¿Por qué importa la cuantificación: Caracterización de fenotipos en el Drosophila Larval unión neuromuscular

Summary

La morfología, el tamaño y la ubicación de los orgánulos intracelulares se conservan evolutivamente y parecen afectar directamente a su función. Comprender los mecanismos moleculares que subyacen a estos procesos se ha convertido en un objetivo importante de la biología moderna. Aquí mostramos cómo estos estudios pueden ser facilitados por la aplicación de técnicas cuantitativas.

Abstract

La mayoría de los estudios sobre la morfogénesis se basan en descripciones cualitativas de cómo los rasgos anatómicos se ven afectados por la interrupción de genes específicos y vías genéticas. descripciones cuantitativas se realiza con poca frecuencia, a pesar de las manipulaciones genéticas producen una serie de efectos fenotípicos y se observan variaciones incluso entre los individuos dentro de los grupos de control. Nuevas pruebas muestra que la morfología, tamaño y ubicación de los orgánulos desempeñan un papel previamente underappreciated, sin embargo, fundamental en la función celular y la supervivencia. Aquí nos proporcionan instrucciones paso a paso para realizar análisis cuantitativos de los fenotipos en la unión neuromuscular de larvas de Drosophila (UNM). Utilizamos varios marcadores inmunohistoquímicos fiables combinados con técnicas bio-de formación de imágenes y análisis morfométricos para examinar los efectos de las mutaciones genéticas en los procesos celulares específicos. En particular, nos centramos en el análisis cuantitativo de los fenotipos que afecta a la morfología, el tamaño y la posición de nuclei dentro de los músculos estriados de las larvas de Drosophila. La Drosophila larval NMJ es un modelo experimental útil para investigar los mecanismos moleculares que subyacen a la estructura y la función del sistema neuromuscular, tanto en la salud y la enfermedad. Sin embargo, las metodologías que describimos aquí se pueden extender a otros sistemas también.

Introduction

El análisis cualitativo restringe el enfoque de la mayoría de los estudios experimentales al examen de manipulaciones genéticas que conducen a grandes efectos fenotípicos o a fenotipos que no son susceptibles de cuantificación, por ejemplo, ausencia/presencia. Por lo general, no se realiza la cuantificación de los fenotipos y no se tienen en cuenta las variaciones presentes dentro de los miembros de un grupo fenotípico. Además, sin descripciones matemáticas de las morfologías, puede ser difícil determinar si los cambios fenotípicos a escala fina son el resultado de alteraciones inducidas genéticamente o si los cambios observados se deben simplemente a fluctuaciones aleatorias.

Proponemos que para un análisis preciso e imparcial de los defectos fenotípicos debidos a la disrupción génica, las metodologías cuantitativas deben acompañar a los enfoques cualitativos más tradicionales. La evaluación cuantitativa de fenotipos es particularmente beneficiosa para estructuras como las sinapsis que presentan un alto grado de variabilidad debido a su plasticidad morfológica y funcional intrínseca. Hemos seleccionado ejemplos de análisis cuantitativos aplicados a áreas de investigación con las que estamos más familiarizados, a saber, las uniones neuromusculares (NMJ) de las larvas de Drosophila. Sin embargo, los conceptos y principios se aplican igualmente bien a otros sistemas experimentales.

La NMJ larval es un excelente sistema modelo para estudiar el desarrollo y la función sináptica debido a la naturaleza altamente estereotipada de su estructura. Cada hemisegmento del sistema neuromuscular larvario contiene 32 neuronas motoras identificables que forman contactos sinápticos con su músculo diana postsináptico. Cada hemisegmento también contiene un número fijo de músculos visibles como fibras multinucleadas unidas a la superficie interna de la cutícula¹. Otra ventaja de utilizar el sistema neuromuscular larvario es la potencia y versatilidad de la genética de Drosophila que permite fácilmente la generación de una serie de alelos mutantes y la posibilidad de modificar la expresión génica de forma restringida en el tiempo y en el tejido. Finalmente, el 75% de los genes humanos que causan una enfermedad tienen un ortólogo conservado evolutivamente en Drosophila². De hecho, se conservan vías genéticas enteras entre las moscas y los humanos. Debido a esto, el sistema neuromuscular de las larvas de Drosophila es un modelo experimental muy popular para dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen a una serie de enfermedades humanas, incluida la esclerosis lateral amiotrófica (ELA)¹.

Aquí demostramos que la disponibilidad de varios marcadores inmunohistoquímicos fiables, combinados con técnicas de bioimagen y análisis morfométricos precisos, pueden describir rasgos anatómicos que probablemente desempeñen un papel funcional importante^3,4,5. Entre los procesos celulares que son susceptibles de análisis cuantitativos, nos centramos en los cambios en la forma, el tamaño y la posición de las estructuras intracelulares, como los núcleos. Todos estos son procesos de los que sabemos muy poco.

El reto para los genetistas moleculares en las próximas décadas será ampliar nuestro conocimiento actual analizando el efecto de las mutaciones genéticas que producen defectos fenotípicos muy sutiles. Las metodologías cuantitativas que permiten a los investigadores explorar meticulosamente los efectos de las mutaciones genéticas pueden proporcionar una comprensión más completa de cómo los genotipos se relacionan con los fenotipos, especialmente para los procesos celulares poco conocidos.

Protocol

1. Preparación Experimental

Nota: Las disecciones y procedimientos inmunohistoquímicos en las secciones 2 y 3 se llevan a cabo de acuerdo con las referencias ^3-6, pero con modificaciones.

1. Preparar solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) y PBS que contenía 0,1% de Triton X-100 (PBT). Mantenerlos en hielo.
2. Preparar el fijador de Bouin (15 Ácido pícrico: 10 El formaldehído: 1 Ácido acético glacial). Hacer de este reactivo nuevo.
3. Seleccionar pasadores minutien de acero inoxidable limpia y unas pinzas finas.
4. Preparar placas de disección que contienen un disco de Sylgard en una placa de Petri de 5 cm.

2. Disección del tercer estadio larvario NMJs

1. Escoja errante larvas de tercer estadio de un vial o una botella con un pincel fino y colocarlos en una placa de Petri que contiene 2 cm PBS a 4ºC para lavar la comida residual de distancia.
2. Coloque una larva en la parte superior de la superficie Sylgard de la placa de disección y asegurarse de que es positioned con su lado dorsal de modo que los dos tubos traqueales longitudinales son visibles en la parte superior.
3. Usando las pinzas para sujetar el pasador, perno de la larva hacia abajo en su extremo anterior, directamente debajo del gancho de la boca. Estirar la larva a cabo tanto como sea posible y el pin de su extremo posterior hacia abajo.
4. Añadir una cantidad suficiente de solución salina PBS para llegar a las paredes de la placa y sumergirse por completo la larva.
5. Repetir el procedimiento de los pasos 2.1 a 2.3 para otras larvas del mismo genotipo. A 5 cm Petri placa plato único disección puede acomodar fácilmente hasta 8 larvas.
6. El uso de las tijeras micro-disección, levante ligeramente la cutícula dorsal y hacer una pequeña incisión horizontal en el extremo posterior cerca de la espiga.
7. Inserte tijeras en la incisión, corte la larva todo el camino hasta el extremo anterior a lo largo de la línea media entre las dos secciones longitudinales de la tráquea. Asegúrese de que los cortes de la línea media son lo suficientemente superficial para pasar sólo a través de la cutícula y para evitar cortar a través de los músculos deel lado ventral.
8. En cada extremo, cortar dos muescas en los lados izquierdo y derecho.
9. Abra el filete mediante la colocación de dos pasadores a ambos lados de la incisión anterior. Repita lo mismo con el extremo posterior. Al colocar los pines, asegúrese de difundir la pared del cuerpo aparte.
10. Limpiar los órganos internos utilizando fórceps y solución salina PBS. Deje el sistema nervioso central intacto. estirar suavemente la larva con los pernos de las esquinas hasta que esté completamente estirada, pero asegúrese de que los músculos no se rompen durante este proceso.
11. Repetir el mismo procedimiento para la disección de las larvas de otros en la misma placa de disección.
12. Lavar con solución salina PBS tres veces para eliminar todos los órganos internos.
13. Vuelva a colocar la PBS con fijador de Bouin y dejar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
14. Lavar varias veces con PBT.
15. Retire los pasadores con cuidado y transferir todos los preparativos, que ahora son bastante rígido, en un tubo de 1,5 ml de microcentrífuga de inmuno-tinción.

La tinción inmunohistoquímica 3. de Drosophila NMJs con anticuerpos específicos para los músculos y mionúcleos

1. enjuagar rápidamente los filetes de larvas en PBT.
2. Bloquear las preparaciones mediante incubación con 10% de suero normal de cabra (NGS) en PBT durante 2 horas con agitación constante.
3. Incubar un conjunto de NMJs disecados en PBT que contiene 5% de NGS y un anticuerpo de conejo anti-lamina (a una concentración de 1: 500) y con un anticuerpo anti-DVAP conejillo de indias (a una concentración de 1: 500) durante 2 horas a temperatura ambiente o a 4 ºC durante la noche. El anticuerpo anti-DVAP tiñe los músculos estriados, mientras que la tinción anti-lamin detecta el contorno de mionúcleos.
4. Lavar una vez con rapidez en PBT para eliminar los anticuerpos en exceso. Lavar en PBT durante 2 horas, cambiando el PBT tampón cada 15 minutos.
5. Se incuban las muestras en PBT que contiene 5% NGS y anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia a 1: 500 dilución durante 2 horas a temperatura ambiente. Las mismas muestras cun ser sometidos a tinción con múltiples anticuerpos al mismo tiempo si se usan anticuerpos secundarios conjugados con diferentes cromóforos.
6. Eliminar los anticuerpos secundarios y lavar en PBT durante 2 horas, cambiando el PBT tampón cada 15 minutos.
7. Para teñir el interior de los mionúcleos lavar las muestras tres veces con PBS y proceder como sigue:
   1. Añadir el marcador nuclear TO-PRO-3 a una dilución de 1: 1000 en PBS y se incuba durante 20 min con agitación constante. Este marcador se utiliza en este estudio, pero cualquier otro marcador nuclear disponible en el mercado puede ser utilizado también.
   2. Lavar rápidamente tres veces en PBS antes de montar.

4. Las muestras de montaje en las diapositivas

1. Recoger las muestras con una pinza del tubo de 1,5 ml de microcentrífuga y las ponen sobre un portaobjetos de procesamiento.
2. Mediante el uso de tijeras micro-disección, corte la cabeza y la cola de los filetes y mantener su superficie interna hacia arriba.
3. preparar THe diapositiva de montaje envolviendo alrededor de tres tiras de cinta de celulosa en cada lado de un portaobjetos limpio a una distancia de aproximadamente 1 cm entre sí. Una vez que el cubreobjetos se coloca en la parte superior de las dos tiras, una brecha se generará que evitar el aplanamiento de las muestras. Esto es crucial si las representaciones de volumen tridimensionales de las estructuras deben ser hechos.
4. Ponga una pequeña gota de aproximadamente 20 l de medio de montaje en el medio de la corredera de montaje entre las tres tiras de cinta de celulosa.
5. Después de la difusión del medio de montaje con pinzas limpias, arrastrar las larvas diseccionado a la diapositiva de montaje en el medio de montaje, manteniendo la superficie interna hacia arriba. Trate de montar en filas de cuatro o cinco.
6. deje caer suavemente una hoja de la cubierta en la parte superior de la corredera de montaje y asegurarse de que no se generan burbujas de aire. Sellar la diapositiva con esmalte de uñas transparente. Deje que las muestras se sequen durante al menos 10 minutos antes de la proyección de imagen.

5. Configuración Confocal de Imagen

Nota: Las imágenes que se presentan en este estudio se tomaron usando una unidad confocal Nikon A1R integrados en un Ti: E microscopio invertido. Sin embargo, cualquier microscopio confocal con un mínimo de unidades 3 de láser disponibles en las regiones de longitud de onda de 488 nm, 561 nm y 642 nm y un sistema de detección 3 de canal es adecuado para este propósito.

1. Encender el detector de rayos láser, unidad, bulbo de mercurio, el controlador etapa, microscopio y el PC. Iniciar el software de control y asegurar la diapositiva en el soporte de la platina.
2. Para hacer más rápida de imágenes, seleccionar y marcar todas las regiones de interés (ROI) en la muestra utilizando un objetivo 20X.
3. Con cuidado, gire la pieza de nariz a la lente objetivo 60X mayor aumento (60X Plan de Apo VC / NA 1,4 ACEITE).
4. Coloque una gota de aceite de inmersión sobre la lente objetiva y seleccione una de las ROI marcada desde la ventana de visión general XYZ en el equipo.
5. Comience de imágenes que utiliza las siguientes configuraciones ópticas: Seleccione el primer espejo dicroico: 405/488/561/640. Seleccione 488 nm láser con filtro de emisión de 525/50 nm en el canal 1, 561 nm láser con filtro de emisión de 595/50 en el canal 2 y el láser de 642 nm con filtro de paso largo de 650 nm en el canal 3.
6. Utilice los siguientes parámetros de escaneo antes de iniciar la adquisición de imágenes: Seleccionar escáner Galvano; dirección de exploración: una forma; Velocidad de escaneado: 0,5 cuadros por segundo.
7. Seleccione la serie de canales para evitar canal de derrame.
8. Ajustar el tamaño del agujero de alfiler a 1 unidad aireado. Escanear y ajustar la potencia del láser, el aumento de la detección y compensar adecuadamente para cada canal para evitar la saturación de píxeles y nivel de fondo.
9. Adquirir z-pilas utilizando voxel tamaño de 0,2 x 0,2 x 0,5 m ³ para todas las regiones de interés y los preparativos de diapositivas. Si las imágenes van a ser sometidos a deconvolución a continuación, establecer el tamaño del voxel a 0,06 x 0,06 x 0,15 m ^3.
10. Guardar imágenes en formato de formato de archivo o .ics .nd2.

6. Cálculo de la distancia entre núcleos dentro estriado60; Músculos por el método del Análisis de vecinos más próximos

1. Para este análisis, utilizar confocal de imágenes que muestran los músculos del cuerpo de pared larvas teñidas con anticuerpos DVAP para visualizar los músculos y con anticuerpos lamina y un marcador nuclear para resaltar los núcleos.
2. Para estimar la distancia más cercana entre los núcleos, utilizar Puntos de medición dentro del módulo MeasurementPro del software de análisis de imágenes (por ejemplo, Imaris). Otras aplicaciones de software similares para el análisis de imagen se puede utilizar para los mismos fines.
3. Abrir las imágenes confocal. Para iniciar, haga doble clic en el icono del software. Arrastrar y soltar las imágenes confocal z-stack en la Arena.
4. Haga doble clic en las imágenes para abrir automáticamente en la vista de superar, bajo el icono de la barra de herramientas del menú . La vista Superar tiene tres paneles principales del espacio de trabajo: Área, Mostrar objeto y el objeto Propiedades del área.
5. Crear un volumen prestado tRes de imagen del canal haciendo clic en el icono del menú Vista 3D .
6. Haga clic en el icono Agregar nuevo Puntos de Medición desde el Objetos barra de herramientas y siga el asistente de creación de objetos que aparece en Propiedades del área.
7. Desde el asistente de creación de seleccionar la pestaña Editar primero y luego el canal específico. Seleccione el marcador nuclear o el canal de lamina para resaltar los núcleos.
8. Mueve el puntero al modo Seleccionar pulsando la pestaña Esc en el teclado.
9. Ajustar el tamaño de la caja del cursor 3D con la rueda del ratón para contener un núcleo dado en la imagen. Añadir un punto de medición manteniendo pulsada la tecla Shift y haga clic izquierdo del ratón sobre el mismo núcleo.
10. Añadir el segundo punto en un núcleo cercanas en el mismo músculo mediante la repetición de los pasos anteriores. Se traza una línea automáticamente entre los dos puntos y la distancia medida entre se muestran los dos núcleos. La distancia entre los dos núcleos se registra ahora como una variable estadística en el objeto Propiedades del área bajo la etiqueta de datos Estadísticas> detallada> Distancia.
11. Repetir el procedimiento de los pasos 6.6 a 6.10 para todos los núcleos que rodean un núcleo dado.
12. De Estadísticas> Datos detallada> Distancia mostrando todos los puntos de medición recogidos, seleccione la distancia más corta.
13. Al hacer clic en las estadísticas de exportación en la ficha Pantalla a Archivo disponible con el objeto Propiedades del área, los datos se guardarán en una hoja de cálculo.
14. Repita el mismo procedimiento para los otros núcleos circundantes y para un número seleccionado de las fibras musculares por genotipo.
15. Utilizando los datos exportados a un archivo de hoja de cálculo, calcular la distancia más corta media (D _ave) para todo el número M de los músculos utilizando la siguiente ecuación:
    OAD / 53821 / 53821eq1.jpg "/>
    Di es la distancia más corta al núcleo vecino para un núcleo dado i, donde i varía de 0 a N y N es el número de núcleos analizados por músculo. La suma de los valores de j = 0 para j = m indica el número M de los músculos analizados.
16. Como alternativa, utilice Asistente de creación de manchas y manchas de manchas Distancia mínima para estimar la distancia media al núcleo vecina más cercana. Para esto, se necesita un módulo de extensión de Matlab.
    1. Haga doble clic en una imagen específica en la imagen 3D de un volumen Arena y se mostrará en el área de visualización. Haga clic en el icono de creación de objetos y añadir nuevos puntos Objetos de la barra de herramientas.
    2. Desde el asistente de creación de objetos en el Área de propiedades, haga clic en la opción de omitir la creación automática, editar manualmente.
    3. Seleccione la lamina o canal marcador nuclear para mostrar los núcleos.
    4. Cambiar y haga clic en lefbotón del ratón t en todos los núcleos de un músculo específico en la imagen. Aparecerá un punto en cada núcleo.
    5. Seleccione los puntos a los puntos distancia más cercana que aparece en la pestaña Herramientas en el objeto Propiedades del área. Seleccione Estadísticas Spots bajo el modo de resultado y una ventana aparece Matlab.
    6. En la pestaña Estadísticas, seleccione valores detallados a continuación específicos. Haga clic en el Distmin y aparecerán los valores de las distancias mínimas para cada núcleo.
    7. Exportar los datos a un archivo de hoja de cálculo y calcular el promedio de estas distancias por músculo. Repita el procedimiento para todos los músculos de un cierto genotipo.

7. Determinación de la forma de los núcleos dentro de los músculos del cuerpo de pared de larvas de Drosophila

1. Para este análisis, utilizar imágenes confocal de los músculos del cuerpo de paredes manchadas de lamina y un marcador nuclear para visualizar los núcleos.
2. Para evaluar la forma de mionúcleos, medida esfericidad (definido como la relación entre el surárea de la cara de una esfera con el mismo volumen que el núcleo dado, a la superficie del núcleo) o elipticidad (distingue entre elipsoides alargados achatados / y esferoides).
3. Abra la imagen como se describe anteriormente. Haga clic en el icono de la barra de herramientas Objetos Añadir nuevas superficies .
4. En el asistente de creación que aparece en el objeto Área de propiedades, seleccione el marcador tinción nuclear como el Canal de la Fuente para mostrar los núcleos.
5. Establecer la opción de intensidad absoluta como el umbral. Asegúrese de que la mayor parte de los núcleos muestran una representación suave y no sobrecargado cambiando el valor de la curva de umbral. Al mismo tiempo, evitar la presencia de agujeros o máscara incompleta a cualquier núcleo utilizando la misma curva.
6. Utilizar el herramienta de filtro para excluir cualquier ruido en la prestación superficie. En la pestaña Editar de la capa superficial de nueva creación, división o fusión de los núcleos de las superficies que están incorrectamente rendered.
7. Exportar a una hoja de cálculo presentar los valores de elipticidad y la esfericidad de la superficie mostrada núcleos que están disponibles en la pestaña Estadísticas.
8. Alternativamente, utilizar el software ImageJ o Fiji para medir la circularidad de los núcleos donde la circularidad (C) se define como C . Un valor de uno representa un círculo perfecto, mientras que un valor cercano a cero indica una forma cada vez más alargada.
9. Crear proyecciones de máxima intensidad de las pilas z de menú Imágenes> Pilas> Proyecto Z. Ajuste del tipo de proyección de máxima intensidad.
10. Dividir los canales y seleccione el canal marcador nuclear.
11. En el menú principal, seleccione Imagen> Ajuste> Umbral.
12. Segmento de los núcleos mediante el ajuste de la intensidad umbral. Si los núcleos cercanos están segmentados como una sola unidad, haga clic en Proceso> Binary> herramienta de cuencas para desconectar los núcleos.
13. En el menú principal, seleccione Editar> Selecciones> Crear selección.
14. Añadir todas las regiones de interés seleccionadas en el Administrador de retorno de la inversión haciendo clic en el menú Análisis> Herramientas> Administrador de retorno de la inversión. En la ventana del Administrador de ROI haga clic en Agregar. Dentro de la misma ventana seleccione Más> Split.
15. Seleccionar en descriptores de forma Analizar> mediciones indicadas. En la ventana del Administrador de retorno de la inversión clic en la pestaña Medida. Esto mostrará una lista de valores de circularidad de todos los núcleos seleccionados.
16. Además, para medir el volumen nuclear, sigue asistente de creación de superficie usando el canal marcador tinción nuclear tal como se describe en las subsecciones 7.3-7.7.

8. Volumen Renders 3D de núcleos seleccionados dentro de los músculos del cuerpo de pared de larvas de Drosophila para evaluar la Intranucleares La localización de una proteína específica

1. Use imágenes confocal de informes músculos de la pared corporal teñidas con un marcador nuclear y con anticuerpos específicos para lamina y DVAP.
2. Abrir las imágenes al iniciar el software y select el núcleo específico a analizar. Esto se puede hacer seleccionando el principal elemento de menú Editar> Recortar 3D.
3. Siga asistente de creación de superficie utilizando el canal de lamina tal como se describe en el apartado 7.3 a 7.7.
4. Una vez creada la superficie, haga clic en Editar en la objetos Propiedades del área y luego seleccione Máscara todo para aislar la señal en el interior del núcleo. Esto crea una nueva ventana.
5. Seleccione la señal de DVAP en el menú desplegable de selección de canal. Seleccione la señal de inmuno-reactividad DVAP el interior del núcleo haciendo clic en la opción set vóxeles fuera de la superficie a cero. Un nuevo canal enmascarado se crea y está disponible en la ventana de ajuste de visualización de la selección.
6. Para visualizar la presencia de la señal dentro del núcleo crear un plano de contorno haciendo clic en el icono Agregar nuevo plano delimitador Objetos de la barra de herramientas.
7. Interactiva ajustar el ángulo del recorteavión y su posición para visualizar la distribución de la señal en el interior del núcleo.

Results

La ELA es una enfermedad degenerativa que afecta específicamente las neuronas motoras que conducen a una parálisis progresiva y fatal de los músculos estriados ^7. Mutaciones sin sentido en el VAMP-proteína asociada B (hVAPB) causan una serie de enfermedades de las neuronas motoras, incluyendo la ELA 8 Tipo de ^8-12. Una mutación de sentido erróneo (V234I) en el gen hVAPB ha sido identificada recientemente en un caso de ALS típicos en humanos ^13. Para evaluar su potencial patógeno, generamos moscas transgénicas que expresan el hVAPB Drosophila orthologue DVAP que porta la mutación causante de la enfermedad (DVAP-V260I). La expresión de este transgén fue dirigida a los músculos que utilizan el sistema UAS / GAL4 y el músculo específica controlador BG57-Gal4 ^14,15. El efecto de DVAP-V260I expresión transgénica fue comparado y contrastado con el de otros dos transgenes (DVAP-WT1 y DVAP-WT2), que expresan diferentes niveles de la proteína de tipo salvaje DVAP ^16. More específicamente, el aumento de la inmunorreactividad DVAP es 2,2 veces mayor que en los controles para la línea DVAP-WT2 mientras que los niveles DVAP-V260I y DVAP-WT1 exposición comparables e inferior de la misma señal ^16.

Alteraciones nucleares se han asociado con el envejecimiento y varias enfermedades neurodegenerativas incluyendo la enfermedad de Parkinson ^17,18. Para evaluar si nuestro modelo de mosca de ELA8 exhibe cambios en la arquitectura, la posición y el tamaño nuclear, teñidas núcleos dentro de los músculos estriados de genotipos apropiados con un marcador nuclear y el anticuerpo anti-lamina ^19-22, que visualiza la envoltura nuclear. Para resaltar los músculos, un anticuerpo de DVAP específico también se añadió a las mismas muestras (Figura 1). Las imágenes confocales se recogieron y análisis detallados morfométricos se realizaron usando un software de análisis de imágenes. En los músculos de control, se encontraron núcleos estarán distribuidos uniformemente a lo largo del músculofibras mientras que en DVAP-V260I y DVAP-WT expresar los músculos, los núcleos exhiben una tendencia a redistribuir en grupos estrechamente asociados (Figura 1).

Se realizó un análisis del vecino más cercano para realizar una evaluación cuantitativa de la distribución de los núcleos a lo largo de las fibras musculares de cada genotipo. Un análisis de vecino más cercano identifica primero el vecino más cercano para cada núcleo mediante la medición de la distancia entre el centro de un núcleo dado y el centro de cada otro núcleo circundante. Este procedimiento se repite entonces para cada otros núcleos a lo largo de la fibra muscular. Por último, la distancia más corta entre los núcleos dentro de un músculo específico, se calcula promediando las distancias más cortas de cada núcleo y sus vecinos más cercanos. (Figura 2A - C). En comparación con los controles, los músculos que expresan bien el transgén DVAP-V260I o cualquiera de los transgenes que sobreexpresan la proteína de tipo salvaje, Presentar una dramática reducción en la distancia más corta media entre los núcleos y, como consecuencia, los núcleos parecen estar estrechamente asociado en racimos. El efecto de la ALS causando alelo DVAP-V260I es más severo que el asociado con la sobreexpresión de la proteína de tipo salvaje, aunque el más fuerte transgén DVAP-WT2 se utiliza (Figura 1 y la Figura 2D).

La sobreexpresión de cualquiera de DVAP-V260I o DVAP-WT transgenes también exhibe un grave deterioro de la arquitectura nuclear que resulta en núcleos deformados con una estructura alargada (Figura 1). Esta aberración estructural se cuantificó utilizando el software ImageJ en el que la circularidad se define por la fórmula C , Que miden la relación de anchura a longitud de cada núcleo con C = 1 representa un círculo perfecto y C = 0 un polígono infinitamente alargado. en contrnúcleos ol que presentan una forma redonda distinta, C es igual a 1, mientras que en los mutantes transgénicos un cambio en la forma con la consiguiente pérdida de la circularidad, causa una desviación significativa de este valor (Figura 1 y la Figura 3).

También se encontró que en los músculos que expresan los mismos transgenes, los núcleos muestran un volumen nuclear ampliada marcado comparación con los controles, aunque el alelo que causa ALS parece ser más eficaz en la inducción de este fenotipo en comparación con los transgenes DVAP-WT (Figura 4).

Casi todas las enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por la acumulación intracelular de los agregados que contienen la proteína patógena. Hicimos reconstrucciones 3D y renders de volumen de los núcleos y se encontró que en los músculos que expresan el transgén mutante o sobreexpresan la proteína de tipo salvaje, DVAP inmuno-reactividad de los grupos A formadoEncontramos que algunos de ellos también fueron localizados en el núcleo (Figura 5). Por el contrario, en NMJs de control, DVAP inmuno-reactividad se dispersa ligeramente a lo largo de la fibra muscular y se excluye del núcleo ^16.

. Figura 1: Confocal imágenes de mionúcleos dentro de los músculos estriados que expresan bien el los transgenes DVAP-260I DVAP-WT o (A) BG57-Gal4 / + control, (B) BG57; DVAP-V260I, (C) BG57; DVAP-WT1 y (D) BG57; músculos DVAP-ET2 que expresan los transgenes indicados se tiñeron con anticuerpos específicos para DVAP (señal roja), lamin (señal verde) y con un marcador específico nuclear para visualizar los núcleos (señal azul). Barra de escala = 30 micras Haga clic aquí para ver unaversión más grande de esta figura.

Figura 2: análisis de vecino más cercano para determinar la distancia media entre un núcleo y su único vecino más cercano (B) Los resultados representativos que muestran alteración de posicionamiento nuclear en los músculos que sobreexpresan el transgén DVAP-WT2 en comparación con los controles en (A).. La distancia promedio nuclear en los músculos de los genotipos indicados se calculó utilizando la fórmula de (C) y se reportan los datos en (D). NMJs larvas se tiñeron con anticuerpos específicos para DVAP (señal roja), lamina (verde) y con un marcador nuclear (señal azul). Los asteriscos denotan significación estadística. *** P <0,001, ** P <0,01. Para el análisis estadístico de este experimento y se utilizó todos los experimentos descritos a continuación una prueba de ANOVA de una vía y multípara de Tukeyprueba de comparación le fue aplicado como una prueba post-hoc cuando se encontraron diferencias entre los genotipos de ser significativa por la prueba de ANOVA. Las barras de error representan SEM. Barra de escala = 30 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3:. Imágenes que muestran las etapas de representación en el cálculo del volumen nuclear (A) Una imagen representativa que muestra núcleos segmentados utilizando el asistente de creación de superficie. Los núcleos fueron ignoradas en la frontera de las imágenes. (B) Imagen que muestra la señal de DVAP nuclear después de la tinción DVAP rodea ha sido enmascarado por el uso de la superficie creada en el canal marcador nuclear. (C) La capa superficial proporciona información de parámetros adicionalesincluyendo el volumen nuclear y la esfericidad. (D) Los datos sobre volumen nuclear de diversos genotipos. Los asteriscos denotan significación estadística. NMJs disecados fueron teñidas con anticuerpos anti-DVAP (señal roja), anticuerpos anti-lamina (señal verde) y un marcador nuclear (señal azul). *** P <0,001, ** P <0,01. Las barras de error representan SEM. Barra de escala = 30 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Imágenes que muestra las etapas de representación en la estimación de la forma nuclear mediante ImageJ.    proyección de intensidad máxima de las imágenes se analizaron usando ImageJ para estimar la circularidad de los núcleos dentro de los músculos. (A) Un ejemplo representativo de la proyección de intensidadde la imagen de tres canales como en la etapa 7.9 del protocolo. Se selecciona (B) Imagen que muestra el paso 7.10 del protocolo en el que se separan los canales y el canal marcador nuclear. (C) Un representante imagen que muestra que después de la aplicación de umbral de intensidad para segmentar los núcleos y gestor de ROI Plugin en ImageJ, todos los núcleos de interés pueden ser seleccionados y su forma miden a través de descriptores de forma (pasos 7.11 a 7.15). (D) La cuantificación de la circularidad de diversos genotipos. En los NMJs larvales, la señal roja indica tinción DVAP mientras que el verde se describen núcleos y corresponde a la tinción lamina. El interior de cada núcleo con el azul debido a la tinción con un marcador nuclear. Los asteriscos denotan significación estadística. *** P <0,001, ** P <0,01. Las barras de error representan SEM. Barra de escala = 30 micras Por favor, haga clic en ellae para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Imágenes que muestran los pasos específicos en la creación de representaciones de volumen de mionúcleos. (A) Imagen que muestra la intensidad 3D mezcló vista de los músculos teñidas con proteínas DVAP (rojo), la lamina (verde) y el marcador de ADN (azul). (B) Imagen que representa una capa superficial generada por el uso del canal de lamina para segmentar los núcleos. (C) Imagen que representa un núcleo en el que la capa superficial se ha usado para enmascarar la señal de DVAP fuera del núcleo seleccionado. Resaltado en amarillo es un plano de recorte que se ha añadido a la imagen. Su ángulo de visión y la posición se puede ajustar de forma interactiva para visualizar la distribución de la señal en el interior del núcleo. (D) Una imagen de informes una vista en sección transversal de la USI capa superficial nuclear creadong el canal lamina se fusionó con señales de marcadores nucleares y DVAP desenmascarado. (E y F) representaciones seccionadas de volumen adicionales del mismo núcleo. Barra de escala = 10 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

En el pasado, las variaciones morfológicas dentro y entre los grupos experimentales se rara vez se toman en cuenta. Sin embargo, la aplicación de métodos cuantitativos se está convirtiendo en la norma en los estudios comparativos de la morfología y la descripción matemática de las formas anatómicas se calculan. El uso de análisis cuantitativos en la evaluación de los efectos de las manipulaciones genéticas en los procesos celulares específicos, mantener la promesa en la mejora de nuestra capacidad para detectar cambios morfológicos y en la mejora de la precisión con que se describen estos cambios. Por otra parte, el análisis estadístico de los datos cuantitativos nos permite evaluar si las diferencias observadas entre los fenotipos son significativos.

En músculos estriados, los núcleos exhiben una estructura redondeada distinto y se distribuyen uniformemente a lo largo de la fibra muscular. Aunque no se conocen los mecanismos moleculares para establecer y mantener el tamaño, la forma y la arquitectura de núcleos, estas características nucleares es probable tO jugar un papel fundamental en el control de la función muscular. De hecho, varios miopatías son causados ​​por mutaciones en los genes que regulan la morfología y la posición de los núcleos dentro de los músculos. La importancia funcional de forma y la distribución de los núcleos dentro de una célula no se limita a los músculos. La acumulación de pruebas muestra que los defectos nucleares también están asociados con enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Parkinson ^18,24. Además, estamos empezando a apreciar que la morfología, tamaño y distribución intracelular de otros orgánulos incluyendo retículo endoplasmático y las mitocondrias pueden tener consecuencias funcionales. Por ejemplo, las alteraciones en la morfología mitocondrial se asocian con trastornos neurológicos tales como el tipo-1 atrofia óptica (OPA1) y la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth tipo 2A neuropatía ^25.

Para ayudar en el proceso de aclaración de los mecanismos moleculares que subyacen a estos procesos importantes, proponemos combinar alta resolución confocallos datos con el software de formación de imágenes y análisis morfométricos para evaluar cuantitativamente cómo las manipulaciones genéticas pueden afectar a la forma, tamaño y ubicación de los núcleos dentro de las fibras musculares. La potencia y la versatilidad de la genética de Drosophila junto con la naturaleza altamente estereotipada del sistema neuromuscular en larvas de Drosophila hacen que el larval NMJ un modelo experimental particularmente adecuada para este tipo de análisis. En los NMJs larvas, el análisis fenotípico se puede realizar en una sola resolución sinapsis permitiendo un análisis morfométrico precisa donde un número de NMJs puede ser estudiada dentro de la misma mosca e incluso el mismo identificable NMJ puede compararse entre las moscas de diferentes genotipos ^3,4.

Caracterización fenotípica de la posición nuclear, forma y tamaño en la Drosophila larval NMJ inicia mediante la realización de la inmunotinción de NMJs disecados con anticuerpos que ponen de relieve los músculos y los núcleos dentro de los músculos. En el protocolo descrito en la this papel, mionúcleos se tiñeron con anticuerpos policlonales contra la lamina, un marcador de la envoltura nuclear, con un marcador nuclear destacando los interiores y con anticuerpos nucleares específicos para DVAP para teñir todo el músculo. Los anticuerpos Lamin utilizados en estos experimentos fueron amablemente proporcionados por Paul Fisher ^19-22 pero fuentes alternativas de anticuerpos anti-lamina se pueden utilizar. Además, una serie de otros anticuerpos específicos para la envoltura nuclear están disponibles comercialmente. Finalmente, los marcadores nucleares, como DAPI y yoduro de propidio, también están disponibles mientras que los músculos se podrían visualizaron por tinción con anticuerpos anti-actina o anti-tubulina. Si se emplean anticuerpos distintos de los utilizados en este procedimiento experimental, el protocolo de inmunotinción requerirá extra-pasos en los que tendrán que ser optimizado las condiciones de fijación y las concentraciones de trabajo de los nuevos anticuerpos. Un paso crítico en este protocolo, sobre todo cuando las representaciones de volumen deben ser analizados, es THe de montaje de las muestras en la diapositiva. En este caso, es importante incluir separadores entre el portaobjetos y el cubreobjetos de modo que los especímenes no queden aplastados. Tres bandas de la cinta de celulosa envuelto alrededor de la corredera en ambos lados del cubreobjetos representan una manera fácil de hacer espaciadores.

Mientras ImageJ se utiliza para imágenes en 2D, la mayor parte de la imagen multi-canal 3D del análisis expuestos en este documento, se hace mediante el uso Imaris debido a su disponibilidad en el local. Sin embargo, cualquier otro paquete de software comercial similar se puede utilizar para estas aplicaciones.

Hay varios de código abierto (por ejemplo, ImageJ, CellProfiler, Vaa3D, helado, KNIME y otros) y plataformas de software comercial disponible para el análisis de imágenes confocal. ImageJ ^26, el software gratuito de los NIH o su versión más mejorada, conocida como Fiji ^27, tiene un gran número de filtros de importación, macros y plugins disponibles para la comu de imágenes en todo el mundoTy. La mayoría de estos plugins se centran en el procesamiento de la información de una manera rebanada rebanada por caso. También hay plugins disponibles para la visualización y análisis de imágenes en 3D multicanal. Sin embargo, a menudo están diseñados para una tarea específica y los usuarios pueden necesitar extender o adaptar estas extensiones para sus propias necesidades. Por otro lado, las plataformas comerciales se dirigen a los usuarios con poca experiencia y con frecuencia se centran en, una amplia cobertura facilidad-a-uso de las tareas de procesamiento de imágenes con una velocidad increíble.

El procedimiento experimental junto con el análisis fenotípico cuantitativa se describe en este protocolo, puede ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares que controlan la morfología orgánulo y su distribución dentro de una célula. Sin embargo, este enfoque tiene la limitación obvia de analizar estos procesos a un punto final específico. El proceso de control de la morfología y la distribución de los orgánulos es probable que sea muy dinámico y para variar no sólo entre diferentes ty célulapes sino también dentro de la misma celda en función del estado de desarrollo o fisiológico. Una implementación adicional de este análisis estaría representada por la imagen de lapso de tiempo que permite cambios en la morfología orgánulo y la posición a ser monitorizados con el tiempo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro-Pinzas 0,3 mm x 0,25 mm	Fine Science Tools	11030-12
Placas de disección Sylgard	SIGMA-ALDRICH	76103	Mezcle la base de elastómero prepesada con el agente de curado. Vierta la mezcla en una placa de Petri de 5 cm. Deje que se cure a 60 ° C durante al menos 24 horas
Pines de acero inoxidable/acero minutiense de 0,1 mm de diámetro	Fine Science Tools	26002-10
Tijeras de microdisección (ultrafinas)	Herramientas de Bellas Ciencias	15200-00
1x PBS (solución salina tamponada con fosfato). Composición: 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7			NaH2PO4 (SIGMA-S8282), Na2HPO4 (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653)
Solución de Bouin. Composición: Ácido pícrico, formaldehído, ácido acético (15:10:1)			pícrico (SIGMA 197378), formaldehído (F8775), ácido acético (SIGMA-1005706)
1x PBT (solución salina tamponada con fosfato con Triton). 1x PBS + 0.1% Triton			Tritón-X100. SIGMA-T8787
Suero de Cabra Normal	SIGMA	G9023
		anti-DVAP para conejillos de indias	proporcionado por el Dr. Giuseppa Pennetta (Universidad de Edimburgo, Reino Unido). Uso con una dilución de 1:200 en 5% NGS
Rabbit anti-HRP (Horseradish peroxidasa)	Jackson ImmunoResearch	123-065-021	Uso en dilución 1:500 en PBT que contiene 5% NGS
Rabbit anti-Lamin antibody			Proporcionado por el Dr. Paul Fisher (Universidad Estatal de Nueva York en Stony Brook). Úselo con una dilución de 1:500 en PBT que contenga 5% de NGS
TO-PRO-3	Sondas moleculares	T3605
Anticuerpo anti-conejo de cabra, Alexa Fluor488, conjugado	Jackson ImmunoResearch	bs-295G-A555-BSS	Uso en dilución 1:500 en PBT que contiene 5% NGS
Anticuerpo IgG anti-conejillo de indias NGS, Cy3, conjugado	Jackson ImmunoResearch	bs-0358G-Cy3-BSS	Uso en dilución 1:500 en PBT que contiene 5% NGS
Medio de montaje Vectashield para Laboratorios de vectores de fluorescencia		H-1000