La formación de imágenes reorganización espacial de una vía de señalización MAPK Usando el sistema de expresión transitoria del Tabaco

Resumen

A nivel subcelular, los eventos de señalización son modulados dinámicamente por señales de desarrollo y ambientales. Aquí describimos un protocolo que emplea el sistema de expresión transitoria del tabaco para monitorear la interacción dinámica proteína-proteína y para revelar la organización espacial de la transducción de señales en células vegetales.

Resumen

La visualización de los eventos de señalización dinámicos en células vivas ha sido un reto. Hemos ampliado un sistema de expresión transitoria establecida, el ensayo de complementación biomolecular fluorescente (BiFC) en las células epidérmicas de tabaco, de la interacción proteína-proteína de prueba para seguimiento de la distribución espacial de la transducción de señales en células vegetales. En este protocolo, se utilizó el ensayo de BiFC para demostrar que la interacción y la señalización entre la Arabidopsis MAPKKK Yoda y MAPK6 se producen en la membrana plasmática. Cuando se co-expresó el BASL andamio de proteínas, la interacción Yoda-MAPK redistribuido y espacialmente copolarizada con PPC-BASL. Este sistema de expresión del tabaco modificado permite la exploración rápida de la señalización de localización y dinámicos cambios (menos de 4 días) y puede acomodar múltiples colores de la proteína fluorescente (al menos tres). También presentamos los métodos detallados para cuantificar la distribución de proteínas (localización espacial asimétrica, o "polarización";) En células de tabaco. Este sistema de expresión del tabaco avanzado tiene un potencial de ser utilizado ampliamente para la prueba rápida de eventos de señalización dinámica en las células de plantas vivas.

Introducción

Las proteínas interactúan dentro de una red y forman intrincados complejos jerárquicos que juegan un papel fundamental en casi todos los procesos biológicos que ocurren en un entorno celular impredecible. Sin embargo, desde el desarrollo de las plantas a las respuestas de crecimiento, ha habido una falta de herramientas convenientes que no puede solo rápido, sino identificar de manera eficiente y monitorear estos eventos de señalización dinámica a nivel subcelular.

El sistema de expresión de proteína transitoria en epidermis de hojas de tabaco ha apelando ventajas para la visualización de las proteínas fluorescentes en células vivas. Este sistema proporciona semi condiciones in vivo que permiten la modificación de proteínas después de la traducción y el examen rápido de localización de la proteína. Mediante el examen de la señal de YFP complementado, la complementación fluorescente (BiFC) de ensayo bimolecular informa a la posibilidad de interacción proteína-proteína en las células vegetales. En comparación con otros métodos, por ejemplo, levadura de dos híbridos (Y2H) y co-immunoprecipitation (Co-IP), BiFC también proporciona un medio poderoso para la visualización de los compartimentos donde se pueden producir interacciones proteína-proteína a nivel subcelular.

Debido a la división celular asimétrica (ACD) mantiene vástago población de células, mientras que la generación de nuevos tipos de células para la formación de tejido / órgano, es un mecanismo indispensable para promover pluricelularidad eucariota. Desarrollo Arabidopsis estomática se ha usado como un sistema modelo para el estudio de ACD en las plantas. La célula precursora, célula madre meristemoide, divide asimétricamente para producir dos células hijas diferentes, un meristemoide (sufre vástago divisiones de células como antes de terminar en un par de células de guarda) y una célula de linaje suelo estomática (SLGC) (puede dividirse y diferenciarse en una célula de pavimento), respectivamente (Figura 1). En los estomas ACD, la novela Breaking proteína de la asimetría en el linaje de los estomas (BASL) está polarizado para conducir premitotically asimetrías de división, que incasimetría física lude y asimetría ¹ destino celular. Una cascada MAPK compuesto por el MAPKKK Yoda y las MAPKs, MPK3 y 6 es central para modelar la división de los estomas y la adopción destino ^{2,3, 4,5.}

Recientemente, Zhang et al. BASL vinculado la proteína de la polaridad de la vía de señalización YDA-MAPK en Arabidopsis estomas ACD ^6. La vía canónica Yoda-MAPK, a través de MPK3 / 6, fosforila y activa BASL su polarización. Funciones BASL fosforilados como un andamio y recluta YODA (YDA) y MPK3 / 6 para formar un complejo de proteínas y concentran la señalización en la corteza celular ^6. La polarización de los componentes de MAPK y el bucle de realimentación positiva entre BASL y la vía YDA-MAPK representa un nuevo mecanismo para la polarización de proteínas en células de plantas. Señalización de MAPK localmente enriquecido es la hipótesis de estar estrechamente vinculado a la diferenciación del destino celular en los estomas ACD ⁶ (Figura 1). Uno de los key datos experimentales que apoya este modelo vino de los ensayos de tabaco que demostraron la redistribución espacial de MAPKs inducidos por la expresión de BASL ^6.

En general, no es fácil de controlar cuando se produce la señalización de MAPK porque las moléculas de MAPK se encuentran a menudo en todas partes en el interior de una célula. En este estudio, se utilizó el sistema split-YFP de visualizar la interacción entre la quinasa aguas arriba y aguas abajo los sugerir donde se produce el relé de señalización. Hemos ampliado aún más el uso del sistema de BiFC por la co-expresión de una tercera proteína (CFP-tagged) con la división YFP par (sugestiva de la interacción proteína-proteína) para visualizar si y cómo el YFP complementado podría espacialmente modulada por la co- proteína expresada PPC. Al hacerlo, hemos demostrado que la co-expresión de PPC-BASL inducida reorganización espacial de las interacciones entre YDA y MPK6, a partir de una distribución uniforme de los patrones de polarización en la corteza celular de la epidermis del tabacocélulas al. Por consiguiente, este sistema tiene el potencial de ser desarrollado para el seguimiento de eventos de señalización dinámicos en células de la planta en condiciones cuando las células son desafiados por los estímulos internos o externos (por ejemplo, la co-expresión de otras proteínas, la aplicación química, ataque de patógenos o los cambios ambientales, etc. ).

Protocolo

1. Construcción del plásmido

1. Generar los constructos de la tecnología de clonación como se ha descrito previamente ^1,6.
   1. En primer lugar utilizar una ADN polimerasa de alta fidelidad con cebadores adecuados para amplificar las secuencias codificadoras de BASL, YDA y MPK6 y los sub-clonan en vectores de entrada. Encuentra el protocolo detallado en ^7.
   2. Para generar las versiones dominantes negativos de MPK6 y YDA (DNmpk6 ⁸ y DNyda ^4, respectivamente), utilizar los plásmidos de entrada de MPK6 y YDA como molde e introducir las mutaciones puntuales mediante un método de mutagénesis dirigida al sitio ^9.
2. Para construir las construcciones para ensayos transitorios de tabaco, llevar a cabo reacciones de RL estándar (attL x attR recombinación) (procedimiento detallado en el ⁷⁾ para integrar en BASL pH35CG ^10, DNyda y DNmpk6 en pXNGW y pXCGW vectores ^11, respectivamente.
   1. Confirmar los plásmidos resultantes de la digestión enzimática y secuenciación. Una vez successful, transformar los constructos binarios en la cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101 ¹² y cultivarlas en placas de selección a 28 ° C durante 2 - 3 días.

2. Preparación de la solución de infiltración de Agrobacterium

1. Inocular unas pocas colonias de Agrobacterium recién transformados en 10 ml de medio Luria-Bertani (LB) con los antibióticos apropiados (gentamicina 25 g / ml, rifamicina 25 g / ml, espectinomicina 100 mg / ml para pH35CG, pXNGW y pXCGW construye; las mismas concentraciones de gentamicina y rifamicina con kanamicina 50 mg / ml de P19 (que expresan las proteínas contra el silenciamiento transgénico) ^13.
2. Crecer cultivos de Agrobacterium en un agitador C 28 ° a la velocidad de 200 rpm durante aproximadamente 16 horas y después medir la OD ₆₀₀ (estimado para llegar a 1.5 a 1.8) (Figura 2A-B). Centrifugar los cultivos a 2.500 xg durante 10 min. Vuelva a suspender y wash los sedimentos celulares con 10 mM de MgCl ₂ (la solución de infiltración).
3. Centrifugar los cultivos de nuevo y vuelva a suspender los pellets con la cantidad apropiada de la solución de infiltración para llegar a la final OD ₆₀₀ = 0,5 (Figura 2C-D). Antes de la infiltración de las plantas, dejar las mezclas de células a temperatura ambiente por 1 - 3 horas. Este paso ayuda a mantener la homeostasis celular.

3. planta de tabaco y la hoja de Inyección

1. Use plantas de tabaco (Nicotiana benthamiana) que se cultivan 4 - 5 semanas de edad, en una cámara de crecimiento de plantas estándar (23 ° C con ciclos de 16 h luz / 8 h oscuridad) ¹⁴ para la inyección de la hoja.
   Nota: En esta etapa, las plantas de tabaco suelen tener 6 hojas (2 grandes, 2 medianas y 2 pequeñas). Las dos hojas de tamaño medio son los más óptimo para la inyección de la hoja (los dos más grandes son demasiado viejos, mientras que los dos más pequeños son a menudo demasiado joven).
2. Antes del día de infiltración, regar el Tobacplantas compañeros para saturar el suelo.
3. En el día de infiltración, pre-incubar las plantas en la oscuridad durante 1-3 hr. Este paso permite estomas en la epidermis para abrir ampliamente, lo que facilita en gran medida el Agrobacterium al penetrar en las células epidérmicas de la hoja.
4. El uso de cintas de color en la sección de fechas, la bandera de las hojas para ser infiltrada. Marcar las áreas que se infiltraron con un rotulador negro grueso (opcional; las zonas infiltradas son visibles después de ser infectados.).
5. Tome volúmenes iguales de la Agrobacterium resuspensión y mezclarlas en un 100 x 15 mm placa de Petri agitando suavemente (Figura 2E). Nota: En nuestro caso, hemos mezclado 1 ml de p19 con 1 ml de PPC-BASL, 1 ml de DNyda-NYFP y 1 ml de DNmpk-cYFP.
6. En el proceso de infiltración, llenar una jeringa sin aguja 3 ml con la mezcla de infiltración (1 - 2 ml) y empuje en la parte inferior (abaxial) de la hoja de tabaco (Figura 2F). Mientras que la infiltración, es útilutilizar una mano para empujar y la otra mano para apoyar suavemente el lado superior (adaxial, contra la fuerza de empuje).
   Nota: Una vez que la mezcla de infiltración se inyecta con éxito, las áreas infectadas serán fácilmente reconocibles en la epidermis. Sin embargo, la infiltración puede fallar debido a la inyección dura (daño tisular) o presionado bastante (sin penetración de líquidos). Para cada prueba, se sugiere al menos dos inyecciones en dos hojas independientes (de diferentes plantas).
7. Colocar las plantas infectadas de nuevo en la cámara de crecimiento. En general, las expresiones de proteínas son detectables después de seguir la infiltración de 48 hr.

4. Imagen confocal

1. A las 48 horas la infiltración de correos, utilizar una perforadora para extirpar un disco de hoja de la zona de inyección (normalmente 3 - 4 discos / área pueden ser producidos) (Figura 2G). Use pinzas para transferir suavemente los discos de hoja a una diapositiva (el lado abaxial hacia arriba) y montarlos con gotas de agua. Evite presionar demasiado Hard en la hoja de la cubierta porque las células dañadas exprimidos / no mostrará bien bajo el microscopio confocal (Figura 2H).
2. Antes de imagen confocal, escanear las muestras montadas en un microscopio compuesto de epi-fluorescencia para comprobar los niveles de expresión. Nota: Sobre la base de nuestra experiencia, las células que muestran los niveles de expresión intermedios se representan mejor en el microscopio confocal.
3. Comenzar con el (1,3 NA) del objetivo 40X en un microscopio confocal. Ajuste el deslizante a la posición deseada de manera que las células que expresan niveles medios de proteína fluorescente permanecen en el centro. Los espectros de excitación / emisión de PPC y YFP son 458 nm / 480 - 500 nm y 514 nm / 520 - 540 nm, respectivamente.
4. Activar el botón "vivo" para previsualizar las imágenes a continuación, ajustar la intensidad del láser y la ganancia inteligente para la relación de la intensidad de fluorescencia / ruido más equilibrado. Para mejorar la calidad de imagen, aumentar píxeles de exploración y / o media de trama / línea. Finalmente, ajuste el botón de enfoque para reach el plano focal mediana y haga clic en "Capture" para tomar la imagen.
   Nota: El PPC y YFP imágenes se pueden capturar de forma secuencial o simultánea mediante la comprobación o desactivar la opción de modo de escaneo "secuencial", respectivamente.
5. Cuando se desea Z-proyección para la visión en profundidad de las celdas, seleccione el modo de imagen "xyz", definir la profundidad del campo de barrido (10 - 15 micras) y recoger las imágenes de la parte superior a la parte inferior de la célula diana . Compilar las imágenes obtenidas con el software Leica haciendo clic derecho sobre el archivo de imagen para seleccionar "cambiar el nombre" y exportar imágenes como archivos .tiff.
6. Image 30 - 40 células para el análisis de la cuantificación.

5. Procesamiento y Análisis de Imágenes Cuantificación

1. Utilice el software de Fiji (http://fiji.sc/Fiji) para procesar imágenes y llevar a cabo la cuantificación.
   1. Trazar los gráficos de intensidad de fluorescencia.
      1. Para visualizar mejor si la expresión PPC / YFP esuniformemente distribuida, Fiji utilizar para demostrar la potencia de la señal de PPC y YFP lo largo de la periferia de la célula. Para lograr esto, primero lanzar Fiji a continuación, seleccione "Archivo" y "Abrir" para iniciar la imagen. Haga clic en "línea" en el menú de herramientas y seleccione "línea segmentada" haciendo clic derecho. Decidir la región de interés y trazar una línea a lo largo de la periferia de la célula para rastrear la PPC o la señal de YFP (Figura 3A-C).
         Nota: Fiji mide el valor de la intensidad de fluorescencia absoluta a lo largo de las líneas segmentadas.
      2. Seleccione el menú desplegable "Analizar" y "Lote perfil" para generar un gráfico con los valores de posición e intensidad que representan los niveles de PPC / YFP a lo largo de la línea segmentada. Si se desea, duplicar los valores de intensidad (seleccionando el menú "Copiar") en Excel u otro software gráfico para generar gráficos de intensidad comparable.
   2. Cuantificar el grado de polaridad.
      1. Recoger aproximadamente 20 represencélulas tativos de 3 experimentos replicados para evaluar el grado de polaridad del PPC y YFP en células de tabaco. Calcule el grado de polaridad en base a la relación de la intensidad de fluorescencia alta (definida como H) sobre la intensidad de fluorescencia baja (definido como L). Nota: El método de cuantificación se explica en la Figura 3.
         1. Para medir los valores de H y L, trazar una línea segmentada a lo largo de la región interesados ​​en la periferia de la célula (descrito anteriormente), haga clic en "Analizar" en el menú desplegable, y luego seleccione "Medición". Cuando un "Resultados" ventana aparece, utilice "Mean" valores para llevar a cabo la cuantificación.
         2. A partir de las células que muestran expresión relativamente uniforme de PPC y YFP, por ejemplo, CFP-BASL (Figura 3A) o la YFP complementan de la co-expresión de DNyda-NYFP y DNmpk6-cYFP (Figura 3B), obtener los valores de H y L midiendo seleccionados de manera aleatoria segmentos periféricos con la misma longitud.
         3. A partir de las células que muestran la acumulación polar evidente de proteínas fluorescentes, en este caso, la co-expresión de CFP-BASL, DNyda-NYFP y DNmpk6-cYFP (Figura 3C), recoger los valores de H de las regiones periféricas con señales de fluorescencia enriquecidos y los Ls de las regiones con baja acumulación / fluorescencia.
         4. Se combinan las proporciones resultantes de H / L de 20 células juntos y las pruebas para la distribución normal. Calcular los valores de p de la prueba t de Student (para distribución normal) o la prueba de Kolmogorov-Smirnov (KS) (para su distribución no normal).

Resultados

Para evitar la muerte celular inducida por la señalización de MAPK hiperactivo, se utilizaron las versiones inactivas de quinasa de YDA (DNyda) y MPK6 (DNmpk6) en el ensayo de co-expresión en células de tabaco. Ni la interacción entre DNyda y DNmpk6 revelado por sí ni BiFC patrón de distribución desigual generado (Figura 3A-B) CFP-BASL. Sin embargo, cuando CFP-BASL se introdujo en el par de interacción DNyda-DNmpk6, tanto las señales de YFP PPC y se redistribuyeron en un...

Discusión

Uso General y posibles modificaciones del sistema de expresión transitoria del tabaco para la transducción de señales: La sobreexpresión de la proteína fluorescente (FP)-etiquetados proteínas en la epidermis de tabaco ha sido utilizado con éxito para el examen rápido de la localización subcelular de proteínas en las células vegetales. Sin embargo, el estudio de distribución de señalización dinámica del complejo de la proteína in planta es un tema difícil debido a los contextos subcelulares comp...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Phusion ADN polimerasa	New England Biolabs	M0530S
pENTR/D/TOPO	Life Technologies	K2400-20
QuickChange II XL Kit de mutagénesis dirigido al sitio	Agilent Technology	200521
caldo LB	AMRESCO	J106-2KG
Bacto Agar	AMRESCO	J673-1KG
Gentamicina	Sigma-Aldrich	G3632-1G
Rifampicina	Sigma-Aldrich	R3501-1G
Kanamicina	Sigma-Aldrich	K4000-25G
Spectinomicina	Sigma-Aldrich	S4014-5G
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266-100G
25 x 75 mm Corredera	VWR	16004-382
24 x 50 mm Cubreobjetos	VWR	48393-241
Microscopio confocal de barrido láser	Leica	TCS SP5 II	LAS AF Lite software
Lente objetivo 40X	Leica	HCX  Plan APO	HCX  Plan APO, NA 1.30
Centrífuga	Thermo Scientific	SORVALL 6+
Perforadora	Grapas
50 ml tubos halcón	Genesee Scientific	21-108
Nº 5 Pinzas	Canemco & Marivac	205EQA-Especificaciones