Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración

Summary

Describimos un protocolo para amplificar los sitios de integración retroviral a partir del ADN genómico de las células infectadas, secuenciar las uniones virus-huésped amplificadas y luego mapear estas secuencias a un genoma de referencia. También describimos técnicas para cuantificar la distribución de los sitios de integración en relación con diversas anotaciones genómicas utilizando BEDTools.

Abstract

Los retrovirus presentan preferencias de integración de la firma en tanto a escala local y global. A continuación, presentamos un protocolo detallado para (1) generación de diversas bibliotecas de sitios de integración retroviral utilizando la amplificación por PCR (LM-PCR) mediada por la ligadura y la secuenciación de próxima generación (NGS), (2) el mapeo de la localización genómica de cada virus- sede de unión usando BEDTools, y (3) el análisis de los datos de relevancia estadística. El ADN genómico extraído de células infectadas se fragmenta por digestión con enzimas de restricción o por sonicación. Después del final de reparación de ADN adecuado, enlazadores de doble cadena se ligan en los extremos del ADN, y PCR semi-anidada se llevaron a cabo utilizando cebadores complementarios a tanto el extremo repetición terminal larga (LTR) del virus y el ADN enlazador se ligó. Los cebadores de la PCR llevan secuencias requeridas para la agrupación de ADN durante la NGS, negando la necesidad de la ligadura de adaptador independiente. El control de calidad (QC) se llevó a cabo para evaluar la distribución de tamaño de los fragmentos de ADN y adaptarer incorporación de ADN antes de NGS. los archivos de salida de secuencia se filtran para LTR contiene lee, y las secuencias que definen el LTR y el enlazador se recortan de distancia. secuencias de la célula huésped recortadas se asignan a un genoma de referencia utilizando Blat y se filtran por la identidad mínimamente 97% a un punto único en el genoma de referencia. sitios de integración únicas son examinadas por el nucleótido adyacente (nt) secuencia y distribución relativa de diferentes características genómicas. El uso de este protocolo, las bibliotecas del sitio de integración de alta complejidad se pueden construir a partir de ADN genómico en tres días. por lo tanto, todo el protocolo que abarca la infección viral exógena de células de cultivo de tejidos susceptibles de análisis del sitio de integración puede llevarse a cabo en aproximadamente una a dos semanas. Las aplicaciones recientes de esta tecnología se refieren a análisis longitudinal de los sitios de integración de los pacientes infectados por el VIH.

Introduction

La integración de ADN viral (ADNv) en el genoma de la célula huésped es un paso esencial en el ciclo de vida retroviral. La integración se lleva a cabo por la enzima integrasa viral (IN), que lleva a cabo dos procesos catalíticos diferentes que conducen a la creación de la provirus de forma estable insertado ^1. EN subunidades enganchar los extremos de la ADNv lineal que se genera a través de la transcripción inversa, la formación de la intasome de orden superior con ADNv extremos se mantienen unidos por un multímero IN ^2-4. EN escinde 'extremos de la vDNA aguas abajo de 5'-CA-3 invariantes' el 3 secuencias en un proceso conocido como....

Protocol

1. Generar las reservas de virus

Nota: Un diagrama de flujo del banco aspecto húmedo de este protocolo se representa en la Figura 1 Los detalles de la producción cepa vírica y la posterior infección de células de cultivo de tejidos por lo general se aplican a diferentes tipos de retrovirus.. Para algunos experimentos, la célula diana puede no expresan el receptor viral endógeno (s), y en tales casos la construcción de partículas retrovirales pseudotyped albergan glicoproteína de la envoltura viral heterólogo, por ejemplo, la glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), será necesaria para la infec....

Results

La Tabla 4 muestra los resultados de un experimento representativo para ilustrar la sensibilidad de NGS para la recuperación de los sitios de integración a partir de un cultivo de células infectadas. ADN celular no infectadas se utilizó para diluir en serie de ADN genómico a partir de una infección en la que cada célula en promedio contenía una integración ^40. Las diluciones se preparan en pasos de cinco a una dilución máxima de 1: 15.625. El ADN genómico de l.......

Discussion

Un protocolo para el análisis de los sitios de integración retroviral, de la etapa inicial de infección por el virus a través de mapeo de los patrones de distribución genómicas, se describe. Este protocolo es aplicable a cualquier retrovirus y cualquier tipo de célula infectable. Además, la tubería de ensayo es muy sensible, con el potencial para recuperar un número satisfactorio de los sitios de integración únicas de diluciones seriadas de ADN genómico equivalente a la de una infección iniciado con una MOI de 6,4 x 10 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	11965-084	Medio de cultivo celular estándar, compatible con células HEK293T
Suero fetal bovino	Thermo Scientific	SH 30088.03	Es posible que sea necesario realizar una evaluación previa de diferentes lotes de suero para una producción viral óptima
Penicilina/estreptomicina	Corning	30-002-Cl	Antibióticos que se agregarán a DMEM
Solución salina tamponada con fosfato	Mediatech	21-040-CV	Se utiliza para lavar células
Tripsina EDTA	Corning	25-053-CI	Se utiliza para separar células adherentes de placas de cultivo de tejidos
PolyJet	SignaGen Laboratories	SL100688	reactivo de transfección de ADN
0.45 µ m Filtros	Thermo Scientific	09-740-35B	Se utiliza para filtrar medios de cultivo celular que contienen partículas de virus
Turbo DNase	Ambion	AM2239	Se utiliza para degradar el ADN plasmídico arrastrado de las existencias de virus
VIH-1 p24 Ensayo de captura de antígeno	ABL Inc.	5447	Se utiliza para cuantificar el rendimiento de la producción de virus
DNeasy Blood & Kit de tejido	Qiagen	69506	Se utiliza para purificar el ADN genómico de las células
Sonicator	Covaris	S2	Con este modelo de sonicador realice dos rondas de ciclo de trabajo, 5%; intensidad, 3; ciclos por ráfaga, 200; tiempo, 80 seg
Agua sin nucleasas	GeneMate	G-3250-125	Se recomienda el uso de agua disponible comercialmente para reducir la posibilidad de contaminación cruzada de la muestra
QIAQuick PCR Purificación Kit	Qiagen	28106	Se utiliza para purificar el ADN durante la construcción de la biblioteca
Kit de reparación de extremos de ADN End-It	Epicentre	ER81050	Se utiliza para reparar los extremos de ADN de muestras de ADN sonicadas
Fragmento de Klenow (3'-5' exo–)	New England Biolabs (NEB)	M0212S	Se utiliza con dATP para fragmentos de ADN reparados de la cola A
dATP	Thermo Scientific	R0141	Trifosfato de desoxiadenosina
MseI	NEB	R0525L	Endonucleasa de restricción para la escisión del ADN genómico
BglII	NEB	R0144L	Endonucleasa de restricción para suprimir la amplificación de la secuencia ascendente del VIH-1 U5
T4 ADN ligasa	NEB	M0202L/6218	Enzima para la unión covalente de extremos de ADN
compatibles Oligonucleótidos	de ADN Tecnologías de ADN integradas	personalizadas	Haga que la empresa purifique los oligos. La purificación por HPLC es suficiente para los ADN< 30 nucleótidos; PAGE purifica ADNs más largos
Advantage 2 Mezcla de polimerasa	Clontech	639202	Mezcla comercial que contiene ADN polimerasa para PCR
dNTPs (soluciones de 100 mM)	Thermo Scientific	R0181	Diluir los cuatro productos químicos en hielo con agua estéril para alcanzar las concentraciones intermedias de 2,5 mM cada dNTP
NanoDrop	Espectrofotómetro Thermo Scientific	NanoDrop 2000	para la determinación de la concentración
de ADNFluorímetro Qubit Life	Technologies	Fluorímetro Qubit® 3.0	utilizado para confirmar la concentración de ADN de la biblioteca del sitio de integración
2200 TapeStation System	Agilent	G2964AA	Ensayo basado en cinta para confirmar la distribución del tamaño del ADN de la biblioteca del sitio de integración
MiSeq	Illumina	SY-410-1003	utilizado para NGS