Artículo de método

Fabricación y funcionamiento de los dispositivos de apoyo a granel Acoustofluidic ondas acústicas pie para Sheathless Centrándose de partículas

13K vistas

⸱

DOI:

10.3791/53861

⸱

6 de marzo de 2016

 ,  ,  ,  , 
1NSF Research Triangle Materials Research Science and Engineering Center, Duke University, 2Department of Biomedical Engineering, Duke University, 3Department of Mechanical Engineering and Materials Science, Duke University

En este artículo

Resumen

Acoustofluidic dispositivos utilizan ondas ultrasónicas dentro de los canales de microfluidos para manipular, concentrar y aislar micro suspensión y entidades nanoscópicas. Este protocolo describe la fabricación y el funcionamiento de tal dispositivo de soporte ondas estacionarias acústicas a granel para centrarse partículas en una línea de corriente central sin la ayuda de fluidos de la vaina.

Resumen

Acoustophoresis se refiere al desplazamiento de objetos en suspensión en respuesta a las fuerzas de dirección de la energía del sonido. Dado que los objetos suspendidos deben ser menores que la longitud de onda incidente de sonido y el ancho de los canales de fluidos son típicamente decenas a cientos de micrómetros de diámetro, los dispositivos acoustofluidic suelen utilizar ondas ultrasónicas generadas a partir de un transductor piezoeléctrico pulsante a altas frecuencias (en el rango de megahercios ). En frecuencias características que dependen de la geometría del dispositivo, es posible inducir la formación de ondas estacionarias que pueden concentrarse a lo largo de líneas de corriente partículas de fluidos deseados dentro de un flujo mayor. A continuación, se describe un método para la fabricación de dispositivos acoustophoretic de materiales comunes y los equipos de sala limpia. Mostramos los resultados representativos de la concentración de partículas con factores de contraste acústicas positivos o negativos, que se mueven hacia los nodos de presión o antinodos de las ondas estacionarias, respectivEly. Estos dispositivos ofrecen un enorme utilidad práctica para posicionar con precisión un gran número de entidades microscópicas (por ejemplo, células) en estacionaria o corrientes de fluidos para aplicaciones que van desde la citometría de montaje.

Introducción

Dispositivos Acoustofluidic se utilizan para ejercer fuerzas de dirección en entidades microscópicas (por ejemplo, partículas o células) para su concentración, la alineación, el montaje, el confinamiento o la separación dentro de los fluidos en reposo o flowstreams laminares. 1 Dentro de esta amplia clase de dispositivos, las fuerzas se pueden generar a partir de mayor las ondas acústicas, la superficie de las ondas estacionarias acústicas (SSAWs) 2 o viajar acústica olas. 3 Si bien nos centramos en la fabricación y el funcionamiento de los dispositivos que soportan las ondas estacionarias acústicas de volumen, los dispositivos que soportan SSAWs han recibido mucha atención recientemente debido a su capacidad para manipular con precisión las células a lo largo de las superficies 4 y ordenar rápidamente las células en los canales de flujo continuo. 5 Dispositivos de soporte ondas estacionarias acústicas de volumen, sin embargo, se reordenan las partículas en función de las vibraciones mecánicas de las paredes del dispositivo generada por un transductor piezoeléctrico, que excita las ondas estacionarias en microfluidoscavidades resonantes a frecuencias definidas geométricamente. Esto permite que el potencial para generar amplitudes de presión más altas en comparación con los dispositivos de SSAW, y el transporte por lo tanto, más rápido acoustophoretic de entidades microscópicas. 6

Estas ondas estacionarias consisten en un conjunto espacialmente periódica de los nodos y antinodos de presión, que se fijan en posición como la presión oscila en el tiempo. Las partículas responden a las ondas estacionarias mediante la migración a los nodos de presión o antinodos, dependiendo de las propiedades mecánicas de las partículas en relación con el fluido, y que se describen por el factor de contraste acústico:

figure-introduction-1

donde las variables ρ y β representan densidad y compresibilidad y los subíndices p y ƒ representan el objeto suspendido (por ejemplo, partícula o célula) y el líquido, respectivamente.7 Las entidades que poseen un factor de contraste acústico positivo (es decir, ɸ> 0) migran al nodo (s) de presión; mientras que, las entidades que poseen un factor de contraste acústico negativo (es decir, ɸ <0) migrar a los antinodos de presión. 7 Mientras que la mayoría de los materiales sintéticos (por ejemplo, perlas de poliestireno) y células exhiben contraste acústica positiva, las partículas elastoméricas hechas de base de silicona materiales, 8 moléculas grasas 9 u otros componentes altamente elásticos exhiben contraste acústico negativo en el agua. Partículas elastoméricas en dispositivos acoustofluidic se pueden utilizar para aislar moléculas pequeñas 10 y como medios para confinar las partículas sintéticas 11 o células 12 para los fines de clasificación discrimina. 13

Dispositivos Acoustofluidic suelen fabricarse a partir de materiales estándar (por ejemplo, de silicio y vidrio) que tienen suficiente rigidez para support una onda estacionaria acústica. En muchos dispositivos acoustofluidic (incluyendo el dispositivo que se muestra en el presente documento), las ondas mecánicas están diseñados para resonar a modo armónico más bajo, que consiste en una onda estacionaria media-longitud de onda que abarca la anchura del microcanal. Esta configuración tiene un nodo de presión en el centro de los antinodos de canal y de presión a lo largo de las periferias de la canal. Se ha demostrado previamente que estos sistemas se pueden utilizar para aplicaciones de citometría basadas en chip 14-16 y aplicaciones que van desde la captura de las células a la concentración de células. 17,18

Se describe el proceso de fabricación, métodos de uso y capacidades de rendimiento representativos de un dispositivo que soporta acoustofluidic ondas estacionarias acústicas de volumen. Este dispositivo requiere un paso de fotolitografía, una etapa de ataque y una etapa de fusión para unir de forma permanente un vaso "tapa" al sustrato de silicio grabado al agua fuerte. Observamos que otra acoustofluididispositivos que soportan c ondas estacionarias acústicas a granel pueden ser fabricados de vidrio o de cuarzo capilares unidos a transductores piezoeléctricos, que se describe en otro lugar. 19,20 dispositivos basados ​​en silicio ofrecen las ventajas de robustez y el control sobre la geometría del canal de flujo, que en conjunto permiten numerosos tipos de procesamiento de muestras que contienen suspensiones de partículas y células. Los dispositivos se proporcionan reutilizable que se limpian adecuadamente entre usos (por ejemplo, lavando el dispositivo con tampones y detergentes).

Protocolo

1. La fotolitografía

  1. El diseño de la máscara fotográfica usando un paquete de software apropiado y enviar el diseño a una impresora fotomáscara calificado. 21
  2. En una instalación de sala limpia, enjuague un "solo lado pulido 6 oblea de Si con un flujo constante de acetona (≥99.5%; véase la Tabla 1), seguido de un flujo constante de metanol (99,8%; véase la Tabla 1). Se seca la oblea por pulverización con gas N2 y la colocación de la oblea en una placa caliente a 95 ° C durante 2 min.
    NOTA: El perfil de dopado y orientación de los cristales de las obleas no afectan a los siguientes procedimientos.
  3. Proteger el canal exterior de la recubridora de rotación (en una capa del capo motor de giro estándar), cubriendo con una hoja de lámina de aluminio y colocar el limpio oblea de Si en el centro de la pinza de sujeción de vacío en la recubridora de rotación para asegurar la oblea.
  4. Depósito de resina fotosensible positiva directamente sobre el centro de la oblea vertiendo cuidadosamente hasta que la mayoría del fotorresistente cubrede la oblea. Tener cuidado para asegurar que no haya burbujas en la resina fotosensible.
    NOTA: Los procedimientos exactos en los pasos 1.5 a 1.10 corresponden a la fotoprotección se muestra en la Tabla 1; diferentes procedimientos pueden ser necesarios para diferentes resinas fotosensibles.
  5. Iniciar el ciclo de centrifugado mediante la realización de los siguientes procedimientos:
    1. Programar una velocidad de 300 rpm, una rampa de 100 rpm / seg, y un tiempo de giro de 5 segundos para iniciar el ciclo de centrifugado.
    2. Programa a una velocidad de 1.800 rpm, una rampa de 1.000 rpm / seg, y un tiempo de rotación de 60 seg para repartir uniformemente la fotoprotección.
    3. Programa a una velocidad de 0 rpm, una rampa de 1.000 rpm / seg, y un tiempo de centrifugado de 0 segundos para concluir el ciclo de centrifugado.
  6. Liberar el vacío en el mandril y el uso de pinzas de la oblea para recuperar la oblea de la pinza de sujeción. A continuación, coloque la oblea en una placa caliente para hornear a 110 ° C durante 165 seg.
    NOTA: Este paso se conoce como el "bake suave".
  7. Cargar la máscara fotográfica en el soporte de una máscaraalineador / máquina de fotolitografía.
  8. Editar los parámetros de la máquina de la fotolitografía para proporcionar una dosis de energía de 1400 mJ / cm 2 (por ejemplo, para una intensidad de salida de 13,5 mW / cm 2, utilizar un tiempo de exposición de ~103.7 sec).
  9. Eliminar la oblea photopatterned del soporte y colocarlo en una solución de su correspondiente desarrollador (ver Tabla 1) durante 5 min.
  10. Retire la oblea del promotor, lavar la oblea con un flujo constante de H2O desionizada y se seca con gas N2.
    NOTA: El exceso de desarrollo puede causar patrones se hinchen, mientras que en vías de subdesarrollo puede provocar la eliminación incompleta de la resina fotosensible a lo largo de las características de la foto-modelado.
  11. Inspeccionar la oblea bajo un microscopio para confirmar los patrones impresos en la fotomáscara fueron transferidos a la fotoprotección.

2. Reactivo Profundo Ion Aguafuerte

  1. Cargar la foto-modelado de la oblea de Si en la cámara de una profundareactiva instrumento grabado iónico y grabar los canales de fluidos en la oblea de Si a la profundidad deseada siguientes procedimientos de grabado estándar. 22
  2. Con cuidado, descargar la muestra de la cámara después de que el proceso de grabado es completa.
  3. Para eliminar el exceso de resina fotosensible de la oblea, preparar un gran vaso de precipitados con una solución de removedor de resina fotosensible (ver Tabla 1) en una campana bien ventilada dedicada al disolvente uso y colocarlo sobre una placa caliente a 65 ° C.
  4. Sumergir la pastilla en la solución de extracción fotoprotector y deje reposar durante 1 hora.
    NOTA: Diferentes soluciones pueden ser utilizadas para extraer el material fotorresistente (por ejemplo, una solución de acetona (≥99.5%; véase la Tabla 1) puede eliminar la resina fotosensible por remojo durante la noche).
  5. Eliminar la oblea del vaso de precipitados y enjuagar con alternancia de corrientes de acetona (≥99.5%; véase la Tabla 1) y alcohol isopropílico (≥99.7%; véase la Tabla 1). Se seca la oblea wITH gas N2.

3. Limpieza Piranha

  1. En una campana bien ventilada (dedicado a la utilización de ácidos), preparar una solución Piranha mediante la adición de H 2 O 2 (30,0% en peso en agua;. Véase la Tabla 1) a H 2 SO 4 (95,0-98,0%; véase la tabla 1) en una relación 1: 3 en un vaso de precipitados grande, limpio.
    PRECAUCIÓN: Piranha soluciones son altamente corrosivos, son un oxidante fuerte y son altamente peligrosos. Tenga mucho cuidado en el manejo de soluciones de piraña y llevar el equipo de seguridad adecuado.
  2. Sumergir la oblea de iones grabado con las características-grabados al agua fuerte hacia arriba y dejar actuar durante 5 minutos. Retirar con cuidado la oblea y enjuague completamente con H2O desionizada
  3. Vuelva a sumergir la oblea en la solución de pirañas durante 2 min. Retirar con cuidado la oblea y enjuague completamente con abundante H2O desionizada
  4. En una campana bien ventilada separada dedicada a disolvente uso, lavar la oblea con un flujo constante deacetona (≥99.5%; véase la Tabla 1), seguido de un flujo constante de metanol (99,8%; véase la Tabla 1) y secar la oblea con N 2 gas. Disponer de la solución Piranha siguiendo los procedimientos de seguridad adecuados.

4. Preparar la tapa de cristal de borosilicato

  1. Con una herramienta de escriba, grabar líneas rectas en el vidrio de borosilicato para crear segmentos rectangulares (por ejemplo, 8 x 4 cm 2). Con cuidado, romper el cristal para recuperar los segmentos rectangulares.
  2. Tome uno de estos segmentos de vidrio y colocarlo en la parte superior de una copia impresa del diseño deseado (con dimensiones reales) para marcar la ubicación de las entradas y salidas en el cristal con un marcador negro.
  3. Perforar los orificios de entrada y salida en el vidrio de borosilicato.
    NOTA: El equipo apropiado de seguridad se debe usar en todo momento.
    1. Fijar una broca de 1/8 "en la boca del taladro de columna. Colocar el segmento rectangular de vidrio en la parte superior deuna placa de Al con agujeros perforados de modo que las marcas en el vidrio están por encima de los orificios de la placa de Al. Asegurar el vidrio en la placa de Al con cinta adhesiva.
    2. Cuidadosamente baje el mango de alimentación para iniciar la perforación de pequeños agujeros en el vidrio y continuar para bajar el mango hasta que el agujero se hace a través del cristal. Una vez finalizado el agujero, retire la cinta y lentamente levantar el vidrio para eliminar el polvo de vidrio. Coloque el polvo de vidrio en un vaso con agua y desechar el uso de los procedimientos de seguridad adecuados.
    3. secar con cuidado el cristal con un paño absorbente no dejan pelusa y siga los mismos procedimientos (pasos 4.3.1-4.3.2) para perforar los otros agujeros de entrada y salida.
  4. Siga el mismo procedimiento (Sección 3, más arriba) para limpiar el segmento rectangular de vidrio con una solución de pirañas.
    PRECAUCIÓN: Piranha soluciones son altamente corrosivos, son un oxidante fuerte y son altamente peligrosos. Tenga mucho cuidado en el manejo de soluciones de piraña y llevar el equipo de seguridad adecuado.

5. unión anódica

  1. Con una herramienta de escriba, grabar líneas rectas en la oblea de Si de todo el perímetro del chip microfluídico tal que es ligeramente más pequeño que el segmento rectangular de vidrio (por ejemplo, 7 x 3 cm 2). Con cuidado, coloque la oblea a lo largo de las líneas grabadas.
  2. Enjuague el segmento de Si con un flujo constante de acetona (≥99.5%; véase la Tabla 1), seguido de un flujo constante de metanol (99,8%; véase la Tabla 1). Colocar la oblea en una placa caliente a 95 ° C durante 2 min se sequen.
  3. Con las características-grabados al agua fuerte en el segmento de Si hacia arriba, añadir con cuidado el cristal limpio en la parte superior del segmento Si y asegurarse de que los agujeros se alineen correctamente.
  4. voltear cuidadosamente los segmentos garantizando al mismo tiempo los agujeros se mantengan alineados. Puesto que el segmento de vidrio es mayor que el segmento de Si, asegurar los dos segmentos con cinta de doble cara donde la mitad de la cinta asegura los bordes verticales de la segmento de Si y la otra mitadde la cinta asegura el vidrio en voladizo. Luego, abre de nuevo los segmentos tales que el segmento de vaso está en la parte superior, y colocar los segmentos en la parte superior de una placa de metal en una placa caliente.
  5. Añadir cuidadosamente una segunda losa de metal (por ejemplo, acero) de un peso lo suficientemente pesado (es decir, al menos 5 kg) directamente a la parte superior del vidrio montado y segmentos de Si.
    NOTA: Este losa de metal no debe estar en contacto con el segmento de Si o de la cinta conductora.
  6. El uso de una fuente de alimentación de alta tensión, conecte un plomo (alimentación) para la losa metálico en la parte superior de la copa montado y segmentos de Si y el otro cable (tierra) a la losa metálica inferior.
  7. Gire el voltaje en la placa caliente subyacente a 1.000 V. Compruebe el voltaje aplicado mediante el uso de un multímetro; presione una sonda contra la placa inferior y la otra sonda contra la placa superior.
    PRECAUCIÓN: La alta tensión es extremadamente peligrosa; tenga cuidado de no tocar las placas metálicas o los cables de conexión.
  8. Deje el calorplaca a 450 ° C durante 2 horas para permitir que el vidrio "tapa" a anódicamente enlace con el sustrato de Si. Regresar después de 2 horas para apagar la placa caliente, apague la fuente de alimentación de CC y eliminar el dispositivo de las placas metálicas.
    ADVERTENCIA: Las placas metálicas pueden estar muy calientes durante y después del proceso de unión, por lo que permitir que los materiales que se enfríe durante al menos 1 hora después de apagar la placa caliente.

6. Finalización del dispositivo Acoustofluidic

  1. Raspar la superficie del vidrio con una navaja de afeitar para eliminar la suciedad producida por la unión anódica y limpiar la superficie del vidrio con acetona.
  2. Prepare una hoja de polidimetilsiloxano (PDMS) de aproximadamente 5 mm de espesor y cortar varias losas pequeños, cuadrados aproximadamente 10 x 10 mm 2 (ver Tabla 1). 23
  3. Utilice un punzón de biopsia 3 mm para cortar un agujero en el centro de cada losa PDMS de manera que se inserte el tubo de silicona a través de él. Coloque las losas directamente sobre el orificios en el sustrato de vidrio y pegar las losas con epoxi.
    NOTA: Tenga cuidado de no usar demasiado pegamento, ya que ocluir los orificios del dispositivo.
  4. pegar con cuidado el transductor de plomo zirconato titanato (PZT) para el segmento de Si en el lado posterior del dispositivo, centrada en debajo del microcanal.
  5. Soldar dos cables a las dos áreas conductoras sobre el transductor PZT. Tenga cuidado de que los cables estén bien conectados al transductor PZT. Insertar el tubo de silicona a través de los agujeros en las placas de PDMS y añadir pegamento adicional alrededor de losas y el tubo para asegurar su fijación.

7. Funcionamiento del dispositivo de Acoustofluidic

  1. montar de forma segura el dispositivo sobre una platina del microscopio con el microcanal directamente debajo del objetivo.
    NOTA: Asegúrese de que el transductor PZT no hace contacto con el escenario mediante la colocación de un pequeño inserto debajo del dispositivo.
  2. El uso de conectores estandarizados, conectar los tubos de silicona de la outlets del dispositivo a jeringas garantizados con bombas de jeringa.
    NOTA: Esta configuración está destinada a "modo de retirada"; bombas de jeringa, alternativamente, se pueden utilizar para inyectar la muestra en el dispositivo.
  3. Se coloca el tubo de silicona que lleva a la entrada del dispositivo en un vial que contiene la muestra de fluido (por ejemplo, una suspensión de perlas de poliestireno o células).
  4. Colocar el vial que contiene la muestra de fluido en una placa de agitación para mezclar continuamente la muestra y asegurar que una concentración constante de partículas o células se mantiene durante todo el curso del experimento.
  5. Conectar los cables del transductor PZT a la salida de un amplificador de potencia en serie con un generador de funciones. Programar la configuración de el generador de funciones (por ejemplo, de pico a pico de tensión y frecuencia) y monitorizar la señal de salida del amplificador con un osciloscopio. Encienda el generador de funciones y amplificador de potencia para empezar a accionar el transductor PZT. 6
    1. Para estimar la frecuencia de resonancia del dispositivo, sigue la ecuación c = λ * ƒ, donde c es la velocidad del sonido del medio (es decir, agua), λ es la longitud de onda acústica y ƒ es la frecuencia del transductor PZT. En el caso de un medio de longitud de onda de armónicos (que se muestra en la sección Resultados representativos), la anchura de las microcanal debe ser la mitad de la longitud de la onda estacionaria.
    2. Utilice un ajuste de voltaje pico a pico en el rango de 0-50 V.
      NOTA: Un aumento en los resultados de tensión aplicados en las amplitudes de presión más alta, y por lo tanto, acoustophoresis más rápida.
  6. A su vez en el microscopio y asegurar que el canal de microfluidos es claramente en el centro.
  7. Encienda la bomba de jeringa para aplicar el flujo e introducir la muestra en el dispositivo. Supervisar las entidades que fluyen a través del dispositivo con el microscopio en modo de fluorescencia.
  8. Asegúrese de que el dispositivo se centra de manera eficiente particles mediante el ajuste de la tensión de pico a pico suministrada al transductor PZT para modificar la amplitud de presión y mediante la realización de un barrido de frecuencia cerca de la frecuencia de resonancia esperada para identificar la frecuencia de resonancia empírica.

Resultados

Hemos diseñado el dispositivo acoustofluidic para contener una entrada de trifurcating, un canal principal con una anchura de 300 micras y una salida trifurcating (Figura 1A - B). Observamos que sólo utilizamos una entrada para todos los experimentos en este estudio (es decir, lograr sheathless concentración de partículas a través de fuerzas de radiación acústica) mediante el bloqueo de las demás tomas con tapones extraíbles. Siguiendo los procedimientos descritos anteriormente, se construyó un chip que posee una anchura de canal de 313 m, con un error de ~ 4% debido a imperfecciones durante el proceso de microfabricación (Figura 1C - D). Hemos operado el dispositivo a la frecuencia de excitación de 2.366 MHz para inducir una onda estacionaria armónica media longitud de onda.

Se utilizó un generador de señal conectado a un amplificador de potencia para generar la alta frecuencia de forma de onda sinusoidal para accionar el tr PZTansducer. Se utilizó un osciloscopio para medir la tensión de salida de pico a pico (V pp) generado a partir del amplificador de potencia para verificar la fidelidad de la forma de la señal y la amplitud. Usando una bomba de jeringa, que primero inyectó una suspensión de perlas de poliestireno verdes fluorescentes a una velocidad de 100 l / min sin accionamiento del transductor PZT como un control negativo (Figura 2A). A continuación, se acciona el dispositivo en 2.366 MHz para formar una onda de longitud de onda media de pie a través de la anchura del microcanal (V pp = 40 V; Figura 2B). Hemos encontrado que estas partículas, que tienen un factor de contraste acústica positiva, se centró a lo largo del nodo de presión como se esperaba. 6 también Inyectamos partículas fluorescentes rojas con un factor de contraste acústico negativo (es decir, ɸ ≈ -0,88, sintetizado a partir de un proceso descrito anteriormente) 8 para verificar que nuestro dispositivo podría inducir su concentración a lo largo de los antinodos de presión ( Figura 2C).

Por último, hemos explorado el grado de concentración de partículas con un factor de contraste acústica positiva en un rango de velocidades de flujo (es decir, 0 a 1.000 l / min como regulada por una bomba de jeringa) y tensiones (es decir, de 0 a 50 Vpp). Videos compuestos por 15 cuadros fueron recogidos para cada condición. software ImageJ se utilizó para la muestra cinco del perfil de intensidad de fluorescencia a través de la anchura del microcanal. Se utilizó un programa de cálculo numérico en un promedio de los perfiles de intensidad para cada condición y para suavizar los datos promediados utilizando un programa de filtrado de línea. Como era de esperar, el grado de partículas de enfoque (es decir, tal como se define por la anchura del pico de fluorescencia, correspondiente a la anchura de la corriente de partículas) disminuyó con el aumento velocidades de flujo (Figura 3A). También se encontró que el grado de focalización de partículas aumentó con el aumento voltajes aplicados (Fifigura 3B).

figure-results-1
Figura 1:. Dispositivo Acoustofluidic apoyo ondas estacionarias acústicas a granel vistas esquemáticas de la parte superior (A) e inferior (B) de un dispositivo compuesto por un sustrato de silicio grabado fusionado a un vidrio de borosilicato "tapa", polidimetilsiloxano (PDMS) bloquea conectado a la silicona tubos y un transductor piezoeléctrico soldadas a los cables pegados a la parte inferior del dispositivo. Las fotografías de la parte superior (C) e inferior (D) del dispositivo también se muestran. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Acoustic de enfoque departículas con factores de contraste acústicas positivos y negativos. (A) antes del accionamiento del transductor de plomo zirconato titanato (PZT), partículas con un factor positivo acústica de contraste (10 micras, perlas de poliestireno de color amarillo-verde) que fluye a 100 l / min ocuparon la anchura del microcanal. (B) Después de que el transductor se acciona PZT (V pp = 40 V y ƒ = 2.366 MHz), las partículas en (A) se muestran a concentrarse a lo largo del nodo de presión de la onda estacionaria. (C) Las partículas con un factor de contraste acústico negativo centrado a lo largo de los antinodos de presión de la onda estacionaria en ausencia de flujo aplicada (V pp = 40 V y ƒ = 2.366 MHz). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3:. Centrándose rendimiento de un dispositivo de acoustofluidic parcelas intensidad de fluorescencia de perlas de poliestireno (como se muestra en la Figura 2A - B) se muestran para diferentes tasas de flujo (A) (que van desde 0 a 1000 l / min) con un pico-a-constante tensión de pico de 40 V y (B) diferentes voltajes aplicados (que van de 0 a 50 Vpp) con un caudal constante de 100 l / min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Acoustophoresis ofrece un enfoque simple y rápida para organizar precisamente entidades microscópicas dentro de los microcanales de fluidos sin la necesidad de los fluidos de la envoltura utilizada en enfoques centrados hidrodinámicas. 24 Estos dispositivos proporcionan varias ventajas sobre otros métodos de manipulación de partículas o células (por ejemplo, magnetoforesis, 25,26 dielectroforesis 27 o inercial forzando 28) debido a su capacidad de procesar entidades sin susceptibilidades magnéticas de alto, polarizabilidad eléctricos o una dispersidad estrecha de tamaños. Por otra parte, los nodos de enfoque de una onda estacionaria acústica se pueden colocar lejos de la fuente de excitación, que es algo que no es posible por campos magnéticos o eléctricos estáticos según el teorema de Earnshaw. 29 Una ventaja adicional es que los dispositivos acústicos pueden centrarse partículas a través una amplia gama de caudales aplicados e independiente de la dirección de flujo, que no es posible en dispositivos that dependen de fuerzas de inercia para el enfoque, 28 proporcionando los medios para transportar de manera eficiente las partículas o células para su inspección por partículas mejorada para aplicaciones tales como la citometría de flujo y partículas de tamaño. 30,31 La facilidad de fabricación y el funcionamiento del dispositivo puede permitir directamente para la implementación de similares dispositivos para el enfoque, para concentrarse, de fraccionamiento y clasificación de objetos suspendidos en líquidos. 32

Hemos demostrado que las fuerzas de radiación primaria, que son las mayores fuerzas producidas por las ondas estacionarias acústicas, 1 pueden centrarse micropartículas que fluyen a través de un canal de microfluidos a velocidades de flujo superiores a 10 ml / h para un solo diseño de orificio. Para un caudal fijo de 100 l / min, mostramos que nuestro dispositivo puede enfocar partículas en una línea de corriente estrecha (es decir, 50 micras de diámetro) sin ningún tipo de fluidos de la vaina con tensiones tan bajas como 20 V pico a pico, lo que permite una baja método -de potencia para el discontinua de enfoque de 10 millones de partiCiclos / min en el tratamiento de soluciones densamente concentradas (por ejemplo, 6 x 10 8 partículas / ml), como un ejemplo. Además, este rendimiento se puede aumentar dramáticamente mediante la fabricación de chips o canales acoustofluidic de orificios múltiples que son accionados con armónicos más altos para producir conjuntos de nodos en paralelo. 33

Si bien el dispositivo que se muestra en el presente documento sólo requiere materiales y métodos utilizados en la microfabricación convencional, destacamos que hay un puñado de otras técnicas que se pueden utilizar para la construcción de dispositivos similares. 19,34,35 Las ventajas de este enfoque incluyen su simplicidad, así como la durabilidad del dispositivo final.

Los pasos críticos para la fabricación de estos dispositivos incluyen fotolitografía para definir la geometría del microcanal, grabado por iones reactivos para formar el canal en la unión de silicio y anódico para fundir el silicio a una "tapa" transparente para la observación por fluorescenLa microscopía ce. Todos estos pasos requieren instalaciones de sala limpia para evitar la acumulación de polvo o suciedad dentro del dispositivo. Una vez completados estos pasos, sin embargo, la unión de un transductor PZT y puertos de fluidos son relativamente sencillo y se puede realizar fuera de una sala limpia.

Sin embargo, el tratamiento adecuado del dispositivo es esencial para su longevidad. Esto incluye (1) incubar el dispositivo con reactivos de pasivación (por ejemplo, poli (etileno glicol) silano) antes de cada experimento para proteger el canal de acumulación de residuos y (2) el lavado del dispositivo con detergentes después de cada experimento. La acumulación de los desechos puede comprometer la fidelidad de la onda estacionaria acústica y puede reducir la capacidad de enfocar de manera eficiente las partículas o células dentro del dispositivo. También observamos que estos dispositivos no están bien adaptados para muestras muy polidispersas o muestras que contienen entidades se acercan a la mitad del tamaño de la onda estacionaria.

Acoustofluidispositivos DIC proporcionan enorme utilidad para una variedad de aplicaciones que abarcan desde el conjunto coloidal a la celda de separación y citometría de flujo. La capacidad de procesar muestras biológicas con precisión a altas velocidades de flujo puede permitir la capacidad de aumento de los rendimientos de estos dispositivos de microfluidos, al tiempo que reduce los costes de reactivos superfluos, grandes volúmenes de muestra o equipos voluminosos para dispensar fluidos de la vaina. Los métodos de fabricación necesarias para hacer que los dispositivos acoustofluidic son sencillos y los procedimientos necesarios para su operación son fáciles de usar. Esperamos que estos procedimientos impulsarán el desarrollo generalizado de dispositivos similares para catalizar nuevas áreas de investigación para aplicaciones en la ciencia de materiales, la biotecnología y la medicina.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias (a través de las subvenciones DMR-1121107, CMMI-1363483 y Becas de Investigación de Posgrado (GRF-1106401) a C.W.S., D.F.C. y K.A.O.) y los Institutos Nacionales de Salud (R21GM111584). Los autores no tienen conflictos de intereses.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Obleas de silicioAddison Engineering, Inc.3P16" oblea de silicio de grado mecánico < 111>
AZ 9260 fotorresistenteMicroChemicals GmbHAZ9260-QFotorresistente positivo
AZ 400K reveladorMicroChemicals GmbHAZ400K CONC-CSDiluir 1 parte de AZ 400k en 4 partes desionizado H2O
H2O2Sigma Aldrich, Co.21676330 % en peso en H2O
H2SO4Sigma Aldrich, Co.320501Reactivo ACS, 95.0-98.0%
1165 Removedor fotorresistenteDow Chemical, Co.DEM-10018073Acetona a base de 1-metil-2-pirrolidinona
Sigma Aldrich, Co.320110Reactivo ACS, ≥ 99.5%
Alcohol isopropílicoSigma Aldrich, Co.W292907≥ 99.7%, FCC, FG
MetanolSigma Aldrich, Co.322415Anhidro, 99.8%
Vidrio de borosilicato   (Vidrio Nexterion B)Schott AG 2098576

Tamaño: 120 x60 ± 0,1 mm Espesor: 1 ± 0,005 mm

Broca para vidrio y cerámica McMaster-Carr, Inc.2954A1Tamaño de la broca: 1/8" Longitud total: 2 3/16" Diámetro del vástago: 7/64"
Kit de polidimetilsiloxano (PDMS)Sigma Aldrich, Co.761036Dow Corning, Co.; Sylgard 184®; Paquete de clips de 10 g
Punzón de biopsia   Ted Pella, Inc. 15078Harris uni-core ID de la punta: 3.0 mm  Diámetro exterior de la punta: 3,40 mm
Transductor de titanato de circonato de plomo (PZT)APC International, Ltd.Pedido personalizado, (841 WFB)Longitud: 30,0 mm, Ancho: 5,0 mm, Frecuencia: 2,46 MHz, 2,0 mm Envoltura final para cables
Tubo de silicona Cole Parmer Instrumento, Co.07625-220,6 mm de diámetro interior
Perlas de poliestirenoThermo Fischer Scientific, Inc.F-883610 y micro; m fluorescencia amarillo-verde

Referencias

  1. Laurell, T., Petersson, F., Nilsson, A. Chip integrated strategies for acoustic separation and manipulation of cells and particles. Chem Soc Rev. 36 (3), 492-506 (2007).
  2. Ding, X., et al. Surface acoustic wave microfluidics. Lab Chip. 13 (18), 3626-3649 (2013).
  3. Schmid, L., Weitz, D. A., Franke, T. Sorting drops and cells with acoustics: acoustic microfluidic fluorescence-activated cell sorter. Lab Chip. 14 (19), 3710-3718 (2014).
  4. Guo, F., et al. Controlling cell-cell interactions using surface acoustic waves. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 43-48 (2015).
  5. Li, P., et al. Acoustic separation of circulating tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 4970-4975 (2015).
  6. Gao, L., et al. Two-dimensional spatial manipulation of microparticles in continuous flows in acoustofluidic systems. Biomicrofluidics. 9 (1), 014105(2015).
  7. Bruus, H. Acoustofluidics 7: The acoustic radiation force on small particles. Lab Chip. 12 (6), 1014-1021 (2012).
  8. Shields, C. W. IV, et al. Nucleation and growth synthesis of siloxane gels to form functional, monodisperse, and acoustically programmable particles. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (31), 8070-8073 (2014).
  9. Petersson, F., Nilsson, A., Holm, C., Jonsson, H., Laurell, T. Separation of lipids from blood utilizing ultrasonic standing waves in microfluidic channels. Analyst. 129 (10), 938-943 (2004).
  10. Cushing, K. W., et al. Elastomeric negative acoustic contrast particles for affinity capture assays. Anal Chem. 85 (4), 2208-2215 (2013).
  11. Johnson, L. M., et al. Elastomeric microparticles for acoustic mediated bioseparations. J Nanobiotechnology. 11, 22(2013).
  12. Shields, C. W. IV, Johnson, L. M., Gao, L., Lopez, G. P. Elastomeric negative acoustic contrast particles for capture, acoustophoretic transport, and confinement of cells in microfluidic systems. Langmuir. 30 (14), 3923-3927 (2014).
  13. Shields, C. W. IV, Reyes, C. D., Lopez, G. P. Microfluidic cell sorting: a review of the advances in the separation of cells from debulking to rare cell isolation. Lab Chip. 15, 1230-1249 (2015).
  14. Goddard, G., Martin, J. C., Graves, S. W., Kaduchak, G. Ultrasonic particle-concentration for sheathless focusing of particles for analysis in a flow cytometer. Cytometry A. 69 (2), 66-74 (2006).
  15. Goddard, G. R., Sanders, C. K., Martin, J. C., Kaduchak, G., Graves, S. W. Analytical Performance of an Ultrasonic Particle Focusing Flow Cytometer. Anal Chem. 79 (22), 8740-8746 (2007).
  16. Goddard, G., Kaduchak, G. Ultrasonic particle concentration in a line-driven cylindrical tube. J Acoust Soc Am. 117 (6), 3440(2005).
  17. Lenshof, A., Magnusson, C., Laurell, T. Acoustofluidics 8: applications of acoustophoresis in continuous flow microsystems. Lab Chip. 12 (7), 1210-1223 (2012).
  18. Carugo, D., et al. A thin-reflector microfluidic resonator for continuous-flow concentration of microorganisms: a new approach to water quality analysis using acoustofluidics. Lab Chip. 14 (19), 3830-3842 (2014).
  19. Austin Suthanthiraraj, P. P., et al. One-dimensional acoustic standing waves in rectangular channels for flow cytometry. Methods. 57 (3), 259-271 (2012).
  20. Wiklund, M., Nilsson, S., Hertz, H. M. Ultrasonic trapping in capillaries for trace-amount biomedical analysis. J App Phys. 90 (1), 421(2001).
  21. Shields, C. W. IV, et al. Field-directed assembly of patchy anisotropic microparticles with defined shape. Soft Matter. 9 (38), 9219(2013).
  22. Yeom, J., Wu, Y., Selby, J. C., Shannon, M. A. Maximum achievable aspect ratio in deep reactive ion etching of silicon due to aspect ratio dependent transport and the microloading effect. J Vac Sci Technol B Microelectron Nanometer Struct Process Meas Phenom. 23 (6), 2319(2005).
  23. McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Acc Chem Res. 35 (7), 491-499 (2002).
  24. Golden, J. P., Justin, G. A., Nasir, M., Ligler, F. S. Hydrodynamic focusing--a versatile tool. Anal Bioanal Chem. 402 (1), 325-335 (2012).
  25. Hejazian, M., Li, W., Nguyen, N. T. Lab on a chip for continuous-flow magnetic cell separation. Lab Chip. 15 (4), 959-970 (2015).
  26. Shields, C. W. IV, Livingston, C. E., Yellen, B. B., Lòpez, G. P., Murdoch, D. M. Magnetographic array for the capture and enumeration of single cells and cell pairs. Biomicrofluidics. 8 (4), 041101(2014).
  27. Voldman, J. Electrical forces for microscale cell manipulation. Annu Rev Biomed Eng. 8, 425-454 (2006).
  28. Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab Chip. 9 (21), 3038-3046 (2009).
  29. Earnshaw, S. On the nature of the molecular forces which regulate the constitution of the luminferous ether. Trans Camb Phil Soc. 7, 97-112 (1842).
  30. Piyasena, M. E., Graves, S. W. The intersection of flow cytometry with microfluidics and microfabrication. Lab Chip. 14, 1044-1059 (2014).
  31. Grenvall, C., Antfolk, C., Bisgaard, C. Z., Laurell, T. Two-dimensional acoustic particle focusing enables sheathless chip Coulter counter with planar electrode configuration. Lab Chip. 14 (24), 4629-4637 (2014).
  32. Au, A. K., Lee, W., Folch, A. Mail-order microfluidics: evaluation of stereolithography for the production of microfluidic devices. Lab Chip. 14 (7), 1294-1301 (2014).
  33. Piyasena, M. E., et al. Multinode acoustic focusing for parallel flow cytometry. Anal Chem. 84 (4), 1831-1839 (2012).
  34. Lenshof, A., Evander, M., Laurell, T., Nilsson, J. Acoustofluidics 5: Building microfluidic acoustic resonators. Lab Chip. 12 (4), 684-695 (2012).
  35. Evander, M., Tenje, M. Microfluidic PMMA interfaces for rectangular glass capillaries. J Micromech Microeng. 24 (2), 027003(2014).

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Dispositivo acoustofluidicoenfoque de part culasfabricaci n de oblea de silicioproceso de fotolitograf agrabado i nico reactivo profundoprocedimiento de uni n an dicaintegraci n de transductor PZTensamblaje de placa de PDMSfuncionamiento de bomba de jeringa

Artículos relacionados