Proporcionamos un método básico reproducible para la microscopía a largo plazo del ciclo de vida sexual de la levadura de fisión. Con los pequeños ajustes descritos, el protocolo presentado permite que la investigación se centre en diferentes etapas del proceso reproductivo.
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Artículo de método
Microscopía de la levadura de fisión del ciclo de vida sexual
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe ha sido un sistema modelo invaluable en el estudio de la regulación de la progresión del ciclo celular mitótico, la mecánica de la división celular y la polaridad celular. Además, los experimentos clásicos sobre su reproducción sexual han arrojado resultados fundamentales para la comprensión actual de la recombinación y la meiosis del ADN. El análisis más reciente del apareamiento de levaduras de fisión ha planteado preguntas interesantes sobre los mecanismos de respuesta a estímulos extrínsecos, el crecimiento celular polarizado y la fusión célula-célula. Para estudiar estos temas en detalle, hemos desarrollado un protocolo sencillo de microscopía de todo el ciclo de vida sexual. El método descrito aquí se ajusta fácilmente para estudiar etapas específicas de apareamiento. Brevemente, después de ser cultivados a la fase exponencial en un medio rico en nitrógeno, los cultivos celulares se cambian a un medio privado de nitrógeno durante períodos de tiempo adecuados a la etapa del ciclo de vida sexual que se explorará. A continuación, las células se montan en cámaras de almohadillas de agarosa personalizadas y fáciles de construir para la obtención de imágenes. Este enfoque permite monitorear las células desde el inicio del apareamiento hasta la formación final de esporas.
Introducción
Aunque el intercambio genético entre dos células es el evento central en la reproducción sexual, que se basa en una cadena de eventos que promueven la diferenciación celular, permiten la elección de pareja, llevan a cabo la fusión célula-célula y mantener la estabilidad genómica. Así, el ciclo de vida sexual se presenta como un sistema modelo para estudiar una serie de cuestiones biológicas en conmutación de desarrollo, respuesta a estímulos extrínsecos, la fusión de la membrana plasmática, la segregación de cromosomas, etc. Exploración de la levadura de fisión ciclo sexual para estudiar estos fenómenos aporta los beneficios de la poderosos genética del mode....
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Protocolo
análisis de microscopía de la reproducción sexual levadura de fisión
1. Preparación de Medios
- Preparar medio de esporulación mínima (MSL-N) 15 mediante la mezcla de los siguientes componentes: glucosa: 10 g / L, KH 2 PO 4: 1 g / L, NaCl: 0,1 g / L, MgSO 4 · 7H 2 O: 0,2 g / L. Añadir elementos traza (10.000 veces): 100 l / L, vitaminas (1,000x): 1 ml / L y 0,1 M de CaCl2 ml / L. Filtrar esterilizar utilizando un filtro de 0,22 micras de tamaño de poro y se almacena a temperatura ambiente (RT).
- Utiliza el siguiente Vitaminas (1,000x) stock: pantotenato: 1 g /....
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Resultados
La fisión crecimiento de la levadura y el apareamiento Dinámica Tras la eliminación de una fuente de nitrógeno
Como el hambre de nitrógeno es un requisito previo para el inicio de la reproducción sexual en la levadura de fisión, cepa de tipo salvaje H90 homothallic se controló a cambio de rico en nitrógeno a un medio de nitrógeno-privada (Figura 2), siguiendo el protocolo descrito en la Figura 1. Brevemente, las células se cultivaron O / .......
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Discusión
Las condiciones ambientales, y la disponibilidad de nutrientes, en particular, afectan en gran medida la fisiología de la levadura de fisión. Hambre de nitrógeno es necesaria para el compromiso de la reproducción sexual e inicialmente da lugar a notables cambios en la progresión del ciclo celular mitótico (Ref. 21 y Figura 2). Tras la eliminación de nitrógeno de crecimiento exponencial de la población, el tamaño de celda en la división disminuye rápidamente (Figura 2C) y la m.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
AV fue apoyado por una beca postdoctoral largo plazo EMBO. La investigación en el laboratorio de Martin está financiado por una subvención de inicio del CEI (GeometryCellCycle) y una subvención Swiss National Science Foundation (31003A_155944) para SGM.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Glucosa | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4• 7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantotenato | AppliChem | A2088,0025 | |
| Ácido nicotínico | AppliChem | A0963,0100 | |
| Inositol | AppliChem | A1716,0100 | |
| Biotina | AppliChem | A0967,0250 | |
| Ácido bórico | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4• 7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2• 6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Óxido de molibdeno (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4• 5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Ácido cítrico | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarosa | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-Leucina | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| Sal de Hemisulfato de Adenina, mini 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Lanolina | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Vaselina | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Parafina | Reactolab | 7005600 |
Referencias
- Mata, J., Bahler, J. Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).
- Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O.
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Reimpresiones y permisos
