De alto rendimiento CRISPR vector de la construcción y caracterización de las modificaciones del ADN mediante la generación de raíces peludas tomate

Summary

Usando el montaje de ADN, múltiples vectores de CRISPR pueden ser construidos en paralelo en una única reacción de clonación, por lo que la construcción de un gran número de vectores de CRISPR una tarea simple. Tomate raíces peludas son un excelente sistema modelo para validar vectores de CRISPR y generar materiales mutantes.

Abstract

Las mutaciones específicas del ADN generadas por vectores con tecnología de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR)/Cas9 han demostrado ser útiles para los estudios de genómica funcional. Si bien la mayoría de las estrategias de clonación son fáciles de realizar, generalmente utilizan varios pasos y pueden requerir varios días para generar las construcciones finales. El método presentado aquí se basa en el ensamblaje de ADN y puede producir vectores CRISPR completamente funcionales en una sola reacción de clonación. La construcción de vectores también se puede agrupar, lo que aumenta aún más la eficiencia y la utilidad del proceso. Se utiliza una modificación del método para crear vectores CRISPR con múltiples dianas genéticas. A continuación, los vectores CRISPR se transforman en raíces peludas de tomate para generar materiales transgénicos con modificaciones específicas del ADN. Las raíces peludas son un sistema útil para probar la funcionalidad de los vectores, ya que son técnicamente sencillas de generar y susceptibles de producción a gran escala. Los métodos presentados aquí tendrán una amplia aplicación, ya que se pueden utilizar para generar una variedad de vectores CRISPR y se pueden utilizar en una amplia gama de especies de plantas.

Introduction

La capacidad de generar modificaciones del ADN dirigidos con CRISPR / Cas9 tiene un gran potencial para los estudios de genómica funcional. Hay dos componentes del sistema de CRISPR / Cas9; la nucleasa Cas9, derivado de Staphylococcus pyogenes y una molécula de aproximadamente 100 nt ARN guía (gRNA) que dirige Cas9 al sitio de ADN específica (s) ^1. Reconocimiento de la diana es conferida por la primera ~ 20 nt de la gRNA, lo que permite la producción de alto rendimiento de vectores de abordaje ^2,3. La mayoría de los organismos que pueden modificarse por ingeniería genética, ya han estado con la tecnología / Cas9 CRISPR ^4,5. <....

Protocol

1. Guía de ARN Diseño y construcción del vector

1. Identificar secuencias diana para los genes de interés. Hay una variedad de programas de investigación de destino de CRISPR en línea adecuados para esta etapa ^13,14.
   NOTA: Aquí se utiliza la GN ₂₀ GG motivo diana, pero otros diseños pueden ser adecuadas dependiendo de la aplicación o sistema vector utilizado.
2. Diseño 60-mer oligos gRNA para incluir la parte GN ₁₉ de los motivos diana flanqueado por 5 'y 3' secuencias de 20-nt que se requieren para el montaje de ADN. La final motivo del 60-mer es: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT _GN-19 -GTTTTAGAGCT....

Results

CRISPR la construcción del vector con el conjunto de ADN normalmente genera decenas a cientos de clones independientes. La detección por PCR de colonias identifica fácilmente clones correctos y se puede distinguir entre los plásmidos con y sin inserciones (Figura 2A), útiles para la solución de problemas. Por lo general, todos los clones contienen un inserto y un usuario puede optar por omitir los pasos de detección de colonias por completo. Digestos de diagnóstico

Discussion

Dado que el ensamblaje de ADN se utiliza para recombinar cualquier secuencia de ADN superpuesta, este método de clonación se puede aplicar a cualquier construcción de vector CRISPR. La mayoría de los esquemas de clonación CRISPR utilizan la síntesis génica del ARNg, las enzimas de restricción tipo IIS^17,18 o la PCR de extensión superpuesta¹⁹. Cada una de estas técnicas tiene ventajas y desventajas inherentes, pero generalmente requieren múltiples pasos prácticos de clonación. La principal ventaja de.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEBuilder® (Mezcla de ensamblaje de ADN de alta fidelidad)	New England Biolabs	E5520
p201N:Cas9	Addgene	59175	El plásmido p201H:Cas9 (59176) también es compatible con las superposiciones y enzimas reportadas.
Lanzadera de ARNg pUC	Addgene	47024
SwaI	New England Biolabs	R0604S
SpeI	New England Biolabs	R0133S
Purificación de 5 columnas Zymo clean y concentrador-5	Zymo Research	D4003
NEB Buffer 2.1	New England Biolabs	B7202S
NEB CutSmart (Tampón 4)	New England Biolabs	B7204S
Tampón NEB 3.1	New England Biolabs	B7203S
EconoSpin Mini Columna de Espín (preparación de plásmidos)	Epoch Life Sciences	1910-050/250
EcoRV-HF®	New England Biolabs	R3195S
StyI-HF®	New England Biolabs	R3500S
MS Sales + Gamborg Vitamins	Laboratorios de fitotecnología	M404
Phytagel™ (goma gellan)	Sigma Aldrich	P8169
GA-7 Cajas	Sigma Aldrich	V8505
Micropore™ cinta quirúrgica	3M	1535-0
Timentin® (Ticarcilina/Ácido Clavulánico)	Varios	0029-6571-26
Imprimaciones 5' → 3'SwaI_MtU6F
	GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG
MtU6R	AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG
AndamioF	GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT
SpeI_Scaffold R	GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGGTG
StUbi3P218R	ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT
ISceIR	GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG	No se puede utilizar para la secuenciación de Sanger ya que hay un segundo sitio de unión en el plásmido
UNS1_Scaffold R	GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG
UNS1_MtU6 F	CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATATGATCAATGAGG
p201R
secuencias en negrita denotan superposiciones de 20 nt con p201N:Cas9 linealizadas.