Preparación de la rata progenitoras de oligodendrocitos culturas y cuantificación de Oligodendrogenesis Uso del análisis de fluorescencia de doble infrarrojo

Resumen

Los oligodendrocitos son las células mielinizantes del sistema nervioso central. Este protocolo describe un método para el aislamiento y cultivo de sus precursores, células progenitoras de oligodendrocitos, a partir de cortezas de rata, así como un método cuantitativo rápido y fiable para evaluar la oligodendrogénesis in vitro en respuesta a factores experimentales.

Resumen

La oligodendrogénesis eficiente es el objetivo terapéutico de una serie de áreas de investigación, como la lesión de la médula espinal, la hipoxia neonatal y las enfermedades desmielinizantes como la esclerosis múltiple y la mielitis transversa. La mielinización es necesaria no solo para facilitar la rápida propagación de los impulsos dentro del sistema nervioso central, sino también para proporcionar soporte trófico a los axones subyacentes. Las células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) se pueden estudiar in vitro para ayudar a identificar factores que pueden promover o inhibir la diferenciación de oligodendrocitos. Hasta la fecha, muchos de los métodos disponibles para evaluar este proceso han requerido un gran número de células, lo que limita el número de condiciones que se pueden investigar en un momento dado, o métodos de cuantificación intensivos en mano de obra. En este trabajo se describe un protocolo para el aislamiento de un gran número de OPCs de alta pureza junto con un método rápido y fiable para determinar la oligodendrogénesis a partir de múltiples condiciones simultáneamente. Las OPC se aíslan de cortezas de ratas neonatales P5-P7 y se cultivan in vitro durante tres días antes de la diferenciación. Cuatro días después de la diferenciación, la oligodendrogénesis se evalúa mediante un ensayo de fluorescencia infrarroja dual para determinar la expresión de la proteína mielina.

Introducción

conducción nerviosa eficiente en el sistema nervioso central de los mamíferos (CNS) requiere la mielinización de los axones por oligodendrocitos. Durante el desarrollo, surgen los oligodendrocitos a partir de un conjunto de células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) que se cree que la migración de las zonas ventriculares del cerebro anterior en desarrollo y el tubo neural ^1. Después de los OPC de migración se diferencian en oligodendrocitos maduros, myelinating que no sólo facilitar la propagación del impulso eficiente, sino que también proporcionan los axones con soporte trófico ^2. El sistema nervioso central adulto mantiene una abundante p....

Protocolo

Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) y Johns Hopkins School of Medicine.

1. Preparación de placas de ensayo, solución madre, y OPC base para medios

Nota: La base de rata (OPC) Sato medios descritos aquí viene de los estudios previamente publicados ^12,13. formulaciones de medios alternativos también pueden ser compatibles con este procedimiento.

1. Resuspender poli-L-lisina (PLL) a una concentración de 10 mg / ml en agua desionizada estéril. Pipetear 400 l de la PLL diluido en cada pocillo de un 24 pocillos de fondo en el tejido plato ne....

Resultados

OPC A2B5-positivas se aislaron mediante selección celular positiva utilizando un sistema de separación magnética de columna. Antes del procedimiento de aislamiento, todo el cerebro se elimina de crías de rata que se encuentran entre P5 y P7. Una vez que todo el cerebro se separa con éxito desde el cráneo, los bulbos olfatorios y el cerebelo se eliminan mediante unas pinzas quirúrgicas finas (Figura 1A). Con el fin de aislar el tejido cortical cerebral el hipotálamo, tála.......

Discusión

El protocolo que se presenta aquí describe un método rápido y fiable para el aislamiento de los OPC de rata y cuantificar en oligodendrogenesis vitro en respuesta a factores experimentales. Usando la selección positiva, altos rendimientos de los OPC viables y puros se utilizan directamente para fines experimentales. Este método simplifica el aislamiento, cultivo y etapas de diferenciación en un marco de tiempo 1 semana, y las células fijadas se puede almacenar convenientemente a 4 ° C durante varias se.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
disección
PBS sin Ca2+ y Mg2+	Mediatech	21-040-CV	1x
10 cm Placas de Petri de Poliestireno
	Motic	SM2-168
Disociación Materiales
			disociación enzimática
PBS con Ca2+ y Mg2+	Corning	20-030-CV	1x
40 μ m Filtro de celdas	Corning	352340<
fuerte>A2B5 Purificación de columnas  Microperlas
Anti-A2B5	Miltenyi Biotec	130-097-864	anticuerpos A2B5 unidas a perlas
	Miltenyi Biotec	130-042-401	Columnas de selección magnética
EDTA	Corning	46-034-Cl	2 mM
PBS con Ca2+ y Mg2+	Corning	20-030-CV 1x
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A9647	0.50%
Materiales de cultivo
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	20 ng/ml
Dimetilsulfóxido	Sigma-Aldrich	D2650	Hybri-Max 100 ml
Triyodotironina	Sigma-Aldrich	T6397	45 nM
Sal de fumarato de clemastina	Sigma-Aldrich	SML0445-100MG	1 μ M
Sal de hemifumarato de quetiapina	Sigma-Aldrich	Q3638-10MG	1 μ M
N-acetilcisteína	Sigma-Aldrich	A9165	5 μ g/ml
Progesterona	Sigma-Aldrich	P8783	60 ng/ml
Poly-L-lisina	Sigma-Aldrich	P1524	10 μ g/ml
Putrecine	Sigma-Aldrich	P7505 16	μ g/ml
Selenito de Sodio	Sigma-Aldrich	S5261	40 ng/ml
Hidrocortisona	Sigma-Aldrich	H0135	50 ng/ml
d-Biotina	Sigma-Aldrich	B4639	10 ng/ml
Insulina	Sigma-Aldrich	I6634	5 μ g/ml
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1147	100 μ g/ml
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A4161	100 μ g/ml
Oligoelementos B	Corning	25-022-Cl	1x
B-27 Suplemento	Technologies	17504044	1x
Penicilina/Estreptomicina	Life Technologies	15140122	1x
DMEM	Life Technologies	11995-065	1x
Visiplate negro de 24 pocillos con tapa	Perkin Elmer	1450-605	Grado de cultivo de tejidos
Inmunocitoquímica y cuantificación
PFA	Sigma-Aldrich	100-13A	4%
Triton X-100	Sigma-Aldrich	78787	0.10%
Suero de cabra normal	Jackson Immuno Research	005-000-121	5%
monoclonal de ratón anti-MBP	Biolegend	SMI-99P	1:1.000 Dilución
policlonal anti-Actina	Santa Cruz Biotecnology	SC-7210	1:200 Dilución
conejo policlonal anti-Olig2	Millipore	AB9610 1	:1.000 Dilución
cabra anti-ratón 680RD	Licor	926-68070	1:500 Dilución
cabra anti-conejo 800CW	Licor	926-32211	Dilución 1:500
Alexa Fluor 594 cabra anti-ratón	Life Technologies	A11032	Dilución 1:1.000
Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo	Life Technologies	A11008	Dilución 1:1.000
Prolong Gold antidecoloración con DAPI	Life Technologies	P36931
DPBS con Ca2+ y Mg2+	Corning	21-030-CV
Licor Odyssey Clx Sistema de Imagen por Infrarrojos	Licor

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