El órgano auditivo media la audición. En este trabajo presentamos un método modificado de microelectroporación in ovo optimizado para el estudio de la proliferación y diferenciación de células progenitoras auditivas en el órgano auditivo de pollo en desarrollo.
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Artículo de método
La transferencia de genes en el pollo auditiva de órgano de
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Resumen
Resumen
Embriones de pollo son sistemas modelo ideal para estudiar el desarrollo embrionario como manipulaciones de la función de genes pueden llevarse a cabo con relativa facilidad in ovo. El órgano sensorial auditivo del oído interno es fundamental para nuestra capacidad de oír. Alberga un epitelio sensorial altamente especializado que consiste en células ciliadas mecano-transducción (HC) y que rodea la glía como células de soporte (SCS). A pesar de las diferencias estructurales en los órganos auditivos, los mecanismos moleculares que regulan el desarrollo del órgano auditivo se conservan evolutivamente entre los mamíferos y aves En electroporación in ovo está muy limitado a las primeras etapas de E1 -. E3. Debido al desarrollo relativamente tarde del órgano auditivo en E5, manipulaciones del órgano de la audición por electroporación in ovo en el pasado E3 son difíciles debido al avanzado desarrollo del embrión de pollo en etapas posteriores. El método que aquí se presenta es un método de transferencia génica transitoria para dirigir genes de interés enetapa E4 - E4.5 en el auditorio de pollo en desarrollo a través de los órganos sensoriales in ovo micro-electroporación. Este método es aplicable para ganancia y la pérdida de funciones con vectores de expresión basados en el ADN de plásmido convencional y se puede combinar con en ensayo de proliferación celular in ovo mediante la adición de EdU (5-etinil-2 'desoxiuridina) a todo el embrión en el tiempo de electroporación. El uso de la proteína fluorescente verde o roja (GFP o RFP) plásmidos de expresión permite al experimentador para determinar rápidamente si la electroporación dirigido con éxito la porción auditiva del oído interno en desarrollo. En este trabajo el método, se ilustran ejemplos representativos de las muestras GFP a electroporación; embriones se recogieron 18 a 96 h después de la electroporación y la selección de GFP a la zona de pro-sensorial del órgano auditivo se confirmó mediante hibridación in situ de ARN. El papel método también proporciona un protocolo optimizado para el uso de la timidina analógico EdU para analizar prolife célularación; Se proporciona un ejemplo de un ensayo de proliferación celular basado EdU que combina inmuno-etiquetado y haga clic en la química edu.
Introducción
A pesar de las diferencias en la morfología celular y patrones entre los mamíferos y órgano sensorial auditivo aviar, se cree que están conservadas evolutivamente 1-3 los factores moleculares y las vías responsables del desarrollo de HC sensorial. La papila basilar, que aloja la HC auditivas y sus alrededores SC, se desarrolla como la protrusión de la otocyst oído interno. Al principio de un grupo de progenitores de HC y SC se especifica dentro de la placoda ótica / Dominio competente taza neuronal sensorial-ótica (NSD). Los datos de mapeado de destino proporcionan evidencia de que los linajes neuronales y sensoriales están vinculados y se derivan de la NSD situado en la región antero-ventral de la copa ótica o otocyst en ratones y pollos 4,5. En primer lugar, los neuroblastos delaminate de la NSD para dar lugar a las neuronas del ganglio auditivo-vestibular, que finalmente dividido en ganglios auditivo y vestibular. Estas neuronas inervan los HC sensoriales del oído interno y núcleos en el tronco cerebral. Las células Tha permanecer en el NSD se cree que dar lugar a varios parches sensoriales, incluido el órgano sensorial auditivo, que consta de los HC sensoriales mecano-transducción y sus asociados SCs.
En tanto el pollo y murino, órgano de la audición sensorial progenitora salida del ciclo celular y la diferenciación HC se producen en gradientes opuestos. En polluelo, la salida del ciclo celular progenitora auditiva comienza alrededor de ~ E5 y progresa desde la base hasta el vértice, y desde el centro hacia la periferia 6. Un día después, HC diferenciación comienza en el vértice y que avanza a la base 7. Estudiar el desarrollo del oído interno en el pollo proporciona muchas ventajas técnicas como mecanismos funcionales pueden ser investigados con relativa facilidad in ovo en comparación con la manipulación de los embriones en el útero en otros sistemas modelo, que requiere cirugías complejas. El método descrito aquí utiliza in ovo micro-electroporación para apuntar genes de interés en el Basila presuntivar área de la papila antero-ventral en la vesícula ótica específicamente a E4.
La electroporación in ovo es una técnica que está bien establecido y comúnmente utilizado 8-14. El principio de la técnica de electroporación se basa en el hecho de que los nucleótidos (por ejemplo, ADN plásmido, ADN sintético, o ARN oligonucleótidos) están cargadas negativamente. El ADN se inyecta en el tejido de interés. Cuando una corriente eléctrica se coloca a través del tejido, la corriente abre los poros transitorios en las paredes celulares y permite la captación del ADN, como fluye el ADN cargado negativamente hacia el electrodo positivo (ánodo). Para los experimentos de ganancia de función, los genes de interés se subclonan comúnmente en plásmidos de expresión que contienen casetes de expresión adecuados para la proteína verde fluorescente (GFP) o la proteína fluorescente roja (RFP). Para los experimentos de construcciones de pérdida de función basados en plásmidos dominantes negativos represores, o RNAi, o construcciones de morfolino son commonly utiliza 15,16. Para inhibir microARN (miARN) de función miRNAs construcciones de esponja, que son típicamente plásmido basado, se puede utilizar 17. El método aquí descrito permite la investigación de los mecanismos moleculares que controlan la proliferación y diferenciación en el órgano auditivo, como el método en micro-electroporación in ovo se puede combinar fácilmente con en ensayo de proliferación celular in ovo mediante la adición de EdU a todo el embrión.
La electroporación y la adición de EdU se realiza a E4 en la vesícula ótica, que es un día antes del inicio de la salida del ciclo celular en el órgano auditivo. Análisis del órgano de la audición se realiza típicamente 18 de - 96 horas después de la electroporación en E5 (inicio de la salida del ciclo celular progenitora sensorial), E6 (inicio de la diferenciación HC), y E7 (durante la diferenciación HC); y más tarde hasta ~ E9 (final de la diferenciación HC). Este método de electroporación de la transferencia genética es transitoria que dura aproximadamente ~ 4 días, because los genes de interés no se integran en el genoma, pero el método es aplicable para su uso con vectores de expresión basados en el ADN de plásmido apropiado, que tiene la capacidad de integrarse en el genoma, tales como la transferencia de genes mediada por Tol2 11. Con este método robusto GFP o RFP expresión dura ~ 4 días en la cóclea, después de lo cual las señales se desvanecen, sin embargo, proporcionan una ventana de tiempo suficiente para estudiar la intrincada desarrollo del órgano auditivo. Esto, a su método de transferencia génica in ovo es novedosa y permite apuntar específicamente el órgano auditivo presuntiva en E4, que es óptima para las investigaciones que se centran en el desarrollo de HC en el órgano auditivo. Es una buena adición a procedimientos alternativos, que electroporate en etapas de desarrollo mucho más jóvenes o 11,12 en comparación con el uso de cultivos de explantes in vitro papilas basilar 18.
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Protocolo
Los huevos no eclosionados y embriones son atendidos y tratados con ética y humanamente. Todos los protocolos para el uso de embriones sin eclosionar fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo en la Escuela de Medicina Johns Hopkins, Baltimore, Maryland.
1. Los huevos y la preparación de construcciones de expresión
- Huevos:
- Incubar 3 - 4 docenas de huevos de gallina fertilizados (Gallus gallus) acostado sobre sus lados a 37 ° C.
- Después de 24 horas de incubación, tirar de 3 cc de albúmina con una jeringa desde el extremo posterior redonda del huevo y sellar el agujero con cinta adhesiva transparente. Esto crea una cámara de aire entre el embrión y la cáscara del huevo, lo que permite la facilidad de acceso al embrión sin el embrión se adhiera a la shell cuando el corte de la ventana para el acceso en la parte superior del huevo 19.
- En 117 horas de tiempo de incubación, los embriones etapa de acuerdo con 20 etapas de desarrollo Hamburger y Hamiltonen E4 (HH24-25) (Ver Figura 1D).
- Incubar 3 - 4 docenas de huevos de gallina fertilizados (Gallus gallus) acostado sobre sus lados a 37 ° C.
- Construcciones de expresión:
- Preparar el DNA plásmido usando reactivos y el protocolo proporcionado por el fabricante de un kit de preparación disponible comercialmente. En la etapa final de preparación, eluir el ADN en 500 l de TE (Tris-EDTA) tampón proporcionado en el kit en un tubo de 1,5 ml.
- El etanol precipitar el ADN para concentrarla mediante la adición de 50 l de 3 M de acetato de sodio y 1 ml de etanol 100% al tubo. Se coloca el tubo a -20 ° CO / N.
- Centrifugar el tubo durante 30 min a 14.000 rpm a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y aire secar el sedimento durante 10 min a RT. Disolver el precipitado en 15 l de tampón TE, lo que debería dar una concentración de ~ 4 mg / l.
NOTA: El control de construcciones de expresión utilizados aquí son PME-IRES-GFP 10, que es impulsado por un promotor de pollo β-actina, o PCI-H2B-IRES-RFP 10, que es impulsado por el promotor CMV.
2. pollo in ovo Micro-electroporación in ovo y ensayo de proliferación celular
- En Ovo Microinyección de construcción de expresión y Micro-electroporación:
- Tire de los tubos capilares de vidrio en agujas finas usando un extractor de micropipeta con los siguientes parámetros optimizados para una 2,5 x 2,5 mm Box Platinum Calefacción Filament: Presión = 500, Heat = 600 ° C, Pull = 64, velocidad = 105, y la hora = 150 ms (ver Tabla 1).
- Establecieron la izquierda y etapas micromanipulador diestros que flanquean el microscopio (véase la Figura 1A). El micromanipulador Dretà sostiene la aguja capilar de vidrio y el micro-manipulador zurdos sostiene los electrodos (Figura 1A).
- Preparar la aguja capilar de vidrio finamente tirado por microinyección cortandola punta de la aguja con un fórceps durante el trabajo bajo el microscopio.
- Llene la aguja de forma manual a mano utilizando el micromanipulador con 2,5 l de ADN plásmido teñidas con 0,1% Fast Green mientras se trabaja bajo el microscopio.
- Colocar el huevo acostado de lado dentro de un dispositivo de retención de moldes / huevo (ver Figura 1A). Cortar una ventana redonda en la parte superior del huevo con unas tijeras 19 (Figura 1A).
- Mientras que trabajar bajo el microscopio, abra con cuidado las dos membranas superpuestas el embrión utilizando pinzas.
- Mientras que trabajar bajo el microscopio, entregar aproximadamente ~ 0,5 l de ADN plásmido a la derecha del lumen de la vesícula ótica por microinyección de forma manual utilizando la mano derecha utilizando el micro-manipulador y por micro-electroporación.
- Para ello, micro-inyectar el derecho lumen vesícula ótica con el ADN con la mano derecha micromanipulador (Figura 1B-D), mientras que al mismo tiempo usando la mano izquierda aguantandoga pinza de sostener la cabeza del embrión, porque la cabeza del embrión se sumerge en la etapa E4. No te micro-inyectar más allá del lumen de la vesícula ótica, ya que esto dañará la vesícula ótica.
- Inmediatamente después de la microinyección, mientras se trabaja bajo el microscopio, usar de la izquierda micro-manipulador para colocar el positivo (ánodo) 2 mm electrodo de platino anterior-ventral a la vesícula ótica derecho y el electrodo 2 mm negativo (cátodo) en paralelo 1 mm entre sí (véase la Figura 1 C). Entregar 4 pulsos a 12 V con 100 ms de duración y 200 mseg separación. La vesícula ótica izquierda sirve como un control no tratado interna.
NOTA: Limpie los electrodos en el medio electroporaciones con un bastoncillo de algodón empapado en 1x PBS.
- En Ovo ensayo de proliferación celular:
- Inmediatamente después de la electroporación se añaden 50 l de 0,25 mg / ml en 1 x PBS EdU dejando caer manualmente la solución EdU 50 l en el conjuntoembrión in ovo utilizando una pipeta. Sellar los huevos con la cinta y volver a la incubadora durante 18 a 96 hr.
- Retirar con cuidado la cinta y comprobar los embriones para GFP señal fluorescente o RFP dentro de la vesícula ótica después de 18 - 24 horas usando un microscopio fluorescente estándar (ver Figura 1 EE '). Si la señal fluorescente está presente, en este punto cosechar los embriones de los análisis o vuelva a sellar con cinta y devolverlo a la incubadora para la recolección y análisis en etapas posteriores (ver Figura 1 FP '').
NOTA: La expresión de GFP señal con la construcción PME-IRES-GFP es evidente 6 - 7 horas después de la electroporación 10.
3. La recolección de embriones y Procesamiento de tejidos para la ARN hibridación in situ e inmunohistoquímica
- Recoger los embriones utilizando fórceps. Enjuague el embrión en 1x PBS frío. Retire las cabezas de los embriones, cortando la cabeza por el cuelloel uso de fórceps, y colocar las cabezas en paraformaldehído al 4% O / N a 4 ° C. Perforar el cerebro utilizando una pinza para permitir la penetración de la paraformaldehído 4% dentro de la cabeza.
- Deshidratar las cabezas en sacarosa al 30% (en PBS 1x) O / N a 4 ° C.
- Montar las cabezas en medio crioprotector mediante congelación rápida en una suspensión de hielo seco y metilbutano (2-metilbutano). Por otra parte, la rápida congelación de las cabezas en medio crioprotector con nitrógeno líquido. Almacenar las cabezas montadas a -80 ° C.
- Cryosection las cabezas en 12 micras de espesor secciones de tejidos y recoger todas las secciones de tejido que contiene el oído interno-en portaobjetos de vidrio de microscopio superfrosted.
- Realizar RNA estándar de hibridación in situ e inmunohistoquímica, como se describe previamente 4,21, y analizar para la proliferación celular EdU siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante del kit.
NOTA: Las células ciliadas se pueden identificar usando policlonales de conejo α-myosinVIIA (MYO7A) unatibody (1: 1000, Proteus Biosciences) y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia (1: 250, de cabra anti-conejo AlexaFluor 488; Invitrogen).
4. Captura y Procesamiento
- Tomar imágenes con equipos de imagen digital. Resultados de inmunohistoquímica imagen con un microscopio de fluorescencia estándar y los resultados de la in situ usando un microscopio de campo amplio estándar (que van de 5x a 40x en aumento).
- Procesar las imágenes utilizando el software de procesamiento de imágenes.
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Resultados
En este ADN método de papel plásmido que consiste en proteína fluorescente verde (GFP) casetes de expresión fue el blanco en el pollo en desarrollo papila basilar (BP) con parámetros optimizados de 12 V y 4 pulsos con 100 duración de pulso mseg y los intervalos de 200 mseg, produciendo un ~ 50% de tasa de supervivencia de los embriones y la eficiencia de plásmidos de ADN de direccionamiento en el BP. De imagen fluorescente de la expresión de GFP nativa en el desarrollo de embriones mostr...
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Discusión
El método aquí descrito de in ovo micro-electroporación se ha optimizado para la transferencia de genes en el órgano auditivo en desarrollo. Es compatible con vectores de expresión basados en el ADN de plásmido normalmente se utilizan para manipular la función del gen / expresión. El momento de la electroporación a E4 es óptimo para las investigaciones que se centran en el desarrollo de HC en el órgano auditivo. Los pasos más críticos son micro-inyección de la DNA en el lumen vesícula ótica sin ir demasiado p...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Doris K. Wu de plásmidos de expresión y sondas in situ, el Centro de la Universidad Johns Hopkins para la instalación de imágenes Biología Sensorial y el Centro para la audición y el equilibrio. Este trabajo fue apoyado por NIDCD subvención T32 DC000023 de LE
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Estéril 1x PBS pH 7.4 | gibco | 10010-023 | |
| Fast Green FCF Powder | Sigma | F7252-5G | |
| EdU Powder | Invitrogen | E10187 | |
| Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit | Invitrogen | C10338 | |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) | Qiagen | 12643 | |
| ECM 830 ElectroSquarePorator | BTX Harvard Apparatus | ||
| Banana a Micrograbber Kit de cable | BTX Harvard Apparatus | 45-0216 | |
| Diestro & Micromanipuladores para zurdos | World Precision Instruments Inc. | M3301R & M3301L | |
| Dos etapas de dispositivo de sujeción magnética de 12 mm con postes verticales de 7 pulgadas | World Precision Instruments Inc. | M10 | |
| 12x24 pulgadas | World Precision Instruments Inc. | 5479 | |
| Tijeras para huevos curvadas de 12 cm de largo, hojas extrafinas de 12 mm; Tijeras de resorte | World Precision Instruments Inc. | 14120 | |
| Tirador de micropipetas para tirar de agujas | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Caja 2.5x2.5 mm Filamento Calefactor de Platino | Sutter Instrument Co. | ||
| Tubos capilares de vidrio/Agujas/Sin fibra/Borosil 1 mm | FHC | 27-30-0 | |
| Jeringa de vidrio Hamilton 100 μ l | Aceite mineral Hamilton | 80601 modelo 710LT | |
| (pesado) para la jeringa de vidrio Hamilton | Fisher Scientific | O122-1 | |
| Tubo de polietileno para conectar la jeringa de vidrio y las agujas cappilar de vidrio / no tóxico | Becton Dickinson and Company (BD) | 427420 Intramedic Clay Adams Brand | |
| 3 cc Jeringas desechables Becton | Dickinson and Company (BD) | 309657 | |
| Agujas desechables de calibre 21 | Becton Dickinson and Company (BD) | 305122 | |
| Un par de electrodos de platino de 2 mm | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY611P3-2 | |
| Portaelectrodos | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY580 | |
| Un par de pinzas finas Dumont número 5 | Fine Science Tools (FST) | ||
| Cinta invisible de acabado mate para sellar huevos | Office Depot | 520-928 | |
| Hisopos con punta de algodón | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| filtro estériles |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
