El ensayo del cometa alcalino mide las roturas de la cadena de ADN en las células eucariotas. Al agregar un paso de digestión de endonucleasa III o 8-oxoguanina-ADN-N-glicosilasa humana, el ensayo puede detectar de manera eficiente el daño oxidativo del ADN. Describimos los métodos para usar estos ensayos para detectar daños en el ADN en el hígado de rata.
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Artículo de método
En Vivo alcalina Comet Assay y Comet Assay alcalina modificada con enzimas para la medición de roturas en el ADN Strand y daño oxidativo del ADN en el hígado de rata
En este artículo
Resumen
Resumen
El daño no reparado en el ADN puede provocar inestabilidad genética, lo que a su vez puede mejorar el desarrollo del cáncer. Por lo tanto, la identificación de posibles agentes dañinos para el ADN es importante para proteger la salud pública. El ensayo de cometa alcalino in vivo, que detecta el daño en el ADN a medida que se rompe la hebra, es especialmente relevante para evaluar los peligros genotóxicos de los xenobióticos, ya que sus respuestas reflejan la absorción, distribución tisular, metabolismo y excreción (ADME) in vivo de productos químicos, así como el proceso de reparación del ADN. En comparación con otros ensayos de daño del ADN in vivo, el ensayo es rápido, sensible, visual y económico, y, al convertir el daño oxidativo del ADN en roturas de hebras utilizando enzimas de reparación específicas, el ensayo puede medir el daño oxidativo del ADN de una manera eficiente y relativamente libre de artefactos. La medición del daño en el ADN con el ensayo cometa se puede realizar utilizando diseños de estudio de toxicología aguda y subcrónica, y al integrar el ensayo cometa con otras evaluaciones toxicológicas, el ensayo aborda los requisitos de bienestar animal al aprovechar al máximo los recursos animales. Otra ventaja importante de los ensayos es que solo requieren una pequeña cantidad de células, y las células no tienen que derivarse de poblaciones celulares en proliferación. Los ensayos también se pueden realizar con una variedad de muestras humanas obtenidas de individuos expuestos clínica u ocupacionalmente.
Introducción
El ensayo cometa alcalino mide roturas de la cadena de ADN a nivel de una sola célula. Las suspensiones de células individuales están incrustadas en agarosa sobre un portaobjetos de microscopio y las células se lisaron para formar nucleoides, que contienen bucles superenrollado de ADN. Electroforesis a pH> 13 resultados en la pérdida de superenrollamiento en los bucles de ADN que contienen roturas de la cadena, con las hebras de ADN liberados que migran hacia el ánodo, creando estructuras parecidas a cometas que pueden ser observadas por microscopía de fluorescencia. La fragmentación de ADN migra de la "cabeza" del cometa en la "cola" en función del tamaño del fragme....
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Protocolo
Ética declaración: Los procedimientos que implican animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) en el / Centro Nacional de Investigación de la FDA para toxicológica.
NOTA: El diseño del estudio descrito aquí se basa en el protocolo desarrollado por el Centro Japonés para la Validación de Métodos Alternativos (JaCVAM) para su validación de la prueba in vivo de roedores cometa alcalino 18, y aún más modifica en función de las recomendaciones de la OCDE directriz TG489 19 .
1. Preparación
- preparación de los portaobjeto....
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Resultados
El ensayo cometa alcalino in vivo se llevó a cabo en conjunción con el ensayo de cometa modificado por la enzima para medir tanto la lesión directa del ADN y oxidativo en el hígado de ratas tratadas con acetato de ciproterona (CPA) 5. CPA es un fármaco hormonal sintético que induce tumores de hígado de rata de una manera específica de un sexo, con cinco veces las dosis más altas necesarias para inducir tumores de hígado en ratas macho en comparación con hembras d.......
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Discusión
Este protocolo describe la medición simultánea de tanto el daño de ADN directa y oxidativo en el hígado de rata a nivel de células individuales. El protocolo general es aplicable a cualquier tejido del que las células individuales o núcleos se pueden aislar con un mínimo de daño en el ADN de procesamiento inducida (es decir, el daño del ADN inducido no por el agente de ensayo, pero por el manejo y procesamiento de los tejidos animales). En nuestra investigación, hemos llevado a cabo el ensayo del cometa alcalin.......
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Divulgaciones
Ninguno de los autores tiene intereses contrapuestos o intereses contrapuestos. La información en estos materiales no es una difusión formal de información por parte de la FDA y no representa la posición o política de la agencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. Agradecemos la publicación original del estudio de CPA por parte de Elsevier B.V.: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. Análisis de dosis-respuesta específica por sexo de la genotoxicidad en ratas F344 tratadas con acetato de ciproterona. Investigación de mutaciones 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cubreobjetos (n.º 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
| Portaobjetos de microscopio | Fisher | 12-550-123 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Fisher | 67-68-5 | |
| EDTA, Fisher disódico | BP120-1 | ||
| Solución salina tamponada con fosfato | Fisher | ICN1860454 | |
| 1x Solución salina equilibrada Hanks (HBSS) (Ca2+, Mg2+ libre) | HyClone | SH30588.02 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Agarosa de bajo punto de fusión ( LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarosa |
| Gammarosa de fusión normal (NMA) | Fisher | BP1356-100 | |
| Tiras de papel de prueba de pH (pH 7,5-14) | Fisher | M95873 | |
| Cloruro de potasio | Fisher | 7447-40-7 | |
| Hidróxido de potasio | Fisher | 1310-58-3 | |
| etiquetas portaobjetos (0,94 x 0,5 pulg.) | Fisher | NC9822036 | |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
| Hidróxido de sodio (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
| SYBR&comercio; Oro | Invitrogen | S11494 | |
| Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | |
| Trizma Base | Fisher | 77-86-1 | |
| Tubos de microcentrífuga de 2,0 ml | Fisher | 05-402-6 | |
| Colador de células (40 µ m) | Fisher | 22363547 | |
| Endonucleasa III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Dilución 1:1.000 |
| hOGG1 | M0241S | de New England Biolabs | 1:1.000 |
Referencias
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiati....
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Reimpresiones y permisos
