oscuro y encienda scanner hasta que está listo para usar (15 min tiempo de espera).
  2. Cargar el código de barras de matriz a la izquierda, en el escáner y comenzar a escanear. Hacer el análisis in situ conforme a la guía de usuario del software y guardar los datos como (GPR) formato de archivo.

5. Análisis estadístico

  1. Descargar el software FlexArray http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php Haga clic en "datos en bruto de importación" y cargar los archivos gpr en FlexArray.
  2. Realizar la normalización y el análisis estadístico si es necesario siguiendo las instrucciones. Nota: Se calcula el umbral para la selección punto positivo en este estudio, ya que se ha descrito previamente 22.
  3. Seleccione el menú desplegable manual desde el visor gráfico de la FlexArray para ver todos los puntos híbridas, y las señales de fondo. Nota: Un cuadro similar de pinchos en los controles después de la hibridación de la micromatriz se puede ver en estudio previo 8.
  4. Seleccione unloess normalización dentro de la matriz siguiente por un cuantil entre el proceso de normalización de las matrices de la FlexArray desplegable manual de consecuencia.
  5. Exportar todos los datos normalizados de FlexArray en un archivo Excel para su posterior uso.

6. Análisis de Bioinformática

La anotación original de las secuencias de la sonda a partir de transcritos específicos de embrión bovino (BESTv1) microarray se ha descrito previamente 8. En este estudio, se obtuvieron 20.403 símbolos de genes únicos (GS) ( Suplemento archivo1 ) a través de la información de laboratorio Sistema de Gestión de EmbryoGENE (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). Una lista de los 6.765 genes únicos ( Suplemento archivo2 fue seleccionado) y correspondió a las señales positivas después de todo proceso de normalización de microarrays (paso 50.5) de bovino Día 7 gen embriones perfil de expresión. Umbral de señal positiva se calculó basándose en la publicación permeable 16 de la intensidad de la señal de un valor A.

  1. Para realizar el análisis funcional con PANTHER (análisis de proteínas a través Relaciones Evolutivas) Clasificación del Sistema 23, 24, abra el siguiente enlace (http://www.pantherdb.org/about.jsp).
  2. Sube una lista de 6.765 GS específicos del embrión para identificar los procesos biológicos específicos durante el desarrollo embrionario mediante la prueba estadística excesiva y utilizar configuración predeterminada de Bos taurus (todos los genes en la base de datos) como lista de referencia 25.
    NOTA: Esto permite la identificación de los procesos relacionados con el desarrollo de la GO términos que son estadísticamente excesiva o insuficiente expresado mediante una prueba binomial.
  3. Establecer el umbral de valor P a <0,05 como valor predeterminado del software. Los datos pueden descargarse y exposiciónrted en un archivo de Excel para su posterior selección 16.

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Resultados

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Un resultado representativo de ARN total y se amplificó ARNa desde el día 7 embriones bovinos se muestra en la Figura 3 y resume en la Tabla 1.

integridad y el perfil de ARN pueden ser evaluados después de la extracción de RNA. Evaluación de la calidad del ARN podría hacerse mediante documento Bioanalyzer (Figura 3A) y sólo las muestras con valor superior a 7,0 RIN está califi...

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Discusión

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El primer problema para llevar a cabo el análisis de microarrays utilizando Día 7 embriones bovinos no está recibiendo cantidades suficientes de ARN de alta calidad para el estudio de la expresión génica. Tradicional fenol / cloroformo extracción de RNA y método de precipitación con etanol, no se recomienda para el día 7 embriones, lo que resulta en un bajo rendimiento y la posible inhibición de fenol restos de reacción de amplificación de ARN. En lugar de ello, un método basado en la columna estándar es mejor para aisl...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Investigación apoyada por la Agencia de Ganadería y Carne de Alberta, Alberta Innovates - BioSolutions, Alberta Milk, y la Rama de Investigación Ganadera, Alberta Agriculture and Forestry.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Kit de aislamiento de ARN PicoPureApplied BiosystemsKIT0204
juego de DNasa libre de ARNasa (50)Qiagen79254
Agilent RNA 6000 Pico KitAgilent Technologies5067-1513
Arcturus RiboAmp HS PLUS KitBiosystems Applied BiosystemsKIT0505
2100 Bioanalyzer InstrumentsAgilent TechnologiesG2940CA
Cinta de cribado de ARNAgilent Technologies5067-5576
Kit de etiquetado fluorescente ULSKreatech DiagnosticsEA-021
Micromatrices de expresión génica personalizadasAgilent TechnologiesG2514F Tampón
lavado de expresión génica Agilent 1Agilent TechnologiesParte #5188-5325
Tampón de lavado de expresión génica Agilent 2Agilent TechnologiesParte #5188-5326
2x Tampón de hibridación de altas RPMAgilent Technologies  Pieza #5190-0403
25x Tampón de fragmentosAgilent Technologies Parte#5185-5974
10x Agente de bloqueo GEAgilent Technologies Parte#5188-5281
Solución de estabilización y secadoAgilent Technologies  Pieza #5185-5979
Portaobjetos de juntas habilitados por Agilent SureHyb tecnologíaAgilent TechnologiesG2524-60012Paquete de 20 portaobjetos de juntas, 4 microarrays/portaobjetos
Kit de espiga de ARN de dos coloresAgilent Technologies  Cat # 5188-5279
Escáner de matriz GenePix 4000BDispositivos molecularesGENEPIX 4000B-U Caja
sin ozonoBandeja de biobandejaOFB_100x200
archivo GALAgilent Technologies-
de

Referencias

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