Análisis de Complementación funcional (FCA): Un ejercicio de laboratorio diseñado e implementado para Complementar la enseñanza de la bioquímica Pathways

Summary

La validación de las actividades enzimáticas implicadas en las vías bioquímicas se puede elucidar el uso de análisis de complementación funcional (FCA). Se describe en este manuscrito es el ensayo FCA que demuestra la actividad enzimática de las enzimas implicadas en el metabolismo de aminoácidos, estrictas respuesta bacteriana y la biosíntesis de peptidoglicano bacteriano.

Abstract

Ensayo de complementación funcional (FCA) es un ensayo in vivo que se utiliza ampliamente para dilucidar la función / papel de los genes / enzimas. Esta técnica es muy común en la bioquímica, la genética y muchas otras disciplinas. Una visión global de la técnica para complementar la enseñanza de las vías bioquímicas que pertenecen a los aminoácidos, peptidoglicano y la respuesta estrictas bacteriana se informa en este manuscrito. Dos ADNc de la planta modelo thaliana organismo Arabidopsis que están involucrados en el metabolismo de la lisina (L, aminotransferasa-L diaminopimelato (DAPL) y tirosina aminotransferasa (tyrB) que participan en el metabolismo de la tirosina y fenilalanina están resaltados. Además, el peptidoglicano bacteriano vía anabólica se pone de relieve por medio del análisis del gen de UDP-N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-glutamato meso -2,6-ligasa diaminopimelato (mûre) de la bacteria Verrucomicrobium spinosum involucrado en la cruz-linking de peptidoglicano. La respuesta estrictas bacteriana También se informa a través del análisis de la rsh (r ela / s Pot h omolog) gen bifuncional responsables de un fenotipo hiper-mucoide en la bacteria Novosphingobium sp., Se presentan cuatro ejemplos de FCA. El vídeo se centrará en tres de ellos, a saber, la lisina, peptidoglicano y la respuesta estrictas.

Introduction

complementación funcional en el contexto de elucidar la función (s) / papel (s) de un gen se define como la capacidad de un homólogo en particular o genes ortólogos para restaurar un mutante particular con un fenotipo observable al estado de tipo salvaje cuando la homóloga o genes ortólogos se introduce en cis o trans en el fondo mutante. Esta técnica se ha utilizado ampliamente para aislar e identificar la función (s) / papel (s) de muchos genes. Un ejemplo particular es el aislamiento y la identificación de orotidina-5-fosfato a partir de Candida albicans usando el mutante ura3 de S. cerevisiae y el mutante pyrF....

Protocol

NOTA: Los autores están dispuestos a proporcionar cepas bacterianas y plásmidos recombinantes para facilitar la incorporación del análisis de complementación funcional con fines didácticos para las personas que están interesadas. Los plásmidos que se utilizaron para facilitar los experimentos de complementación funcional se enumeran en la Tabla 1.

1. Construcción de los plásmidos de complementación funcional

1. Clonación de diaminopimelato aminotransferasa (DAPL) para complementación funcional.
   1. Amplificar el marco de lectura abierto DAPL (ORF) de la V. spinosum y ADNc de A. thaliana y

Results

Las cepas bacterianas que se emplean en los diversos análisis de complementación funcional se enumeran en la Tabla 2.

análisis de complementación funcional: L, L-aminotransferasa diaminopimelate (DAPL)

El E. coli mutante doble AOH1 (Δ dapD :: Kan2, dapE6) alberga una mutación en el gen dapE y una deleción completa del gen .......

Discussion

Muchos de los cursos que son parte integral del plan de estudios de Biotecnología y Biociencia Molecular en el Instituto de Tecnología de Rochester tienen un componente de laboratorio, además de la parte de lectura del curso. El plan de estudios para el año académico 2014-2015 contiene un total de 48 cursos, 29 de los cuales contienen un componente de laboratorio que representan aproximadamente el 60%. Uno de estos cursos es Fundamentos de Bioquímica Vegetal y Patología (FPBP), un curso mixto clase / laboratorio y Biose.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli mutantes	de laboratorio Hudson/Savka o CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
Electroporador	Biorad-USA	1652100
Cubetas de electroporación	Biorad-USA	1652082
Incubadora de temperatura controlada	Genérico
Microcentrífuga	Genérica
Luria Agar	Thermofisher Scientific 22700025
Luria Caldo	Thermofisher Scientific	12795084
M9 Medio	Sigma-Aldrich	63011
Patata Dextrosa Medio	Fisher Scientfic	DF0013-15-8
Kanamicina	Sigma-Aldrich	K1377
Diaminomimelato	Sigma-Aldrich	92591
Timina	Sigma-Aldrich	T0376
Cloranfenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Tirosina	Sigma-Aldrich	T3754
Fenilalanina	Sigma-Aldrich	P2126
Aspartato	Sigma-Aldrich	A9256
Valina	Sigma-Aldrich	V0500
Leucina	Sigma-Aldrich	L8000
Isoleucina	Sigma-Aldrich	I2752
Uracilo	Sigma-Aldrich	U0750
Gylcerol	Sigma-Aldrich	G5516
Arabinosa	Sigma-Aldrich	A3256
Tetraciclina	Sigma-Aldrich	87128
ADN polimerasa Taq	Thermofisher Scientific	10342-020
Platino pfx ADN polimerasa	Thermofisher Scientific	11708-013
T4 ADN ligasa	Thermofisher Scientific	15224-041
E. coli Dh5-alfa	Thermofisher Scientific	18258012
E. coli Top10	Thermofisher Scientific	C4040-03
pET100D/topo vector	Thermofisher Scientific	K100-01
pCR2.1 Vector	Thermofisher Scientific	K2030-01