La cuantificación de la expresión de la proteína y Co-localización Uso de multiplexado inmunohistoquímica y tinción de imágenes multiespectrales

Summary

La inmunohistoquímica es una poderosa técnica de laboratorio para evaluar la localización y expresión de proteínas dentro de los tejidos. Los métodos semiautomatizados actuales de cuantificación introducen subjetividad y, a menudo, crean resultados irreproducibles. En este trabajo, describimos los métodos para la inmunohistoquímica multiplexada y la cuantificación objetiva de la expresión y colocalización de proteínas mediante imágenes multiespectrales.

Abstract

La inmunohistoquímica es una técnica de detección clínica y de laboratorio de investigación comúnmente utilizada para investigar la expresión y localización de proteínas dentro de los tejidos. Se han desarrollado muchos sistemas semicuantitativos para puntuar la expresión mediante inmunohistoquímica, pero la subjetividad inherente limita la reproducibilidad y la precisión de los resultados. Además, la investigación de biomarcadores espacialmente superpuestos, como los factores de transcripción nuclear, es difícil con las técnicas actuales de inmunohistoquímica. Hemos desarrollado y optimizado un sistema para la investigación simultánea de múltiples proteínas utilizando métodos de alto rendimiento de inmunohistoquímica multiplexada e imágenes multiespectrales. La inmunohistoquímica multiplexada se realiza mediante la aplicación secuencial de anticuerpos primarios con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina. Se utilizan diferentes cromógenos para detectar cada proteína de interés. Los portaobjetos manchados se cargan en un escáner de portaobjetos automatizado y se crea un protocolo para la adquisición automatizada de imágenes. Una biblioteca espectral se crea tiñendo un conjunto de portaobjetos con un solo cromógeno en cada uno. Un subconjunto de imágenes teñidas representativas se importa en el software de imágenes multiespectrales y se crea un algoritmo para distinguir el tipo de tejido definiendo los compartimentos de tejido en las imágenes. Los compartimentos subcelulares se segmentan mediante el uso de contratinción de hematoxilina y el ajuste del algoritmo intrínseco. Se aplican umbrales para determinar la positividad y la colocalización de proteínas. A continuación, el algoritmo final se aplica a todo el conjunto de tejidos. Los datos resultantes permiten al usuario evaluar la expresión de proteínas en función del tipo de tejido (por ejemplo, epitelio frente a estroma) y el compartimento subcelular (núcleo frente a citoplasma frente a membrana plasmática). El análisis de colocalización permite la investigación de tipos de células dobles positivas, dobles negativas y monopositivas. La combinación de imágenes multiespectrales con inmunohistoquímica multiplexada y adquisición automatizada de imágenes es un método objetivo y de alto rendimiento para la investigación de biomarcadores dentro de los tejidos.

Introduction

La inmunohistoquímica (IHC) es una técnica de laboratorio estándar para la detección de la proteína en el tejido, y IHC es aún ampliamente utilizado en la investigación y diagnóstico de la patología. La evaluación de la tinción IHC es a menudo semi-cuantitativa, la introducción de sesgo potencial en la interpretación de los resultados. Muchos enfoques semi-cuantitativos se han desarrollado que incorporan tanto intensidad de la tinción y el grado de tinción en diagnóstico final ^1-4. Otros sistemas incluyen la intensidad de puntuación y la ubicación subcelular con el fin de localizar mejor expresión ^5. La incorporación de las puntuaciones me....

Protocol

NOTA: El protocolo en la presente memoria describe la tinción y análisis de un microarray de tejido (TMA), descrita anteriormente ^12,17,18. La sección de TMA de espesor 4 m se obtuvo de un bloque de parafina usando un microtomo estándar.

NOTA: Una biblioteca espectral para las 4 cromógenos y de contraste debe ser creado para una imagen cuantificación. Con el fin de hacer esto, el protocolo optimizado para cada anticuerpo individual debe ser ejecutado con un anticuerpo por diapositiva, menos la contratinción final. Una quinta diapositiva debe ser teñidas con hematoxilina para generar los 5 imágenes necesarias para crear la biblioteca espectral.

Results

En la Figura 1, la formación se realiza en tejidos de la próstata de las imágenes del segmento en porciones epiteliales y del estroma, junto con el compartimiento de no tejido. Mediante el uso de la membrana epitelial marcador de E-cadherina, la segmentación de las células se realizó para separar el núcleo, citoplasma, y las porciones de membrana, que se muestran en la Figura 2.

En un experime.......

Discussion

El uso de inmunohistoquímica tradicional para evaluar la expresión de proteínas está limitada por métodos subjetivos, semi-cuantitativos de análisis ^22,23. plataformas de avance se han creado para el análisis de alto rendimiento de expresión de biomarcadores y la localización. la segmentación detallada de ambos tejidos y compartimentos subcelulares permite a los usuarios estudiar la expresión de biomarcadores, localización y co-localización con otros marcadores de interés. En estudios previos, se ha demostrad.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xileno	Fisher Chemical	X3F1GAL	Calificación NFPA: Salud – 2, Fuego – 3 , Reactividad – 0
Alcohol etílico-200 a prueba	Fisher Scientific	4355223	Calificación NFPA: Salud – 0, Fuego – 3 , Reactividad – 0
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	Calificación NFPA: Salud – 2, Fuego – 0 , Reactividad – 0
Tris Hidroximetilaminometano HCl	Fisher Scientific	BP153-1	Clasificación NFPA: Salud – 2, Fuego – 0 , Reactividad – 0
Tween 20	Chem-Impex	1512	Clasificación NFPA: Salud – 0, Fuego – 1 , Reactividad – 0
Solución salina tamponada con fosfato	Fisher Scientific	BP2944-100	Clasificación de la NFPA: Salud – 1, fuego – 0 , Reactividad – 0
Peroxidazed	Biocare Medical	PX968	Evite el contacto con la piel y los ojos. Puede causar irritación de la piel y daño ocular.
Receptor de estrógeno alfa	Thermo Fisher Scientific-Labvision	RM9101	No clasificado como peligroso
Receptor de andrógenos	SCBT	sc-816	No clasificado como peligroso
CD147	Biodesign	P87535M	No clasificado como peligroso
E-cadherina	Dako	M3612	No clasificado como peligroso
Renoir Red Andibody Diluyent	Biocare Medical	PD904	Está especialmente diseñado para trabajar con anticuerpos basados en Tris
Cámara de DeCloaking	Biocare Medical	Modelo DC2002	Tome las precauciones normales para usar una olla a presión
Pluma de barrera-Immuno Edge	Vector Labs	H-4000
Kit de desnaturalización-Paso de elución	Biocare Medical	DNS001H	No clasificado como peligroso
Mach 2 Polímero HRP de cabra HRP Biocare	Medical	RHRP520	No clasificado como peligroso
Mach 2 Polímero anti-conejo de cabra AP RALP525	médico Biocare No		clasificado como peligroso
Mach 2 Polímero HRP anti-ratón de cabra	Biocare Medical	M3M530	No clasificado como peligroso
Betazoid DAB Chromogen Kit Biocare	Medical	BDB2004	1. Se sabe que se sospecha que el DAB es un carcinógeno. 2. No exponga los componentes DAB a la luz intensa ni a la luz solar directa. 3. Use equipo y ropa de protección personal adecuados. 4. El DAB puede causar sensibilización de la piel. Evite el contacto con la piel y los ojos. 5. Observe todas las normas ambientales federales, estatales y locales con respecto a la eliminación
de residuos Kit de cromo rojo deformación	Biocare Medical	WR806	Corrosivo. Ácido que puede causar irritación de la piel o daño ocular.
Vina Green Chromogen Kit Biocare	Medical	BRR807	Nocivo si se ingiere
Bajoran Purple Chromogen Kit	Biocare Medical	BJP807	Líquido inflamable. Mantener alejado del calor, las llamas y las chispas. Nocivo por ingestión o absorción. Evite el contacto con la piel o los ojos, y evite la inhalación.
Gato Hematoxilina	Biocare Médico	CATHE	Púrpura   solución   con   a   leve   acético   ácido   (vinagre)   olor.   Mayo   be   irritante   a   piel   o   ojos.   Evitar   Contacto   con   piel   y   ojos.   Evitar   ingestión.
Medios de montaje XYL	Richard Allen	8312-4	Clasificación NFPA: Salud – 2, Fuego – 3 , Reactividad – 0
1.5 Cubreobjetos	Marca Fisher 22266858		Bordes afilados
Incubación (Humedad)Cámara	obsoleta obsoleta		Múltiples proveedores disponibles
Horno de convección	Stabil- Therm	C-4008-Q
Fondo Reactivo bloqueador Punisher	Biocare Medical	BP974	Este producto no está clasificado como peligroso.
Software inForm	PerkinElmer	CLS135781	Software de imágenes multiespectrales primario utilizado en manuscritos
Software Nuance	PerkinElmer	Nuance EX	Software utilizado para crear bibliotecas espectrales dentro de manuscritos
Microscopio y escáner de portaobjetos Vectra	PerkinElmer	VECTRA	Escáner de portaobjetos y microscopio automatizado para la obtención de cubos de imágenes IM3