De alto rendimiento CRISPR vector de la construcción y caracterización de las modificaciones del ADN mediante la generación de raíces peludas tomate

Summary

Usando el montaje de ADN, múltiples vectores de CRISPR pueden ser construidos en paralelo en una única reacción de clonación, por lo que la construcción de un gran número de vectores de CRISPR una tarea simple. Tomate raíces peludas son un excelente sistema modelo para validar vectores de CRISPR y generar materiales mutantes.

Abstract

Las mutaciones específicas del ADN generadas por vectores con tecnología de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR)/Cas9 han demostrado ser útiles para los estudios de genómica funcional. Si bien la mayoría de las estrategias de clonación son fáciles de realizar, generalmente utilizan varios pasos y pueden requerir varios días para generar las construcciones finales. El método presentado aquí se basa en el ensamblaje de ADN y puede producir vectores CRISPR completamente funcionales en una sola reacción de clonación. La construcción de vectores también se puede agrupar, lo que aumenta aún más la eficiencia y la utilidad del proceso. Se utiliza una modificación del método para crear vectores CRISPR con múltiples dianas genéticas. A continuación, los vectores CRISPR se transforman en raíces peludas de tomate para generar materiales transgénicos con modificaciones específicas del ADN. Las raíces peludas son un sistema útil para probar la funcionalidad de los vectores, ya que son técnicamente sencillas de generar y susceptibles de producción a gran escala. Los métodos presentados aquí tendrán una amplia aplicación, ya que se pueden utilizar para generar una variedad de vectores CRISPR y se pueden utilizar en una amplia gama de especies de plantas.

Introduction

La capacidad de generar modificaciones del ADN dirigidos con CRISPR / Cas9 tiene un gran potencial para los estudios de genómica funcional. Hay dos componentes del sistema de CRISPR / Cas9; la nucleasa Cas9, derivado de Staphylococcus pyogenes y una molécula de aproximadamente 100 nt ARN guía (gRNA) que dirige Cas9 al sitio de ADN específica (s) ^1. Reconocimiento de la diana es conferida por la primera ~ 20 nt de la gRNA, lo que permite la producción de alto rendimiento de vectores de abordaje ^2,3. La mayoría de los organismos que pueden modificarse por ingeniería genética, ya han estado con la tecnología / Cas9 CRISPR ^4,5.

En las plantas, los promotores constitutivos, tales como el promotor CaMV 35S, se utilizan comúnmente para impulsar la expresión de la nucleasa Cas9 ^6. Los gRNAs se expresan utilizando la polimerasa III U6 o U3 promotores de ARN que limita la primera base de la gRNA ya sea a una G, para U6, o A para U3, para la transcripción eficiente. Sin embargo baile de la ARN polimerasa IIoters, que están libres de estas restricciones, también se han utilizado ^7,8.

Diferentes gRNAs inducen mutaciones de ADN con diferentes eficiencias, y por lo que puede ser importante para validar primera vectores CRISPR antes de invertir en las transformaciones de la planta entera o la creación de amplias pantallas fenotípicas. La expresión transitoria de CRISPR construye en plantas, mediante el uso de agroinfiltration por ejemplo, generalmente resulta en una menor frecuencia de modificación del ADN en comparación con las plantas estables ^6, haciendo que la detección de mutaciones difíciles y ensayos fenotípicos poco prácticos con tales enfoques. Los llamados raíces peludas son un sistema conveniente, alternativa ya que un gran número de materiales independientes, transformadas de forma estable se puede generar dentro de semanas, en lugar de meses para las plantas estables. Vectores de CRISPR son muy eficaces en la inducción de mutaciones en el ADN en las raíces peludas ^9,10.

métodos de ensamblaje de ADN ligate eficiente fragmentos de ADN que contienen overlapping termina ^11. Una gran ventaja de algunos métodos de montaje de ADN es la capacidad de incorporar ssDNA (es decir, oligos) en los productos ensamblados. Desde gRNAs sólo ~ 20-nt de largo y nuevos objetivos se pueden hacer con oligos sintetizados, estos métodos de montaje de ADN son muy adecuados para la clonación CRISPR. Los protocolos descritos aquí se basan en la serie P201 de los vectores de CRISPR que ha sido utilizado con éxito en la soja ^{10, 12} y ahora álamo tomate. El procedimiento de clonación presentado ofrece varias ventajas sobre el método de clonación actual ^10. Es decir, los vectores totalmente funcionales pueden ser generados en una única reacción de la clonación en un solo día. La construcción del vector también puede ponerse en común para generar múltiples vectores de CRISPR en paralelo, reduciendo aún más práctica en tiempo y costos de materiales. También se presenta un protocolo para la generación de tomate raíces peludas como un método eficiente para producir materiales transgénicos con deleciones de genes específicos. raíces peludas se utilizan para válidocomieron los vectores de CRISPR y proporcionar material para experimentos posteriores.

Protocol

1. Guía de ARN Diseño y construcción del vector

1. Identificar secuencias diana para los genes de interés. Hay una variedad de programas de investigación de destino de CRISPR en línea adecuados para esta etapa ^13,14.
   NOTA: Aquí se utiliza la GN ₂₀ GG motivo diana, pero otros diseños pueden ser adecuadas dependiendo de la aplicación o sistema vector utilizado.
2. Diseño 60-mer oligos gRNA para incluir la parte GN ₁₉ de los motivos diana flanqueado por 5 'y 3' secuencias de 20-nt que se requieren para el montaje de ADN. La final motivo del 60-mer es: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT _GN-19 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 '.
   NOTA: Estándar, cebadores desaladas funciona bien.
3. Preparar los cuatro ADNs de montaje (Figura 1). Ver el archivo de secuencias de ADN complementario.
   1. Digerir 1-5 g de p201N: Cas9 ¹⁰ plásmido con la enzima de restricción Spe I en 1x Tampón de 4 a 37 ° C durante 2 hr. Columna-purificar el digerir unae acuerdo con las instrucciones del fabricante. Resuspender en ~ 15 l de 10 mM Tris-HCl, y cuantificar mediante espectrofotometría UV.
   2. Realizar una segunda digerir con la enzima de restricción Swa I en 1 x tampón de 3,1 a 25 ° C durante 2 hr. Compruebe 100-200 ng en un gel de agarosa al 0,8% para confirmar la digestión completa.
      NOTA: Un plásmido digerido correctamente tendrá una sola banda a 14.313 pares de bases. no se requiere la inactivación térmica de la enzima y desfosforilación: Nota. plásmido digerido se puede almacenar a -20 ° C.
   3. Amplificar por PCR la Medicago truncatula (Mt) promotor U6 y andamio de ADN pUC gRNA de traslado ¹⁰ plásmido utilizando los cebadores de la SWA I_MtU6F / MtU6R y ScaffoldF / Spe I_ScaffoldR, respectivamente. Utilice una polimerasa de alta fidelidad con las condiciones de PCR: 95ºC durante 3 minutos; 31 ciclos (98 ° C durante 20 s, 60 ° C durante 15 seg, 72 ° C durante 30 segundos); y 72 ° C durante 5 min.
      1. Visualizar ~ 3 ml de alícuotas de pr PCRoductos en un gel de agarosa al 1% para confirmar la amplificación. El amplicón MtU6 es 377 pb y el amplicón andamio es de 106 pb. Columna-purificar los productos de PCR restantes de acuerdo con las instrucciones del fabricante, cuantificar mediante espectrofotometría UV y se almacena a -20 ° C.
   4. Volver a suspender todo el tubo de oligos gRNA a 100 micras en el agua de calidad de laboratorio. Añadir 1 l de oligo 100 M a 500 l de 1x Buffer 2.1. Mezclar bien. Si la agrupación de varios oligos, añadir 1 l de cada oligo 100 M al tubo de 2.1 1x Buffer. oligos diluidas pueden conservarse a -20 ° C.
4. Programar un termociclador para mantener a 50 ° C, utilizando una tapa térmica. Combinar 100 ng (0,011 pmol) de vector linealizado, 50 ng (0,2 pmol) de promotor MtU6, 12 ng (0,2 pmol) de andamio, 1 l (0,2 pmol) de oligo diluido gRNA (s), y agua hasta un volumen de 5 l. Añadir 5 l de 2x de alta fidelidad conjunto de ADN maestro de la mezcla, mezclar bien y centrifugar. Incubar la reacción durante 60 minutos en el50 ° C termociclador. A continuación, coloque la reacción en hielo.
   Nota: Los volúmenes de reacción se puede aumentar para dar cabida a los bajos rendimientos de ADN.
5. Transformar 2 l de la reacción en E. competente coli células usando técnicas estándar y placa en LB suplementado con 50 mg ^L-1 de kanamicina (Kan _50). Grow-células cultivadas en placas a 37 ° C durante la noche. Guarde la reacción de ensamblaje de ADN restante a -20 ° C.
6. pantalla de colonias por PCR usando el StUbi3P218R cebadores y ISceIR. Diluir una alícuota de la reacción de ensamblaje de ADN restante con agua 1: 5. Utilice 1 l como un control positivo para la pantalla de colonia y 1 ng de p201N circular: plásmido Cas9 como un control sin inserto.
   1. Amplificar por PCR con las condiciones; 95 ° C durante 3 min; 31 ciclos (95 ° C durante 30 segundos, 58 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 segundos); y a 72 ° C durante 5 min. Visualizar productos de PCR en un gel de agarosa al 1%. Asegurar que las inserciones correctas tienen una banda a 725 pb y vectores ingenioinserciones Hout (por ejemplo, vector sin cortar) tendrán una banda de 310 pb.
7. Crecer colonias positivas en LB Kan ₅₀ cultivos líquidos durante la noche a 37 ° C y purificar los plásmidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Sanger secuencia de plásmidos con el cebador StUbi3P218R y alinear cromatogramas al promotor MtU6, Target, y secuencias de andamio para asegurar no se introdujeron errores durante la clonación.
8. Realizar un diagnóstico de digerir por digestión ~ 1 g de plásmido con Eco RV y Sty I. Visualizar en un gel de agarosa al 0,8%. Fragmentos (en pb) son: 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, y 174.
9. Utilice el montaje de ADN para construir vectores con múltiples gRNAs.
   1. Para construir un vector con dos casetes gRNA, amplificar por PCR la primera posición gRNA con los cebadores Swa I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR y la segunda posición gRNA con los cebadores UNS1_MtU6F / Spe I_ScaffoldR de 1 ng de cada uno de los respectivoslos plásmidos construidos en los pasos 1.1 - 1.8. Use las condiciones de la PCR en el paso 1.3.3. Visualizar ~ 3 ml de alícuotas de productos de PCR en un gel de agarosa al 1% para confirmar la amplificación. Amplicones son ~ 500 pb.
   2. Combinar y mezclar cantidades aproximadamente iguales de productos de PCR sin purificar en un tubo de 200 l (típicamente 3 - 4 l de cada uno). Para el montaje, añadir 1 l productos de PCR combinados, 50 ng de Swa I y Spe I linealizado p201N: Cas9, agua de calidad de laboratorio de 2,5 ly 2,5 l de 2x de alta fidelidad conjunto de ADN mezcla maestra. Incubar en un ciclador térmico de 50 ° C durante 15 min.
      Nota: Los manuales de montaje de ADN recomienda una incubación de 15 min durante 2 - 3 fragmentos.
   3. Transformar 1 - 2 l en E. competente células de E. coli y placa en LB Kan _50. Crecer células cultivadas en placas a 37 ° C durante la noche. Guarde la reacción restante a -20 ° C.
   4. pantalla de colonias por PCR con cebadores StUbi3P218R y ISceIR con las mismas condiciones que el paso 1.6. c correctalones tendrán un amplicón de 1.200 pb. Crecer colonias positivas en LB Kan ₅₀ cultivos líquidos durante la noche y purificar plásmidos.
   5. Sanger secuencia de plásmidos con el StUbi3P218R cebadores (sobres primer posición gRNA) y p201R (sobres segunda posición gRNA). Alinear cromatogramas a las secuencias de promotor, de destino y de andamio MtU6. Diagnóstico digerir con Eco RV y Sty I dará lugar a los siguientes fragmentos (en pb): 4192, 2476, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174. fragmento en negrita contiene el segundo gRNA.
10. Después de reunirse con todas las expectativas de control de calidad, transformar los plásmidos en Agrobacterium rhizogenes cepa ARqua1 ^15. Añadir 1 l de la preparación de plásmido a 50 l de células electrocompetentes y electroporar en un 1 mm cubeta con los ajustes: 2,4 kV, 25 mF, y 200 Ω. Recuperar las células en ~ 500 l de SOC y agitar a 28 ° C durante 2 horas. Placa en LB Kan y ₅₀ gremar a 28 ° C durante 2 días. Realizar pantalla de colonias usando los mismos cebadores y condiciones de PCR como 1.3.3. Hacer reservas de glicerina a partir de clones positivos.

2. La transformación de raíz vellosa

1. Esterilizar semillas de tomate en cloro de uso doméstico 20% durante 15 min, con mezclado constante. En una campana de flujo laminar, eliminar el cloro y lavar en agua estéril de calidad de laboratorio 3 veces.
2. Placa 30 semillas en una caja GA-7 que contenían medio ½ MS (2.22 g L ^-1 sales MS + vitaminas Gamborg, 10 g L ^-1 de sacarosa, 3 g L ^-1 goma gellan, pH 5,8). Germinar para ~ 2 días en la oscuridad, a continuación, pasar GA-7 cajas de luz. Crecer plántulas para ~ 4 días más en la luz.
3. El día antes de la transformación, consecutivas a cabo A. rhizogenes culturas en sólido LB Kan ₅₀ y crecer a 28 ° C durante la noche.
4. Día de la transformación, en la campana de flujo laminar ensamblar materiales estériles: 12 ml tubos de cultivo, 50 ml tubo cónico, ½ MS líquido (sin gelano gum), acetosiringona 200 mM, papel de filtro, placas de Petri, pinzas y bisturí, pipetas y puntas de pipeta. Añadir 25 l de acetosiringona a 50 ml de ½ MS y se vierte ~ 6 ml en cada tubo de cultivo.
5. Utilice una punta de 200 l se inclinó para raspar A. células rhizogenes de la placa y se resuspende en los 6 ml de ½ MS líquido. Vortex el tubo para resuspender completamente las células. Después de la resuspensión de células de cada vector, medir la densidad óptica (DO) de 1 ml de células a una longitud de onda fija de 600 nM. Asegúrese de OD es de entre 0,2 y 0,4; diluir o añadir más células según sea necesario. Repita este procedimiento para cada construcción.
6. Añadir ~ 2 ml de ½ MS líquido a una placa de Petri con un papel de filtro estéril. cotiledones sobre el consumo de las plantas de semillero y colocar en el papel de filtro humedecido. Una vez que se han recogido todos los cotiledones, cortar las distales ~ 1 cm fuera de los cotiledones, dando como resultado piezas de cotiledones con dos extremos cortados. Añadir explantes a A. rhizogenes soluciones, se mezclan y se incuban durante 20 mincon inversora ocasional.
   Nota: Aproximadamente 12 explantes por construcción se utilizan habitualmente, aunque menos que 80 explantes se han inoculado en 6 ml de A. solución rhizogenes.
7. Durante el A. rhizogenes incubación, añadir papel de filtro a placas de Petri, uno por cada constructo se transformó. También establecer ½ MS medios sólidos, sin antibióticos, en la campana de flujo laminar para secar.
8. Scoop cotiledones de A. rhizogenes solución con pinzas estériles y colocar sobre papel de filtro seco. Cubra con una tapa Petri para asegurar los tejidos no se sequen mientras se procede a la siguiente transformación. cotiledones mancha en el papel de filtro y transferencia, con el lado abaxial hacia arriba, a ½ medio MS. Envolver las placas con cinta quirúrgica y co-cultivan en la oscuridad a temperatura ambiente durante 2 días.
9. Después de co-cultivo, los cotiledones de transferencia, con el lado abaxial hacia arriba, a ½ medio MS suplementado con 300 mg L ^-1 ácido ticarcilina / clavulánico (Tim _300, para evitar el crecimiento de residUAL A. rhizogenes) y Kan ₅₀ (para la selección de plantas) y se envuelven con cinta quirúrgica. Mantener culturas bajo luces fluorescentes a temperatura ambiente con un fotoperíodo de 16 horas.
10. Después de ~ 1,5 - 2 semanas raíces por lo menos 2 cm de longitud se escindieron de los cotiledones utilizando una pinza estéril y un bisturí y se transfieren a ½ MS Kan ₅₀ Tim ₃₀₀ medios de comunicación. Transferir 10 a 15 raíces de una sola placa. Marcar la posición de las puntas de las raíces con un marcador, envuelva con cinta quirúrgica, y mantener en la sala de cultivo.
11. Después de una semana, raíces transformadas se ven cada vez mayor en el medio selectivo. Cosechar una submuestra de raíces transformadas para la extracción de ADN utilizando el método de extracción de ADN preferida. Nota: Las placas con los cotiledones se pueden mantener durante 2 - 3 cosechas semanales, después de lo cual las raíces crecen en un lío enredado y son difíciles de aislar. tejidos de la raíz no cosechadas se pueden mantener indefinidamente. Una variedad de ensayos se pueden realizar en la muestra de ADN aislados para determinar la frecuencia de mutación del ADN y tipo. Los resultados de algunos de esos ensayos se describen a continuación.

Results

CRISPR la construcción del vector con el conjunto de ADN normalmente genera decenas a cientos de clones independientes. La detección por PCR de colonias identifica fácilmente clones correctos y se puede distinguir entre los plásmidos con y sin inserciones (Figura 2A), útiles para la solución de problemas. Por lo general, todos los clones contienen un inserto y un usuario puede optar por omitir los pasos de detección de colonias por completo. Digestos de diagnóstico

Discussion

Dado que el ensamblaje de ADN se utiliza para recombinar cualquier secuencia de ADN superpuesta, este método de clonación se puede aplicar a cualquier construcción de vector CRISPR. La mayoría de los esquemas de clonación CRISPR utilizan la síntesis génica del ARNg, las enzimas de restricción tipo IIS^17,18 o la PCR de extensión superpuesta¹⁹. Cada una de estas técnicas tiene ventajas y desventajas inherentes, pero generalmente requieren múltiples pasos prácticos de clonación. La principal ventaja de...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEBuilder® (Mezcla de ensamblaje de ADN de alta fidelidad)	New England Biolabs	E5520
p201N:Cas9	Addgene	59175	El plásmido p201H:Cas9 (59176) también es compatible con las superposiciones y enzimas reportadas.
Lanzadera de ARNg pUC	Addgene	47024
SwaI	New England Biolabs	R0604S
SpeI	New England Biolabs	R0133S
Purificación de 5 columnas Zymo clean y concentrador-5	Zymo Research	D4003
NEB Buffer 2.1	New England Biolabs	B7202S
NEB CutSmart (Tampón 4)	New England Biolabs	B7204S
Tampón NEB 3.1	New England Biolabs	B7203S
EconoSpin Mini Columna de Espín (preparación de plásmidos)	Epoch Life Sciences	1910-050/250
EcoRV-HF®	New England Biolabs	R3195S
StyI-HF®	New England Biolabs	R3500S
MS Sales + Gamborg Vitamins	Laboratorios de fitotecnología	M404
Phytagel™ (goma gellan)	Sigma Aldrich	P8169
GA-7 Cajas	Sigma Aldrich	V8505
Micropore™ cinta quirúrgica	3M	1535-0
Timentin® (Ticarcilina/Ácido Clavulánico)	Varios	0029-6571-26
Imprimaciones 5' → 3'SwaI_MtU6F
	GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG
MtU6R	AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG
AndamioF	GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT
SpeI_Scaffold R	GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGGTG
StUbi3P218R	ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT
ISceIR	GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG	No se puede utilizar para la secuenciación de Sanger ya que hay un segundo sitio de unión en el plásmido
UNS1_Scaffold R	GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG
UNS1_MtU6 F	CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATATGATCAATGAGG
p201R
secuencias en negrita denotan superposiciones de 20 nt con p201N:Cas9 linealizadas.