La tecnología de microarrays permite la medición cuantitativa y el perfil de expresión génica de transcripciones en todo el genoma. Por lo tanto, este protocolo proporciona un procedimiento técnico optimizado en una matriz bovina personalizada de dos colores utilizando embriones bovinos de día 7 para demostrar la viabilidad de usar una baja cantidad de ARN total.
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Artículo de método
Transcriptoma de perfiles de In-Vivo Productos fabricados preimplantación de embriones bovinos mediante plataforma de microarrays de dos colores
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En este artículo
Resumen
Resumen
La pérdida embrionaria temprana es un gran contribuyente a la infertilidad en el ganado. Además, el bovino se convierte en un modelo interesante para estudiar el desarrollo embrionario preimplantacional humano debido a su proceso de desarrollo similar. Aunque se sabe que los factores genéticos afectan el desarrollo embrionario temprano, el descubrimiento de tales factores ha sido un serio desafío. La tecnología de microarrays permite la medición cuantitativa y el perfil de expresión génica de los niveles de transcripción en todo el genoma. Una de las principales decisiones que hay que tomar a la hora de planificar un experimento de microarrays es si se va a utilizar un enfoque de uno o dos colores. El diseño de dos colores aumenta la replicación técnica, minimiza la variabilidad, mejora la sensibilidad y la precisión, así como permite tener diseños de bucle, definiendo las muestras de referencia comunes. Aunque los micromatrices son una poderosa herramienta biológica, existen posibles escollos que pueden atenuar su poder. Por lo tanto, en este documento técnico demostramos un protocolo optimizado para la extracción, amplificación, etiquetado, hibridación del ARN amplificado marcado a la matriz, escaneo de la matriz y análisis de datos utilizando la estrategia de análisis de dos colores.
Introducción
La pérdida embrionaria temprana en vacas lecheras de alta producción es uno de los principales retos en la industria láctea 1, 2. Bovina se ha convertido en un modelo interesante para estudiar el desarrollo de preimplantación de embriones humanos debido a su proceso de desarrollo similares 3, 4. Sin embargo, se requiere más investigación para tener una mejor comprensión acerca de los genes implicados en el desarrollo embrionario temprano bovina.
Después de veinte años desde la primera tecnología de microarrays desarrollaro....
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Protocolo
La parte animal de este estudio se llevó a cabo en la Unidad de Investigación Metabólica de la Universidad de Alberta, Edmonton, Canadá, con todos los procedimientos experimentales animales aprobados (Protocolo # AUP00000131) por la Universidad de Alberta Cuidado de Animales y el empleo, y los animales atendidos de acuerdo al Consejo canadiense de manejo de estos animales (1993).
1. Embriones producción, aislamiento de ARN total y tratamiento con DNasa
- Para los protocolos experimentales animales y recogida de embriones consulte en nuestras publicaciones anteriores 17, 18.
- Piscina ....
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Resultados
Un resultado representativo de ARN total y se amplificó ARNa desde el día 7 embriones bovinos se muestra en la Figura 3 y resume en la Tabla 1.
integridad y el perfil de ARN pueden ser evaluados después de la extracción de RNA. Evaluación de la calidad del ARN podría hacerse mediante documento Bioanalyzer (Figura 3A) y sólo las muestras con valor superior a 7,0 RIN está califi.......
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Discusión
El primer problema para llevar a cabo el análisis de microarrays utilizando Día 7 embriones bovinos no está recibiendo cantidades suficientes de ARN de alta calidad para el estudio de la expresión génica. Tradicional fenol / cloroformo extracción de RNA y método de precipitación con etanol, no se recomienda para el día 7 embriones, lo que resulta en un bajo rendimiento y la posible inhibición de fenol restos de reacción de amplificación de ARN. En lugar de ello, un método basado en la columna estándar es mejor para aisl.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Investigación apoyada por la Agencia de Ganadería y Carne de Alberta, Alberta Innovates - BioSolutions, Alberta Milk, y la Rama de Investigación Ganadera, Alberta Agriculture and Forestry.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Kit de aislamiento de ARN PicoPure | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| juego de DNasa libre de ARNasa (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Biosystems Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Cinta de cribado de ARN | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| Kit de etiquetado fluorescente ULS | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Micromatrices de expresión génica personalizadas | Agilent Technologies | G2514F Tampón | |
| lavado de expresión génica Agilent 1 | Agilent Technologies | Parte #5188-5325 | |
| Tampón de lavado de expresión génica Agilent 2 | Agilent Technologies | Parte #5188-5326 | |
| 2x Tampón de hibridación de altas RPM | Agilent Technologies | Pieza #5190-0403 | |
| 25x Tampón de fragmentos | Agilent Technologies Parte | #5185-5974 | |
| 10x Agente de bloqueo GE | Agilent Technologies Parte | #5188-5281 | |
| Solución de estabilización y secado | Agilent Technologies | Pieza #5185-5979 | |
| Portaobjetos de juntas habilitados por Agilent SureHyb tecnología | Agilent Technologies | G2524-60012 | Paquete de 20 portaobjetos de juntas, 4 microarrays/portaobjetos |
| Kit de espiga de ARN de dos colores | Agilent Technologies | Cat # 5188-5279 | |
| Escáner de matriz GenePix 4000B | Dispositivos moleculares | GENEPIX 4000B-U Caja | |
| sin ozono | Bandeja de biobandeja | OFB_100x200 | |
| archivo GAL | Agilent Technologies | - |
Referencias
- Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. Fertility in dairy cows: bridging the gaps. Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).
- Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions. Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006). ....
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Reimpresiones y permisos
