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Artículo de método

Análisis de Complementación funcional (FCA): Un ejercicio de laboratorio diseñado e implementado para Complementar la enseñanza de la bioquímica Pathways

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DOI:

10.3791/53850

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24 de junio de 2016

 ,  , 
1Thomas H. Gosnell School of Life Sciences, Rochester Institute of Technology

En este artículo

Resumen

La validación de las actividades enzimáticas implicadas en las vías bioquímicas se puede elucidar el uso de análisis de complementación funcional (FCA). Se describe en este manuscrito es el ensayo FCA que demuestra la actividad enzimática de las enzimas implicadas en el metabolismo de aminoácidos, estrictas respuesta bacteriana y la biosíntesis de peptidoglicano bacteriano.

Resumen

Ensayo de complementación funcional (FCA) es un ensayo in vivo que se utiliza ampliamente para dilucidar la función / papel de los genes / enzimas. Esta técnica es muy común en la bioquímica, la genética y muchas otras disciplinas. Una visión global de la técnica para complementar la enseñanza de las vías bioquímicas que pertenecen a los aminoácidos, peptidoglicano y la respuesta estrictas bacteriana se informa en este manuscrito. Dos ADNc de la planta modelo thaliana organismo Arabidopsis que están involucrados en el metabolismo de la lisina (L, aminotransferasa-L diaminopimelato (DAPL) y tirosina aminotransferasa (tyrB) que participan en el metabolismo de la tirosina y fenilalanina están resaltados. Además, el peptidoglicano bacteriano vía anabólica se pone de relieve por medio del análisis del gen de UDP-N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-glutamato meso -2,6-ligasa diaminopimelato (mûre) de la bacteria Verrucomicrobium spinosum involucrado en la cruz-linking de peptidoglicano. La respuesta estrictas bacteriana También se informa a través del análisis de la rsh (r ela / s Pot h omolog) gen bifuncional responsables de un fenotipo hiper-mucoide en la bacteria Novosphingobium sp., Se presentan cuatro ejemplos de FCA. El vídeo se centrará en tres de ellos, a saber, la lisina, peptidoglicano y la respuesta estrictas.

Introducción

complementación funcional en el contexto de elucidar la función (s) / papel (s) de un gen se define como la capacidad de un homólogo en particular o genes ortólogos para restaurar un mutante particular con un fenotipo observable al estado de tipo salvaje cuando la homóloga o genes ortólogos se introduce en cis o trans en el fondo mutante. Esta técnica se ha utilizado ampliamente para aislar e identificar la función (s) / papel (s) de muchos genes. Un ejemplo particular es el aislamiento y la identificación de orotidina-5-fosfato a partir de Candida albicans usando el mutante ura3 de S. cerevisiae y el mutante pyrF de E. coli. 1 Los autores han utilizado esta técnica para elucidar la función de los genes que están involucrados en el metabolismo de aminoácidos, peptidoglicano y la respuesta estrictas en sus programas de investigación y han incorporado esta técnica en sus programas de enseñanza en el Ba biotecnología y Biociencia Molecular (BMB) programa en el Instituto de Tecnología de Rochester (RIT).

Los autores enseñan Fundamentos de Bioquímica Vegetal / Patología (FPBP) (Hudson) y para Bios: Principios y Prácticas (BPP) (Hudson / Savka), dos cursos basados ​​en la división superior de laboratorio de elección en el Programa de BMB en el RIT. Dado que algunos de los temas que se tratan en los cursos están afiliados a sus intereses de investigación, los autores han incorporado muchas de las técnicas y herramientas experimentales que se utilizan en sus respectivos programas de investigación en estos dos cursos basados ​​en laboratorio. Un ejemplo es la complementación funcional como un ejercicio de laboratorio para reforzar los materiales de clase pertenecientes a metabolismo de aminoácidos de las plantas, peptidoglicano y el riguroso metabolismo respuesta de bacterias.

Tres de las vías de aminoácidos de las plantas que se tratan en el curso FPBB son la de lisina (Lys), tirosina(Tyr) y fenilalanina (Phe). La vía de lys se pone de relieve en el curso debido a la importancia del aminoácido como un aminoácido esencial para todos los animales particularmente seres humanos ya que los animales carecen de la maquinaria genética para sintetizar lys de novo. Además, recientemente se ha descubierto que las plantas emplean una vía para la síntesis de lys que es significativamente diferente de la de bacterias. Este descubrimiento fue facilitada en parte por complementación funcional de la E. diaminopimelato coli (dap) mutantes utilizando un gen que codifica la enzima L, L-diaminopimelato aminotransferasa (DAPL) de la planta modelo Arabidopsis thaliana. 2 Las vías de variantes para la síntesis de lys a través de la diaminopimelato intermedios se muestran en la Figura 1. Además , la síntesis de lys facilita a través de la familia aspartato derivado de aminoácidos que está altamente regulado. 3 Además de su importancia en synt proteínasHESIS, las vías de Tyr y Phe se destacan por su importancia en servir como compuestos precursores para el anabolismo de compuestos fenilpropanoides involucrados la síntesis de compuestos de defensa de plantas tales como:. alcaloides, ligninas, flavonoides, isoflavonoides, ácido hidroxicinámico entre otros 4 El Tyr y las vías de phe también se destacan para mostrar la diferencia entre la central y las vías anabólicas bacterianas. En las bacterias, la tirosina aminotransferasa enzima (tyrB) está implicado en el anabolismo de ambos aminoácidos, mientras que en las plantas, la enzima es principalmente involucrada en el catabolismo de Tyr y Phe y no está implicado en el anabolismo de estos aminoácidos. (Figura 2). 4

Las diferencias entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas con respecto a la estructura de peptidoglicano (PG) se destacan en el curso FPBP. El PG de las bacterias Gram negativas es de interés en relación con la patología de plantas basado en el hecho de que la mayor partepatógenos de las plantas son Gram negativo. Una revisión reciente sobre los 10 fito-patógenos bacterianos reveló que todos son Gram negativas. Las bacterias eran de los géneros:. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya y Pectobacterium 5 Una de las diferencias químicas cuando se compara el vástago de PG de bacterias positivos negativos y Gram es la diferencia entre la reticulación-amino ácidos de ambos tipos. El paso inicial para que diferentes reticulación de PG se produce en la etapa de citoplásmico de PG anabolismo y es facilitado por la enzima UDP-N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-glutamato meso -2,6-ligasa diaminopimelato (mûre) (Figura 3A). Mûre cataliza la adición de un compuesto de diamina en particular en tercera posición del vástago de péptido. 6 En la mayoría de las bacterias Gram negativas, las lys penúltimo precursor, -diaminopimelate meso ( m -DAP) sirve como la reticulación de aminoácidos y lys sirve el mismo papel en la PG de la mayoría de las bacterias Gram positivas (Figura 3B). 7 Esto es debido al hecho de que tanto m -DAP y lys poseen dos amina grupos y son capaces de formar dos enlaces peptídicos de tallo péptido reticulación.

En los Bioseparaciones: Principios y Prácticas de golf (BPP), se discuten las diferencias entre sistemas abiertos y cerrados para el cultivo de bacterias y cómo los niveles de nutrientes va a cambiar significativamente en ambos sistemas debido a los cambios ambientales. Estos eventos están vinculados a los cambios de la normativa solicitados un "cambio hacia abajo" o "Desplazamiento hacia arriba" provocados por el hambre o un suministro adecuado de aminoácidos o de energía. La respuesta de "cambio-abajo" puede ocurrir cuando un cultivo bacteriano se transfiere de un medio rico y complejo a un medio químicamente definido con una única fuente de carbono. Este cambio en el medio ambiente conduce a la rápida CESSAla de la síntesis de tRNA y rRNA. Este cese resultado en la falta de ribosomas, proteínas y la síntesis de ADN a pesar de que la biosíntesis de aminoácidos son upregulated.

Tras la respuesta "cambio-abajo", los ribosomas existentes se utilizan para producir nuevas enzimas para la síntesis de los aminoácidos ya no disponibles en el medio o entorno. Después de un período de tiempo, la síntesis de rRNA y nuevos ribosomas son ensamblados y la población de células bacterianas comienza a crecer, aunque a un ritmo reducido. El curso de los acontecimientos que se denomina la "respuesta rigurosas" o "control estricto" y es un ejemplo de la regulación celular global y se puede considerar como un mecanismo para ajustar la maquinaria biosintética de la célula para compensar la disponibilidad de los sustratos requeridos y las necesidades de energía . 8 la respuesta estrictas por lo tanto permite a las bacterias para responder con rapidez a los flujos de nutrientes en el medio ambiente y contribuye y ENHANCES la capacidad de las bacterias para competir en ambientes que pueden cambiar rápidamente con respecto a nutrientes y o la disponibilidad de sustrato. 8-9

La respuesta estrictas tiene un papel integral en la expresión de genes cuando la disponibilidad de aminoácidos, carbono, nitrógeno, fosfato y ácidos grasos son limitadas. 8,10-14 Esta respuesta estrictas está coordinado por dos nucleótidos, tetrafosfato de guanosina (ppGpp) y guanosina pentafosfato (pppGpp) conoce comúnmente como el conjunto alarmone (p) ppGpp. Por ejemplo, cuando los aminoácidos están limitadas-que puede conducir a un cuello de botella en la síntesis de proteínas-la alarmone, guanosina 3,5- (bis) pirofosfato (ppGpp), derivado de anabolismo de guanosina 3-difosfato 5-trifosfato (pppGpp) acumula en la célula. El cambio de nivel (p) ppGpp está implicado en la expresión de los genes que regulan la respuesta para superar la falta de sustratos en el entorno que están directamente involucrados en el crecimiento celular y development. Dos de los genes que están involucrados en este proceso son los llamados relA y Spot. De RelA es un (p) ppGpp sintetasa ribosoma-asociado que está implicado en la respuesta a la acumulación de tRNA no cargados que es el resultado de la limitación de aminoácidos. funciones de detectar como un bifuncional (p) ppGpp sintetasa y hidrolasa. La actividad de la sintetasa de la mancha está implicado en la respuesta a la falta de privación de carbono y el ácido graso. 8 Los homólogos de RelA / SPOT se han generalizado en plantas y bacterias, y se conocen como Rsh para R ELA / S POT h omologs 8,10. -12,16 un manuscrito reciente mostró que hay una proteína Rsh específica implicada en la síntesis de estos alarmones de la bacteria Novosphingobium sp Rr 2-17. 17

Aquí presentamos cuatro vías bioquímicas atados a los ensayos de complementación funcional. Los ensayos de complementación descritos en este manuscrito ofrece una vía para explmineral de empleo de este ensayo in vivo como medio de identificación y caracterización de enzimas o que se predice que tienen función desconocida / putativo (s) o como herramientas de enseñanza para complementar la enseñanza de las rutas bioquímicas.

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Protocolo

NOTA: Los autores están dispuestos a proporcionar cepas bacterianas y plásmidos recombinantes para facilitar la incorporación del análisis de complementación funcional con fines didácticos para las personas que están interesadas. Los plásmidos que se utilizaron para facilitar los experimentos de complementación funcional se enumeran en la Tabla 1.

1. Construcción de los plásmidos de complementación funcional

  1. Clonación de diaminopimelato aminotransferasa (DAPL) para complementación funcional.
    1. Amplificar el marco de lectura abierto DAPL (ORF) de la V. spinosum y ADNc de A. thaliana y C. reinhardtii por PCR. Utilice 1 ciclo a 94 ° C durante 2 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 30 seg y 72 ° C durante 2 min. Incluir 12 pmoles de cada cebador, mM MgSO 4 1, 0,5 mM de cada uno de los 4 desoxinucleótidos trifosfato, y 0,5 ng de ADN molde y 1 unidad de PfxADN polimerasa.
      NOTA: La descripción completa relativa a la clonación recombinante de tres ortólogos DAPL de la planta A. thaliana (A -dapL), la bacteria Verrucomicrobium espinoso (Vs -dapL) y el alga Chlamydomonas reinhardtii (Cr -dapL) ha sido publicado con anterioridad. 2,18-20
      NOTA: Los cebadores utilizados para la clonación de los ortólogos DAPL son los siguientes:
      Vs DAPL F- 5'-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3 '
      R vs DAPL 5'CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3 '
      En DAPL F- 5'-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3 '
      En DAPL R-5'-GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3 '
      Cr DAPL F-5'-CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3 '
      Cr DAPL R -5'- CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3 '
    2. Clonar los fragmentos de PCR en tque el plásmido pET30a para producir los plásmidos recombinantes, pET30a :: Vs DAPL, pET30a :: En DAPL y pET30a :: Cr DAPL usando los cebadores, enzimas de restricción y la ADN ligasa T4.
      1. Brevemente, se incuban 50 ng de inserto y 20 ng de vector en tampón de ligasa 1X y 1 unidad de ADN ligasa de T4 durante la noche a 17 ° C. Transformar la ligación en E. células coli DH5a y la pantalla de colonias en placas de LB suplementado con 50 g / ml de kanamicina -1 mediante la incubación a 37 ° C durante 24 hr. 18-20
    3. Para crear el plásmido para la complementación funcional, digerir pET30a :: Vs DAPL y pET30a :: En plásmidos DAPL con las enzimas de restricción XbaI y SalI y XbaI y HindIII para el pET30a :: Cr DAPL. Ligar los insertos en los plásmidos pBAD33 utilizando ADN ligasa de T4 para producir los plásmidos pBAD33 :: Vs DAPL; pBAD33 :: En DAPL y pBAD33 :: Cr DAPL.
      1. Incubar 50 ng de inserto y 20 ngde vector en tampón de ligasa 1X y 1 unidad de ADN ligasa de T4 durante la noche a 17 ° C. Transformar la ligación en E. células coli DH5a y la pantalla de colonias en placas de LB suplementado con 34 g / ml de kanamicina -1 mediante la incubación de 37 ° C durante 24 hr. 20
  2. Clonación de la tirosina aminotransferasa (tyrB) de A. thaliana para la complementación funcional.
    NOTA: Los detalles completos sobre la clonación del ADNc de A. thaliana anotado por las etiquetas locus At5g36160 se ha descrito previamente. 4
    1. Amplificar el ADNc por PCR. Utilice 1 ciclo a 94 ° C durante 2 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 30 seg y 72 ° C durante 2 min. Incluir 12 pmoles de cada cebador, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM de cada uno de los cuatro desoxinucleótidos trifosfato, y 0,5 ng de ADN molde y 1 unidad de ADN polimerasa Pfx.
      NOTA: Los cebadores utilizados para la clcañoning de la At5g36160 son los siguientes:
      En tyrB F- 5'-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 '
      AttyrB R- 5'CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 '
    2. Clonar el fragmento en el plásmido pET30a para producir los plásmidos recombinantes pET30a :: At5g36160 por digestión del fragmento de PCR con EcoR1 y Sal1; ligar en el fragmento en pET30a usando ADN ligasa de T4 como se describe a continuación. 4
    3. Para crear el plásmido de complementación funcional, digerir el pET30a :: At5g36160 con las enzimas de restricción XbaI y HindIII, y se liga el inserto en pBAD33 usando los mismos sitios de enzimas de restricción para producir el plásmido recombinante pBAD33 :: At5g3160 utilizando ADN ligasa de T4.
      1. Incubar 50 ng de inserto y 20 ng de vector en tampón de ligasa 1X y 1 unidad de ADN ligasa de T4 durante la noche a 17 ° C. Transformar la ligación en E. células de E. coli DH5a y pantalla de colonias en placas de LB suplementado con 34 g / ml -1 Chloramphenicol mediante la incubación de 37 ° C durante 24 h. 4
  3. Clonación de UDP-N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-glutamato meso -2,6-ligasa diaminopimelato (mûre) a partir de V. espinoso para la complementación funcional.
    NOTA: La clonación del ORF de Mure V. spinosum se ha descrito previamente. 18
    1. Amplificar el marco de lectura abierto por PCR. Utilice 1 ciclo a 94 ° C durante 2 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 30 seg y 72 ° C durante 2 min. Incluir 12 pmoles de cada cebador, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM de cada uno de los cuatro desoxinucleótidos trifosfato, 0,5 ng de ADN molde y 1 unidad de ADN polimerasa Pfx. A continuación, clonar en el plásmido pET100D para producir el plásmido pET100D :: Vs Mure.
      NOTA: Los cebadores utilizados para la clonación de los V Mure son los siguientes:
      Vs CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT Mure F- 5'-3 '
      vsMure R- 5'GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3 '
    2. Para producir el plásmido de complementación funcional, digerir el pET100D :: Vs Mure
      Con las enzimas de restricción XbaI y Sal1 y ligar el inserto en pBAD33 para producir el plásmido recombinante pBAD33 :: Vs mûre utilizando ADN ligasa de T4.
      1. Incubar 50 ng de inserto y 20 ng de vector en tampón ligasa 1x, junto con 1 unidad de ADN ligasa de T4, durante la noche a 17 ° C. Transformar la ligación en E. células y pantalla coli DH5a de colonias en placas de LB suplementadas con cloranfenicol -1 34 mg / ml mediante la incubación de 37 ° C durante 24 horas. 8
  4. Clonación de relA / s Pot (rsh) de Novosphingobium sp para la complementación funcional.
    NOTA:. La clonación de la rsh de Novosphingobium sp se ha descrito previamente 17.
    1. Amplificar el ORF rsh, además de 599 nucleótidos upstresma del sitio de inicio de iniciación y 46 nucleótidos aguas abajo en el sitio de terminación por PCR. Utilice 1 ciclo a 94 ° C durante 2 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 30 seg y 72 ° C durante 2 min. Incluir 12 pmoles de cada cebador, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM de cada uno de los cuatro desoxinucleótidos trifosfato, 0,5 ng de ADN molde y 1 unidad de Taq ADN polimerasa. A continuación, clonar en el plásmido pCR2.1 para producir pCR2.1 :: NSP rsh.
      1. Incubar 1 l de fragmento de PCR amplificado, 1 l de vector pCR2.1, 1 l de solución de sal y 1 l de agua. Incubar a 25 ° C durante 5 min y 2 l de ligación en E. células de E. coli, y la pantalla de colonias en placas de LB suplementado con 50 g / ml de kanamicina -1 incubando 37 ° C durante 24 horas.
        NOTA: Los cebadores utilizados para la clonación del rsh son los siguientes:
        rsh F- 5'GTTGAAAAACGCCGAATAGC -3 '
        rsh R- 5'GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3 '
      2. Para complementación funcional, digerir el plásmido pCR2.1 :: NSP rsh con EcoR1 y ligar el inserto en la amplia gama de huéspedes pRK290 para producir el plásmido recombinante pRK290 :: NSP RSH utilizando ADN ligasa de T4.
        1. Incubar 50 ng de inserto y 20 ng de vector en tampón de ligasa 1X y 1 unidad de ADN ligasa de T4 durante la noche a 17 ° C. Transformar la ligación en E. células coli DH5a y la pantalla de colonias en placas de LB suplementado con tetraciclina -1 10 mg / ml mediante la incubación de 37 ° C durante 24 h. 17

2. Preparación de las células bacterianas electro-competentes para facilitar la transformación

NOTA: La preparación de células electro-competentes se basa en el protocolo 26 para 1,0 l de cultivo que se puede escalar hacia abajo para un volumen más pequeño (es decir, 250 ml). Tenga en cuenta que este protocolo puede be utiliza para hacer todas las cepas que se describen competente en este manuscrito para facilitar la FCA. 22

  1. Inocular 50 ml de medio líquido con una sola colonia en un matraz y crecer durante la noche, por lo que asegúrese de comprobar el genotipo del mutante antes de comenzar este paso (Tabla 2).
  2. En el día dos, inocular 1,0 L de un medio apropiado (LB para los mutantes de E. coli y PD para Novosphingobium sp) con el 50 ml de cultivo de una noche, y crecer hasta una DO 600 de 0,4 a 0,6 (log de ​​fase) a 30º DO.
  3. Cosecha células por centrifugación a 5.000 xg durante 15 min a 4 ° C, se decanta el sobrenadante y resuspender el precipitado en 500 ml de H pura helada estéril 2 O.
  4. Centrifugar las células a 5000 xg durante 20 min a 4 ° C, se decanta el sobrenadante y resuspender el precipitado en 250 ml de 10% de glicerol enfriado con hielo estéril.
  5. Centrifugar las células a 5000 xg durante 20 min a 4 ° C, se decanta el súpersobrenadante y resuspender el precipitado en 2,0 ml de 10% de glicerol.
  6. Alícuota de las células mediante la transferencia de 50 l en tubos de microcentrífuga e inmediatamente congelar colocando los tubos en un baño de hielo seco-etanol. Almacenar las células competentes a -80 ° C para la electroporación.

3. electroporación de células bacterianas con plásmidos de complementación

  1. Para la electroporación, añadir 1,0 l (10-50 ng) del plásmido recombinante a una alícuota (50 l) de las células competentes y colocar en hielo durante 5 min.
  2. Transfiera la mezcla a través de la pipeta a una cubeta de electroporación y fijar el aparato de electroporación a la configuración siguiente: 25 mF capacitancia, 2,5 kV y 200 ohmios de resistencia y entregar un pulso.
  3. Añadir 1,0 ml de medio de recuperación (LB) en la cubeta de electroporación y la transferencia utilizando una pipeta a un tubo cónico de 15 ml. Recuperar con rotación suave durante 60 minutos en un incubador con agitación.
  4. La placa 100 l de la cultura desde el recomuy paso sobre las placas de agar para seleccionar los transformantes por pipeteo y propagación utilizando un esparcidor estéril.
    NOTA: Asegúrese de revisar las tablas 1 y 2 antes de comenzar este paso para comprobar los antibióticos y genotipos para hacer las placas de agar adecuados.

4. Transformación de AOH1 para Facilitar la complementación funcional Utilizando L, L-diaminopimelate aminotransferasa (DAPL)

  1. Para el análisis de complementación, transformar AOH1 con el vector vacío (pBAD33), y con los vectores de expresión DAPL en eventos de transformación independientes utilizando el protocolo de electroporación se indica en la sección 3.0.
  2. Seleccionar transformantes en placas sobre medio de agar LB suplementado con 50 g / ml -1 DAP y 34 mg / ml de cloranfenicol -1 y 50 mg / ml -1 kanamicina.
  3. Prueba para la complementación funcional por colonias réplica de galvanoplastia por estrías en LB míDium con 0,2% (w / v) de arabinosa con y sin 50 mg / ml -1 DAP y 34 mg / ml -1 kanamicina.
  4. Incubar las placas a 30 ° C durante 24 horas y observar los resultados.
    NOTA: El resultado debería mostrar que el mutante sólo es capaz de crecer en medio libre de DAP solamente cuando el gen se expresa DAPL en el fondo mutante en comparación con el vector único control.

5. Transformación de TKL-11 para Facilitar la complementación funcional Usando meso UDP-N -acetylmuramoylalanyl-D-glutamil-2,6- -diaminopimelate ligasa (Mure)

  1. Transformar el mutante con el vector vacío (pBAD33) y con el vector que expresa Mure (pBAD33 :: VsmurE) utilizando el protocolo descrito en la sección 3.0.
  2. Placa y seleccionar transformantes en medio de agar LB suplementado con 50 g / ml timina -1 y 34 mg / ml -1 cloranfenicol y se incuban las placas a 30 ° C durante 24 horas.
  3. Prueba para la complementación por rayas o chapado colonias de ambos el control y las transformaciones experimentales en dos medio LB más 0,2% (w / v) de arabinosa y 50 mg / ml timina -1.
  4. Se incuba una placa a 30 ° C y la otra a 42 ° C durante 24 horas para evaluar visualmente el fenotipo de crecimiento.
    NOTA: Los resultados deberían muestran que el mutante es capaz de crecer a 42 ° C solamente cuando el gen se expresa mûre en el fondo mutante en comparación con el vector único control.

6. Transformación de la DL39 para Facilitar la complementación funcional con el uso de la tirosina aminotransferasa (tyrB)

  1. Transformar DL39, ya sea con o pBAD33 pBAD33 :: At5g36160, y seleccionar los transformantes en placas de agar LB suplementado con tirosina 50 mg / ml -1, 50 mg / ml -1 fenilalanina, y 34 mg de cloranfenicol -1 / ml usando el protocolo descrito en el apartado 3.0.
  2. Réplica-plate colonias en medio mínimo (M9) con 50 mg / ml de fenilalanina-1 y 50 mg / ml de tirosina -1, 50 mg / ml -1 aspartato, 50 mg / ml de leucina -1, 50 mg / ml -1 valina, 50 g / isoleucina -1 ml, 10 mg / ml -1 uracilo 0,5% de glicerol (p / v), 0,2% (w / v) de arabinosa. También colonias réplica de placa en las placas que carecen de fenilalanina y tirosina por rayar la misma colonia de ambas placas.
  3. Incubar las placas a 30 ° C durante 48 horas para observar fenotipo de crecimiento.
    NOTA: El resultado debería mostrar que el mutante sólo es capaz de crecer en fenilalanina y tirosina medios libres, sólo cuando se expresa el gen tyrB en el fondo mutante en comparación con el vector único control.

7. Transformación de Hx699 para Facilitar la complementación funcional de la Hypomucoid fenotipo de Novosphingobium sp. Hx699 cepa

  1. Transformar la cepa de tipo salvaje Novosphingobium sp. (Rr2-17) y el mutante Hx699 con pRK290 y pRK290 :: rsh NSP en 2 eventos de transformación independientes utilizando el protocolo de transformación descrito en la sección 3.0.
  2. Placa de las transformaciones en la dextrosa de patata (PD) agar suplementado con 10 mg / ml -1 tetraciclina, y se incuba durante al menos 24 horas o hasta que aparecen los transformantes.
  3. Racha de dos transformaciones en forma de "X" en placas de agar PD fresco y se incuba a 30 ° C durante al menos 4 días. Observar los fenotipos del vector solamente, y el experimento mediante el examen visual del fenotipo de crecimiento de ambas placas.
    NOTA: El resultado debe demostrar que el fenotipo hipo-mucoide se complementa cuando rsh se expresa en el fondo mutante en comparación con el vector único control.

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Resultados

Las cepas bacterianas que se emplean en los diversos análisis de complementación funcional se enumeran en la Tabla 2.

análisis de complementación funcional: L, L-aminotransferasa diaminopimelate (DAPL)

El E. coli mutante doble AOH1 (Δ dapD :: Kan2, dapE6) alberga una mutación en el gen dapE y una deleción completa del gen ...

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Discusión

Muchos de los cursos que son parte integral del plan de estudios de Biotecnología y Biociencia Molecular en el Instituto de Tecnología de Rochester tienen un componente de laboratorio, además de la parte de lectura del curso. El plan de estudios para el año académico 2014-2015 contiene un total de 48 cursos, 29 de los cuales contienen un componente de laboratorio que representan aproximadamente el 60%. Uno de estos cursos es Fundamentos de Bioquímica Vegetal y Patología (FPBP), un curso mixto clase / laboratorio y Biose...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

AOH y el MAS reconoce la Facultad de Ciencias y la Escuela H. Thomas Gosnell de Ciencias de la Vida en el Instituto de Tecnología de Rochester busca de apoyo. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Nacional de Ciencia de Estados Unidos (NSF) premio a AOH MCB-1120541.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
E. coli mutantesde laboratorio Hudson/Savka o CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
ElectroporadorBiorad-USA1652100
Cubetas de electroporaciónBiorad-USA1652082
Incubadora de temperatura controladaGenérico
MicrocentrífugaGenérica
Luria AgarThermofisher Scientific 22700025
Luria CaldoThermofisher Scientific12795084
M9 MedioSigma-Aldrich63011
Patata Dextrosa MedioFisher Scientfic DF0013-15-8
KanamicinaSigma-AldrichK1377
DiaminomimelatoSigma-Aldrich92591
TiminaSigma-AldrichT0376
CloranfenicolSigma-AldrichC0378
TirosinaSigma-AldrichT3754
FenilalaninaSigma-AldrichP2126
AspartatoSigma-AldrichA9256
ValinaSigma-AldrichV0500
LeucinaSigma-AldrichL8000
IsoleucinaSigma-AldrichI2752
UraciloSigma-AldrichU0750
GylcerolSigma-AldrichG5516
ArabinosaSigma-AldrichA3256
TetraciclinaSigma-Aldrich87128
ADN polimerasa TaqThermofisher Scientific10342-020
Platino pfx ADN polimerasaThermofisher Scientific11708-013
T4 ADN ligasaThermofisher Scientific15224-041
E. coli Dh5-alfaThermofisher Scientific18258012
E. coli Top10Thermofisher ScientificC4040-03
pET100D/topo vectorThermofisher ScientificK100-01
pCR2.1 VectorThermofisher ScientificK2030-01

Referencias

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