Artículo de método

Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración

DOI:

10.3791/53840

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22 de marzo de 2016

 ,  , 
1Department of Cancer Immunology and AIDS, Dana-Farber Cancer Institute, 2Chromatin Structure and Mobile DNA, The Francis Crick Institute

En este artículo

Resumen

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Describimos un protocolo para amplificar los sitios de integración retroviral a partir del ADN genómico de las células infectadas, secuenciar las uniones virus-huésped amplificadas y luego mapear estas secuencias a un genoma de referencia. También describimos técnicas para cuantificar la distribución de los sitios de integración en relación con diversas anotaciones genómicas utilizando BEDTools.

Resumen

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Los retrovirus presentan preferencias de integración de la firma en tanto a escala local y global. A continuación, presentamos un protocolo detallado para (1) generación de diversas bibliotecas de sitios de integración retroviral utilizando la amplificación por PCR (LM-PCR) mediada por la ligadura y la secuenciación de próxima generación (NGS), (2) el mapeo de la localización genómica de cada virus- sede de unión usando BEDTools, y (3) el análisis de los datos de relevancia estadística. El ADN genómico extraído de células infectadas se fragmenta por digestión con enzimas de restricción o por sonicación. Después del final de reparación de ADN adecuado, enlazadores de doble cadena se ligan en los extremos del ADN, y PCR semi-anidada se llevaron a cabo utilizando cebadores complementarios a tanto el extremo repetición terminal larga (LTR) del virus y el ADN enlazador se ligó. Los cebadores de la PCR llevan secuencias requeridas para la agrupación de ADN durante la NGS, negando la necesidad de la ligadura de adaptador independiente. El control de calidad (QC) se llevó a cabo para evaluar la distribución de tamaño de los fragmentos de ADN y adaptarer incorporación de ADN antes de NGS. los archivos de salida de secuencia se filtran para LTR contiene lee, y las secuencias que definen el LTR y el enlazador se recortan de distancia. secuencias de la célula huésped recortadas se asignan a un genoma de referencia utilizando Blat y se filtran por la identidad mínimamente 97% a un punto único en el genoma de referencia. sitios de integración únicas son examinadas por el nucleótido adyacente (nt) secuencia y distribución relativa de diferentes características genómicas. El uso de este protocolo, las bibliotecas del sitio de integración de alta complejidad se pueden construir a partir de ADN genómico en tres días. por lo tanto, todo el protocolo que abarca la infección viral exógena de células de cultivo de tejidos susceptibles de análisis del sitio de integración puede llevarse a cabo en aproximadamente una a dos semanas. Las aplicaciones recientes de esta tecnología se refieren a análisis longitudinal de los sitios de integración de los pacientes infectados por el VIH.

Introducción

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La integración de ADN viral (ADNv) en el genoma de la célula huésped es un paso esencial en el ciclo de vida retroviral. La integración se lleva a cabo por la enzima integrasa viral (IN), que lleva a cabo dos procesos catalíticos diferentes que conducen a la creación de la provirus de forma estable insertado 1. EN subunidades enganchar los extremos de la ADNv lineal que se genera a través de la transcripción inversa, la formación de la intasome de orden superior con ADNv extremos se mantienen unidos por un multímero IN 2-4. EN escinde 'extremos de la vDNA aguas abajo de 5'-CA-3 invariantes' el 3 secuencias en un proceso conocido como 3'-procesamiento, dejando empotrados 3 'termina con grupos hidroxilo reactivos en cada vDNA terminal 5-8. El intasome se importa posteriormente en el núcleo como parte de una gran asamblea de huésped y las proteínas virales conocidas como el complejo de pre-integración (PIC) 9-11. Después de encontrarse con el ADN diana celular (tDNA), EN utiliza el vDNA 3'-hidroxilo groups para escindir la parte superior tDNA y hebras de fondo de forma escalonada y al mismo tiempo se une a la vDNA a grupos fosfato tDNA 5 'a través del proceso de transferencia de la cadena 12,13.

Retrovirus preferencias integración de exposiciones en las escalas locales y globales. A nivel local, los sitios de integración de consenso se componen de secuencias palindrómicas tDNA débilmente conservado que se extienden a partir de entre cinco y diez pares de bases aguas arriba y aguas abajo de los sitios de inserción vDNA 14,15. A nivel mundial, los retrovirus se dirigen a las anotaciones de la cromatina específicos 16. Hay siete diferentes géneros retrovirales - alfa a través épsilon, Lenti, y spuma. Los lentivirus, que incluyen el VIH-1, a favor de la integración dentro de los cuerpos de los genes transcritos activamente 17, mientras que los gammaretroviruses integran preferentemente en sitios de inicio de la transcripción (DST) y las regiones potenciadoras activos 18-20. En agudo contraste, spumavirus está fuertemente sesgada hacia heterochromATIC regiones, tales como dominios de lámina gen asociado a los pobres 21. Las preferencias locales de base tDNA son en gran parte dictado por las redes de contactos específicos de la nucleoproteína entre IN y tDNA 13,22,23. Para los lentivirus y gammaretroviruses, en relación con la integración genómica anotaciones se debe en gran parte regulado por las interacciones entre IN y factores celulares afines 24-27. La alteración de las características específicas de la red de interacción EN-tDNA 13,22,23,28 y perturbar o re-ingeniería en el huésped interacciones de los factores 25-27,29-32 han demostrado estrategias para reorientar la integración en los niveles locales y globales, respectivamente.

El poder de procedimientos de secuenciación de ADN utilizados para catalogar los sitios de integración retroviral se ha incrementado enormemente en los últimos decenios. Sitios de integración se recuperaron en el trabajo pionero de purificación laborioso y utilizando técnicas de clonación manuales para producir sólo un puñado de sitios únicos por 33,34 estudio.La combinación de la amplificación LM-PCR de los cruces de ADN LTR-huésped con la capacidad de asignar sitios de integración individuales a los genomas de los proyectos de humanos y de ratón transformadas el campo, con el número de sitios recuperados de infecciones de células de cultivo de tejidos exógeno creciente a varios cientos a miles 17 , 18. La combinación más reciente de LM-PCR con la metodología NGS ha enviado incremento exorbitante profundidad biblioteca. En concreto, la pirosecuenciación produjo en el orden de decenas de miles de sitios de integración únicas 30,35-38, mientras que las bibliotecas secuenciaron mediante el uso de la agrupación de ADN pueden producir millones de secuencias únicas 19-21,39. A continuación se describe un protocolo de LM-PCR optimizado para amplificar y secuenciar los sitios de integración retroviral utilizando NGS agrupación de ADN. El método incorpora requiere secuencias adaptadoras en los cebadores de PCR y por lo tanto directamente en las moléculas de ADN amplificados, impidiendo de ese modo el requisito de un paso adaptador de ligadura adicional antes de Sequencing 40. El oleoducto análisis bioinformático, desde el análisis de la secuencia de datos en bruto para LTR-anfitrionas cruces de ADN a la cartografía de los sitios de integración únicas de características genómicas pertinentes, también se describe en general. De acuerdo con la preferencia establecida a partir de los protocolos metodológicos previos en este campo 36,38,41-43, scripts personalizados pueden ser desarrollados para ayudar a la realización de medidas específicas en el gasoducto bioinformática. La utilidad y la sensibilidad del protocolo se ilustra con datos representativos mediante la amplificación, secuenciación y el mapeo de VIH-1 sitios de integración a partir de células de cultivo de tejidos infectados en la multiplicidad aproximada de infección (MOI) de 1.0, así como una serie de titulación de este ADN diluido a través del ADN celular no infectada en 5 veces pasos para una dilución máxima de 1: 15.625 para producir el aproximado MOI equivalente de 6,4 x 10 -5.

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Protocolo

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1. Generar las reservas de virus

Nota: Un diagrama de flujo del banco aspecto húmedo de este protocolo se representa en la Figura 1 Los detalles de la producción cepa vírica y la posterior infección de células de cultivo de tejidos por lo general se aplican a diferentes tipos de retrovirus.. Para algunos experimentos, la célula diana puede no expresan el receptor viral endógeno (s), y en tales casos la construcción de partículas retrovirales pseudotyped albergan glicoproteína de la envoltura viral heterólogo, por ejemplo, la glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), será necesaria para la infección 44,45.

Nota: Se deben tomar precauciones cuando se trabaja con el VIH-1. Aunque las directrices específicas varían de una institución a otra, todo el trabajo basado en el virus debe llevarse a cabo en un gabinete dedicado, operador restringido de seguridad biológica (típicamente referido como una campana de cultivo de tejidos). equipo de protección personal adecuadoque incluye protección para la cara, cubiertas del zapato, una capa doble guante, y un traje de buzo de cuerpo completo se debe usar en todo momento. Todos los desechos líquidos resultantes de experimentos relacionados con los virus debe inactivarse con cloro (concentración final 10%), y todos los residuos sólidos incluyendo debe esterilizarse en autoclave antes de su eliminación.

  1. Un día antes de la transfección, la placa de 3,3 x 10 6 células HEK293T en 10 ml de de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% (v / v) de suero bovino fetal y 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina (10.000 U / ml de solución madre) en cada una de las cinco placas de 100 mm.
    Nota: Complementado-DMEM se conoce como DMEM-FPS partir de este momento.
  2. En el día posterior, transfectar las células con 10 g de plásmido que lleva clones moleculares retrovirales de longitud completa o 9 g de los vectores de una sola ronda de borrado del sobre-con 1 g de una construcción de expresión de VSV-G utilizando reactivos de transfección disponibles comercialmente o fosfato de calcio.
    1. Incubar la cells a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular humidificado con un 5% de CO 2 (esta condición de aquí en adelante referidos como "cultura del tejido incubadora"). Después de aproximadamente 48 horas, la cosecha de los medios de comunicación celular que contiene el virus usando una pipeta volumétrica y pasarlo a través de un filtro de 0,45 micras por flujo de gravedad.
    2. Se concentra el virus mediante ultracentrifugación a 200.000 xg durante 1 hora a 4 ° C. Resuspender el sedimento de virus en 500 l DMEM-FPS que contiene 20 U de DNasa, y se incuba durante 1 hora a 37 ° C.
      Nota: El paso DNasa ayuda a reducir la recuperación de secuencias de plásmido no deseados mediante la eliminación de la peor de ADN de plásmido que persiste desde el procedimiento de transfección.
  3. Determinar la concentración de p24 46 usando un antígeno p24 kit de captura de VIH-1 según las instrucciones del fabricante.
    Nota: La concentración de virus también se puede determinar mediante el ensayo de actividad de transcriptasa inversa 47,48. Alternativamente, el nivel de virus funcionales puedendeterminarse midiendo MOI. Esto se realiza más fácilmente utilizando fluorescencia de células activadas por la clasificación con los virus que expresan genes informadores fluorescentes tales como proteína verde fluorescente. MOI determinación puede ser particularmente útil cuando se trabaja con células primarias pueden no soportar el mismo nivel de infección como líneas celulares optimizados.

2. Las células inocular el virus

  1. Placa 3.0 x 10 5 células HEK293T por pocillo en una placa de 6 pocillos en 2,5 ml de DMEM-FPS e incubar durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos.
    Nota: El número de sitios de integración recuperados únicas con este protocolo es directamente proporcional al número de células y la cantidad de virus activos usados ​​en la infección.
  2. Infectar las células con una concentración viral p24 final de 500 ng / ml en un volumen final de 500 l DMEM-FPS durante 2 horas en una incubadora de cultivo de tejidos, a continuación, añadir 2 ml de DMEM-FPS pre-calentado a 37 ° C por pocillo y se continuar la incubación.
  3. A48 horas después de la infección, eliminar los medios de comunicación y lavar las células con 2 buffer fosfato salino ml (PBS). Añadir 0,5 ml de tripsina-EDTA pre-calentado a 37 ° C, y después de unos pocos segundos una inspección visual de los pozos para el desprendimiento de células.
  4. Añadir 2 ml de DMEM precalentado-FPS y volver a suspender las células mediante pipeteo suave hacia arriba / abajo con una pipeta volumétrica ~ 10 veces. Transferir la solución a un 75 cm matraz de cultivo de tejido que contiene 2 18 ml pre-calentado DMEM-FPS, y se incuban las células en una incubadora de cultivo de tejidos.
  5. Después mínimamente cinco días a partir del inicio de la infección, recoger las células mediante la eliminación de los medios de comunicación, se lava con 5 ml de PBS, añadir 2 ml pre-calentado tripsina-EDTA, y resuspender con 5 ml pre-calentado DMEM-FPS mediante pipeteo. Centrifugar la solución durante 5 min a temperatura ambiente a 2500 xg, y descartar el sobrenadante.
    Nota: Si bien la integración en estas condiciones mesetas en alrededor de 48 horas después de la infección 49,50, se requiere que los 3 días adicionales de cultivo a sufficiently diluir la concentración de moléculas de ADN no integrados que resultan de la recombinación de ADN basado en células o autointegration mediada por virus.
  6. Extraer el ADN genómico del sedimento celular usando un kit comercialmente disponible (por ejemplo, véase 51). Eluir el ADN de la columna de intercambio iónico suministrado con 200 l de 10 mM Tris-HCl, pH 8,5.
    Nota: Una alícuota de células debe repartirse a las 48 horas post-infección (Paso 2.3) para un ensayo de infectividad para asegurar la infección adecuada virus antes de la NGS.

DNA 3. fragmento genómico por sonicación o por digestión con enzimas de restricción

Nota: fragmentos de ADN genómico de sonicación de una manera prácticamente independiente de la secuencia y es por lo tanto el modo de transporte preferido de la fragmentación cuando las muestras de secuenciación con una baja tasa de recuperación esperada (por ejemplo, células de pacientes con infección o infecciones iniciadas a relativamente baja MOI). Además, sonicación permite distinguir los duplicados de PCR de un particular secuencia del sitio de integración de integraciones únicas en el mismo lugar, lo cual es crítico para distinguir la expansión clonal de las células que contienen el provirus en pacientes infectados (véase el paso 11 a continuación) 39,52-54.
Nota: El ADN debe ser escindido inmediatamente aguas abajo de la corriente arriba LTR para disminuir la amplificación de secuencias virales internas durante LM-PCR. La enzima de restricción BglII que se encuentra 43 pb aguas abajo de la secuencia U5 aguas arriba y que es incompatible para la posterior ligación con ADN generados por MseI termina funciona bien con muchas cepas de VIH-1 (Figura 1B). En la preparación de ADN mediante sonicación, la enzima de restricción de escisión interna debe ser aplicada después de la ligación enlazador (véase la Figura 1C - E y Paso 4.3 más abajo).

  1. Para la sonicación, la mezcla 10 g de ADN genómico en agua libre de nucleasa a un volumen final de 120 microlitros. Someter a ultrasonidos utilizando parámetros de un tamaño medio de ruptura de 500 pb (dos rondas de la siguiente párrafom: Ciclo de trabajo: 5%; Intensidad: 3; ciclos por ráfaga: 200; Tiempo: 80 seg).
  2. Se purifica ADN agitado cuando el uso de un kit de purificación de PCR. Reparar el ADN extremos utilizando un kit de reparación de ADN fin y purificar el ADN utilizando un kit de purificación de PCR. Una cola de ADN usando Klenow exo - enzima y purificar el ADN de una cola utilizando un kit de purificación de PCR. Consulte a 51,52 para obtener detalles adicionales de uso del kit.
  3. Para la digestión con endonucleasas de restricción, corte 10 g de ADN genómico durante una noche a 37 ° C en un volumen de 100 l con tampón suministrados por el fabricante y un cóctel de enzimas (100 U cada uno) que generan salientes 5'-TA, así como una enzima incompatible tal como BglII que escinde aguas abajo de la LTR viral aguas arriba. Se purifica el ADN al día siguiente utilizando un kit de purificación de PCR.
    Nota: Ninguno de los enzimas de restricción debe cortar dentro de la terminal de ~ 30 pb del extremo de ADN viral que se amplifica por el protocolo de LM-PCR. Este protocolo amplifica específicamente la U5final de VIH-1 de ADN.

4. recocido oligonucleótidos enlazadores y se liga al ADN genómico fragmentado

Nota: Preparar un enlazador asimétrica que contiene un saliente que es compatible con los fragmentos de ADN anteriores (véase la Tabla 1 para las secuencias de los oligonucleótidos utilizados en este protocolo). El enlazador que se utiliza con ADN agitado cuando debe contener una compatible 'pendiente T-3, mientras que el enlazador de DNA digerido con MseI debe contener un saliente compatible 5'-TA (Figura 1). La cadena enlazadora corta debe contener, además, una modificación química no extensible, tal como 3'-amina, para limitar las reacciones de amplificación subsiguientes hacia el ADN de interés.
Nota: En la preparación de varias bibliotecas del sitio de integración diferentes en paralelo y / o cuando las muestras únicas de multiplexación en el mismo plazo de secuenciación, se recomienda utilizar conectores únicos para cada muestra para limitar el potencial para la muestra cruzada Contaminación durante la PCR. Esto implica, además, el uso de cebadores de enlazadores únicos para cada muestra durante la PCR semi-anidada (descrito a continuación). Hilos enlazadores únicos y cebadores de engarce pueden ser diseñados por aleatorización las secuencias de oligonucleótidos enlazadores enumerados en la Tabla 1 mientras se mantiene el contenido de GC% global similar y posiciones voladizo aplicables.

  1. Recocer la cortas y largas hebras de engarce en 35 l de 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 a 0,1 mM EDTA (concentración final de 10 mM de cada oligonucleótido) por calentamiento a 90 ° C y enfriar lentamente a temperatura ambiente en pasos de 1 ° C por min.
  2. Preparar al menos cuatro reacciones de ligación en paralelo por muestra de ADN genómico, que contienen 1,5 mM enlazador se ligó, ADN fragmentado 1 g, y 800 U de T4 DNA ligasa en 50 l. Ligar durante la noche a 12 ° C. Se purifica el día siguiente con un kit de purificación de PCR.
  3. Para las muestras preparadas por sonicación, digerir la reacción de ligación purificada con 100 U de un restricenzima que escinde la corriente abajo de la LTR aguas arriba (por ejemplo, BglII para el VIH-1) bajo el fabricante de las condiciones recomendadas durante la noche. Se purifica el ADN utilizando un kit de purificación de PCR.

5. Amplify virales LTR-Host genómicas de ADN uniones por PCR semi-anidada

Nota: Para asegurar la diversidad de la biblioteca óptima, por lo menos 4-8 PCRs paralelos, dependiendo de la concentración de ADN de la reacción de ligación se recuperó, se debe preparar para cada muestra para las dos rondas de PCR. concentración de molde de ADN debe ser cuantificado mediante espectrofotometría. En este protocolo la primera y segunda rondas de PCR emplean cebadores LTR-anidados específicos, pero el mismo cebador enlazador-específica se utiliza para ambas rondas (Tabla 1). El segundo cebador LTR-específica redondo y las secuencias de cebador adaptador encode-enlazador específico para la agrupación de ADN así como los sitios de unión a cebador de secuenciación. El cebador LTR-específico anidado también codifica una secuencia de índice de 6 nt, whICH se puede variar entre los diferentes cebadores para las bibliotecas de multiplexación dentro de la misma serie de secuenciación.

  1. Preparar primeras PCRs redondas que contienen los ingredientes por tubo como se indica en la Tabla 2.
    Nota: El cebador enlazador específico alberga 22 nt de complementariedad al enlazador, una temperatura de fusión de 53 ° C, un contenido de GC de 45%, y su extremo 3 'se encuentra 15 a 16 pb aguas arriba de la 3' termini de los diferentes enlazador largas hebras (Tabla 1). La primera ronda de 27 nt cebador LTR tiene una temperatura de fusión de 59 ° C, un contenido de GC de 48%, y su extremo 3 'se encuentra 34 pb aguas arriba desde el terminal U5 VIH-1. La región de la segunda imprimación ronda 26 nt LTR que es complementaria a la de VIH-1 LTR tiene una temperatura de fusión de 60 ° C, un contenido de GC de 50%, y su extremo 3 'se encuentra 18 pb aguas arriba de la U5 viral término. Se recomienda que la temperatura de fusión de oligonucleótidos y GC-contenido deben imitar estos parámetros si los usuariosLos cebadores de PCR de diseño con secuencias alteradas (incluyendo para su uso con otros retrovirus) 21.
  2. Ejecutar primera ronda de PCR bajo las siguientes parámetros del termociclador: Un ciclo: 94 ° C durante 2 min; 30 ciclos: 94 ° C durante 15 s, 55 ° C durante 30 seg, 68 ° C durante 45 seg; un ciclo: 68 ° C durante 10 min.
  3. Piscina reacciones y purificar utilizando un kit de purificación de PCR. Preparar segunda PCRs redondas que contienen los ingredientes por tubo según la Tabla 3. Ejecutar la segunda ronda de PCR utilizando los parámetros del termociclador descritos en la etapa 5.2. Reunir las reacciones y se purifica el ADN utilizando un kit de purificación de PCR comercial siguiendo las instrucciones del fabricante.
    Nota: Una variedad de secuencias de índices recomendados compatibles con NGS agrupación de ADN están disponibles 71.

6. Realizar control de calidad y NGS (Típicamente completa con una instalación de secuenciación)

  1. (QC ensayo # 1) Confirmar Paso 5.3 concentración de ADN utilizando una biblioteca de flúor55 metros. Brevemente, se preparan patrones y las muestras experimentales en un volumen final de 200 l de agua libre de nucleasa. tubos de vórtice durante 2-3 segundos, se incuban a temperatura ambiente durante 2 minutos y después se leen las muestras en el fluorómetro.
    Nota: Las muestras deben contener una concentración mínima de 2 nM de ADN de la biblioteca en un volumen mínimo de 15 l.
  2. (QC ensayo # 2) Confirmar la distribución de tamaño de los fragmentos de ADN utilizando un ensayo de 56 basado en cinta.
    Nota: Una distribución ideal es relativamente un pico ancho ADN centrado en torno a 500 pb de longitud. Si una cantidad significativa de material es más grande que 1 kb, entonces se recomienda incorporar un procedimiento de selección de tamaño para eliminar especies de ADN más largos, lo que impedirá la amplificación puente durante el agrupamiento. Por el contrario, si un pico significativo es evidente alrededor de 100 a 200 pb, un dímero cebador puede haberse formado durante la PCR. En este caso, el procedimiento debe ser optimizado para reducir al mínimo la formación de dímeros de cebadores.
  3. (QC ensayo # 3) Confirm incorporación adecuada de los adaptadores en la biblioteca de ADN por PCR cuantitativa 57.
  4. Realizar NGS siguiente bibliografía aplicación del fabricante. Utilizar una espiga-en de 10% (w / w) ΦX174 ADN, que optimizará las métricas de calidad en tiempo real, proporcionando la composición de bases equilibrado de la pista de secuenciación.
    Nota: Los experimentos de secuenciación del sitio de integración se someten normalmente a un solo extremo 150 pb (SE150) o en pares de extremo 150 pb secuenciación (PE150). PE150 es particularmente útil para capturar el punto de unión de engarce en cada molécula de ADN (por ejemplo, al examinar los sitios de integración para la evidencia de la expansión clonal de la célula huésped).

7. Utilice una secuencia de comandos de Python o Perl personalizada puede analizar los datos en secuencia para contener secuencias LTR-LTR, la cosecha de distancia y el enlazador secuencias, y Mapa de referencia del genoma con Blat

  1. FASTA archivos de escaneo para LTR-que contiene la secuencia lee, LTR de cultivos y secuencias de enlace fuera de secuencia de ADN genómico de acogida, yexportar estas secuencias en un nuevo archivo FASTA. Mapa cosechado lee a la vez un genoma de referencia (por ejemplo, las versiones del genoma hg19 humanos o GRCh38) y el genoma viral utilizando Blat 58, con el sitio de integración de salida coordenadas exportar a un archivo .txt por separado, con la siguiente configuración:
    stepSize = 6, minIdentity = 97, y = 0 maxIntron
  2. Analizar la salida Blat archivo .txt, eliminar autointegrations (es decir, la evidencia de que el extremo LTR ha integrado en una región interna del genoma de ADN viral) y otras secuencias de mapeo para el genoma del VIH-1, y crear una salida separada .txt archivo en el que todos los sitios de integración duplicados se han condensado en individuales, los accesos de coordenadas únicas.

8. Crear archivos .bed que tengan intervalos de 15-nt integraciones de contorno, convertir estos archivos a FASTA, y construir Secuencia Logos a las preferencias de visualización base circundantes sitios de integración

  1. Crear archivos .bed que enumeran un intervalo de bases decada sitio de integración. Al menos 15 bases (5 aguas arriba y aguas abajo 10) se sugieren para la generación de secuencia logo. Generar un archivo FASTA de estos archivos .bed mediante el uso de la función de fastaFromBed BEDTools 59 y este comando:
    -fi / directorio fastaFromBed / a / referencia / genoma / -name -s -ropa 15_base_pair_file.bed -fo output_file.fasta
    Nota: El viral 5'-CA-3 'dinucleótido invariante se une a la sede de ADN durante la integración, y la verificación de la unión de la terminal LTR de ADN celular es un filtro inicial importante identificar de buena fe sitios de integración. Estamos, además, compilar la secuencia logotipos de esta población de acogida secuencia de ADN para verificar los resultados experimentales. Como los retrovirus Preferencias de visualización de base de firma que rodean sus sitios de integración 14,15, los logos de secuencia sirven para validar que los sitios genómicos mapeadas surgieron través de la integración mediada por IN en comparación con otros mecanismos de recombinación tales como ADN no homólogaponer fin a unirse a 60,61.
  2. Uso WebLogo 3 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) para crear la secuencia logotipos de los archivos FASTA. Haga clic en "Seleccionar archivo" para cargar el archivo FASTA, y utilizar los siguientes ajustes: Formato de visualización, PDF (vector); tamaño del logotipo, grande; En primer número de la posición, -5; Logo gama, -5 a 5; la escala del eje Y, 0.1, eje Y espaciamiento tic, 0,5, Combinación de colores, clásico (NA).

9. Crear base central Par .bed archivos, la verificación de la muestra de la contaminación cruzada, y el mapa de la distribución de los únicos sitios de integración relativa a rasgos pertinentes genómicas

  1. Dado que la integración retroviral se produce de forma escalonada a través de las hebras tDNA, ajustar las coordenadas precisas de los sitios de integración para reflejar el pb central de la duplicación sitio diana para la correcta correspondencia de distribución genómica en relación con las características genómicas.
    1. Por lo tanto, para los 5 pb duplicación de virus como el VIH-1, cree un archivo .bed con el desplazamiento desde el centro i pbEl sitio ntegración por dos bases abajo para las integraciones de mapeo a la cadena positiva, y dos bases por delante para las integraciones de mapeo a la cadena menos.
  2. Para comprobar si hay contaminación cruzada de la muestra, calcular el número de sitios de integración comunes entre las diferentes bibliotecas mediante el uso de las BEDTools función se cruzan para intersectar pb centro .bed archivos para dos muestras diferentes y siguiendo este orden:
    bedtools se cruzan -a -b central_basepair_1.bed central_basepair_2.bed -f 1,00 -r -s> overlap1v2.txt
  3. Contar el número de líneas del archivo overlap1v2.txt de salida con el fin de cuantificar la cantidad exacta de los puntos comunes entre las dos bibliotecas utilizando el siguiente comando:
    wc -l overlap1v2.txt
  4. Descargar el archivo .bed RefSeq anotación para la versión del genoma de referencia que se utilizó para el mapeo del sitio de integración de la base de datos UCSC anotación del genoma (por ejemplo http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg38/dade bases de) 62.
    1. Calcular el número de sitios de integración que caen dentro de los genes RefSeq utilizando los BEDTools función se cruzan para intersectar el archivo .bed par de bases central que se ha generado para la muestra con la RefSeq archivo .bed siguiente comando:
      bedtools se cruzan -a -b central_basepair_1.bed RefSeq_hg38.bed -u> RefSeq_sample1.bed
  5. Contar el número de líneas del archivo RefSeq_sample1.bed de salida con el fin de cuantificar la cantidad exacta de los puntos que caen en RefSeq genes utilizando el siguiente comando:
    wc -l RefSeq_sample1.bed
  6. Repita los pasos 9.3 y 9.4 para los sitios de integración de mapeo a cualquier otra anotación de interés para los que un intervalo .bed archivo está disponible. Descargar el archivo más reciente .bed la isla CpG de anotación para el genoma de interés de referencia de la base de datos UCSC anotación del genoma como se indica en el paso 9.4.
    1. Calcular el número de sitios de integración que cae dentro de un cierto dipostura (ilustrado en este ejemplo es una ventana de 5 kb) de las islas CpG mediante el uso de la función de ventana BEDTools y después de este comando:
      ventana bedtools -w 2500 central_basepair_1.bed -b CpG_hg38.bed -u> CpG_sample1.bed
  7. Contar el número de líneas del archivo CpG_sample1.bed de salida con el fin de cuantificar la cantidad exacta de los puntos que caen dentro de 2,5 kb aguas arriba o aguas abajo de las islas CpG mediante el siguiente comando:
    wc -l CpG_sample1.bed
  8. Repita los pasos 9.6 y 9.7 para los sitios de integración de mapeo cercano DST. Generar una versión alternativa del archivo RefSeq.bed, donde genómica coordina la asignación a más de un gen se han ajustado para reflejar sólo un único gen presente en esa posición. Esto evita la sobreestimación de la densidad de genes que rodea los sitios de integración. Calcular la densidad de genes en la región 1 Mb que rodea a cada sitio de integración mediante el uso de la función de ventana BEDTools y después de este comando:
    Ventana bedtools -w 500000 central_basepair_1.bed -b RefSeq_hg38_NonRedundant.bed -u> GeneDensity_sample1.bed
  9. Se calcula la densidad media de genes para todas las integraciones en el conjunto de datos siguiendo este orden:
    awk '(suma + = $ 7) FIN (Promedio de impresión "=", suma / NR)' GeneDensity_sample1.bed

10. Estadísticamente Comparar Integración del sitio Distribuciones entre las muestras utilizando la prueba exacta de Fisher y de dos colas de Rangos de Wilcoxon prueba de suma de R de dos colas

Nota: la prueba exacta de Fisher para la comparación de uso de la proporción de los sitios de integración dentro de los genes RefSeq o dentro de una ventana de islas CpG o DST, pero el uso de la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para comparar la distribución de la densidad de genes que rodea a los sitios de integración. El programa de I está disponible en http://www.r-project.org/.
La prueba exacta de Fisher de dos colas:

  1. El uso de los números calculados como se indica en los pasos 9.4 y 9.7, create matrices para cada comparación en I de ocurrencias observadas (integraciones dentro de una anotación o dentro de una ventana que rodea una anotación) frente al resto de los sitios siguiendo este orden:
    (Annotation_of_interest <- matriz (c (muestraa # en, muestraa # restante, SampleB # en, SampleB # restante), nrow = 2, dimnames = lista (c ( 'Centro', 'resto'), c ( 'muestraa', 'SampleB'))))
  2. Calcular el valor de p para la comparación por la prueba exacta de Fisher con el siguiente comando de dos colas:
    fisher.test (annotation_of_interest, alternativa = 'two.sided') $ Valor PD
    Wilcoxon rango suma de prueba de dos colas:
  3. Crear un archivo .txt delimitado por tabuladores en el que cada columna contiene el nombre de la muestra en la celda superior, seguido a continuación por los valores de densidad de genes para todos los sitios de integración en la biblioteca (obtenido desde el archivo de .bed generada en el paso 9.9). Importar este archivo .txt delimitado por tabuladores en R utilizando el siguiente comando y navigating al directorio de archivo correcto:
    FILENAME <- as.data.frame (read.delim (file.choose (), encabezado = T, check.names = FALSO, llenar = TRUE, sep = ' t'))
  4. Calcular el valor de p para la comparación por parte de dos colas prueba de suma de rangos de Wilcoxon con el siguiente comando:
    wilcox.test (FILENAME $ muestraa, FILENAME $ SampleB, = alternativos 'two.sided', emparejado = F, exacta = T) $ Valor PD
    Nota: Los valores de P se pueden calcular solamente hasta un cierto límite (muy bajo) en R, después de lo cual cero será devuelto por el programa. Para masivamente diferentes muestras que producen una p = 0 en R, estimar el valor P como <2,2 x 10 -308.

11. Examinar los datos brutos de secuenciación para la evidencia de la expansión clonal de células que contienen ADN viral integrado

Nota: Existe una pequeña posibilidad de que más de una integración en la misma nt en el genoma de referencia. Alternativamente, un sencillo enevento integración puede llegar a ser redundante presente en los datos de secuenciación debido a la utilización de PCR durante la preparación de la biblioteca y / o por la duplicación de células antes de la preparación de ADN. Recientes análisis de ADN genómico procedentes de pacientes infectados por el VIH han distinguido estas posibilidades mediante la identificación de puntos de puntos sonicación de corte / fijación enlazador únicos (que sólo puede surgir antes de la PCR) dentro de las secuencias de ADN que contienen sitios de integración idénticos 52-54. En la actualidad existe un debate acerca de si provirus albergado dentro de las células clonal ampliado contribuyen al reservorio viral latente, y por lo tanto es de especial interés para caracterizar su nivel de expansión en el estudio de los sitios de integración en pacientes humanos.

  1. Similar al procedimiento indicado en el paso 8.1, generar archivos .bed anuncio de un intervalo de bases que se extienden, en este caso, 25 nt aguas abajo de cada sitio de integración único (bases aguas arriba son innecesarias aquí). Generar un archivo FASTA de estos archivos .bed (como se indica enPaso 8.1) mediante el uso de la función de fastaFromBed BEDTools y después de este comando:
    -fi / directorio fastaFromBed / a / referencia / genoma / -name -s -ropa 25_base_pair_file.bed -fo output_file.fasta
    Nota: Para mejorar la especificidad de cada búsqueda se recomienda para extraer al menos 25 nt aguas abajo de cada sitio de integración para los análisis de la expansión clonal.
  2. Preferiblemente utilizando un script personalizado, buscar el archivo de datos de secuencias FASTA prima para todas las cadenas que contengan una coincidencia exacta con el 25 nt río abajo de cada sitio de integración único, y depositar estas secuencias en un archivo nuevo. Recorte LTR y secuencias de unión de las cuerdas primas. Combinar secuencia de PE lee mediante la conversión de las lecturas en el complemento inverso, el recorte de las secuencias LTR y enlazador, y luego asignar series de READ2 a su par READ1 si las cadenas comparten al menos 20 nt superposición.
  3. Analiza los puntos de fijación enlazador de cada bloque sitio de integración. Clasifica cada integración como "clonal ampliado y# 34; Si los puntos de fijación enlazador son ≥3 pb aparte.
    Nota: Un protocolo para el análisis de la expansión clonal sin fusionar secuencia de lecturas ha sido descrita 52.
    Nota: La fragmentación del genoma en la misma ubicación exacta mediante ultrasonidos conduce a una subestimación de la magnitud de la expansión clonal, y los métodos para corregir el sesgo experimentales resultantes han sido descritos 63,64.

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Resultados

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La Tabla 4 muestra los resultados de un experimento representativo para ilustrar la sensibilidad de NGS para la recuperación de los sitios de integración a partir de un cultivo de células infectadas. ADN celular no infectadas se utilizó para diluir en serie de ADN genómico a partir de una infección en la que cada célula en promedio contenía una integración 40. Las diluciones se preparan en pasos de cinco a una dilución máxima de 1: 15.625. El ADN genómico de l...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un protocolo para el análisis de los sitios de integración retroviral, de la etapa inicial de infección por el virus a través de mapeo de los patrones de distribución genómicas, se describe. Este protocolo es aplicable a cualquier retrovirus y cualquier tipo de célula infectable. Además, la tubería de ensayo es muy sensible, con el potencial para recuperar un número satisfactorio de los sitios de integración únicas de diluciones seriadas de ADN genómico equivalente a la de una infección iniciado con una MOI de 6,4 x 10 ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estamos muy agradecidos a nuestros colegas Stephen Hughes y Henry Levin para el consejo de que era fundamental para establecer el protocolo de NGS para la secuenciación del sitio de integración retroviral en el laboratorio Engelman. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos otorga AI039394 y AI052014 (a ANE) y AI060354 (Centro de la Universidad de Harvard para la Investigación del SIDA).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEMGibco11965-084Medio de cultivo celular estándar, compatible con células HEK293T
Suero fetal bovinoThermo ScientificSH 30088.03Es posible que sea necesario realizar una evaluación previa de diferentes lotes de suero para una producción viral óptima
Penicilina/estreptomicinaCorning30-002-ClAntibióticos que se agregarán a DMEM
Solución salina tamponada con fosfatoMediatech21-040-CVSe utiliza para lavar células
Tripsina EDTACorning25-053-CISe utiliza para separar células adherentes de placas de cultivo de tejidos
PolyJetSignaGen LaboratoriesSL100688reactivo de transfección de ADN
0.45 µ m FiltrosThermo Scientific09-740-35BSe utiliza para filtrar medios de cultivo celular que contienen partículas de virus
Turbo DNaseAmbionAM2239Se utiliza para degradar el ADN plasmídico arrastrado de las existencias de virus
VIH-1 p24 Ensayo de captura de antígenoABL Inc.5447Se utiliza para cuantificar el rendimiento de la producción de virus
DNeasy Blood & Kit de tejidoQiagen69506Se utiliza para purificar el ADN genómico de las células
SonicatorCovarisS2Con este modelo de sonicador realice dos rondas de ciclo de trabajo, 5%; intensidad, 3; ciclos por ráfaga, 200; tiempo, 80 seg
Agua sin nucleasasGeneMateG-3250-125Se recomienda el uso de agua disponible comercialmente para reducir la posibilidad de contaminación cruzada de la muestra
QIAQuick PCR Purificación KitQiagen28106Se utiliza para purificar el ADN durante la construcción de la biblioteca
Kit de reparación de extremos de ADN End-ItEpicentreER81050Se utiliza para reparar los extremos de ADN de muestras de ADN sonicadas
Fragmento de Klenow (3'-5' exo–)New England Biolabs (NEB)M0212SSe utiliza con dATP para fragmentos de ADN reparados de la cola A
dATPThermo ScientificR0141Trifosfato de desoxiadenosina
MseINEBR0525LEndonucleasa de restricción para la escisión del ADN genómico
BglIINEBR0144LEndonucleasa de restricción para suprimir la amplificación de la secuencia ascendente del VIH-1 U5
T4 ADN ligasaNEBM0202L/6218Enzima para la unión covalente de extremos de ADN
compatibles Oligonucleótidosde ADN Tecnologías de ADN integradaspersonalizadasHaga que la empresa purifique los oligos. La purificación por HPLC es suficiente para los ADN< 30 nucleótidos; PAGE purifica ADNs más largos 
Advantage 2 Mezcla de polimerasaClontech639202Mezcla comercial que contiene ADN polimerasa para PCR
dNTPs (soluciones de 100 mM)Thermo ScientificR0181Diluir los cuatro productos químicos en hielo con agua estéril para alcanzar las concentraciones intermedias de 2,5 mM cada dNTP
NanoDropEspectrofotómetro Thermo ScientificNanoDrop 2000para la determinación de la concentración
de ADNFluorímetro Qubit LifeTechnologiesFluorímetro Qubit® 3.0utilizado para confirmar la concentración de ADN de la biblioteca del sitio de integración
2200 TapeStation SystemAgilentG2964AAEnsayo basado en cinta para confirmar la distribución del tamaño del ADN de la biblioteca del sitio de integración
MiSeqIlluminaSY-410-1003utilizado para NGS

Referencias

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