Method Article

Protocolo La autorradiografía de receptores para la visualización localizada de Receptores de la Angiotensina II

DOI:

10.3791/53866

⸱

June 7th, 2016

 ,  ,  , 
1Farquhar College of Arts and Sciences, Nova Southeastern University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Nova Southeastern University, 3School of Medicine, University of Colorado

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí presentamos un protocolo para describir la localización de los receptores de angiotensina II Tipo 1 en el cerebro de rata mediante autorradiografía cuantitativa, densitométrica e in vitro de receptores utilizando un análogo de angiotensina II marcado con yodo-125.

Abstract

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Este protocolo describe los patrones de unión al receptor de la angiotensina II (Ang II) en el cerebro de rata usando un radioligando específico para los receptores de Ang II para llevar a cabo el mapeo receptor autorradiográfica.

Las muestras de tejido se cosechan y se almacenaron a -80 ° C. Un criostato se utiliza para la sección coronal del tejido (cerebro) y el deshielo de montaje en las secciones sobre portaobjetos cargados. Las secciones de tejido de diapositivas montadas se incuban en 125 I-SI-Ang II a marcar radiactivamente los receptores de Ang II. Diapositivas adyacentes están separadas en dos conjuntos: "unión no específica '(NSP) en presencia de una concentración de saturación del receptor de no radiomarcado Ang II, o un AT 1 subtipo de receptor de Ang II (AT 1 R) antagonista selectivo del receptor de Ang II y 'unión total' sin AT 1 R antagonista. Una concentración de saturación de AT 2 subtipo de receptor de Ang II (AT 2 R) antagonista (PD123319, 10 M) también está presente en la incubatien tampón de limitar 125I-SI-Ang unión a la AT 1 R subtipo II. Durante un 30 min pre-incubación a ~ 22 ° C, las diapositivas de NSP están expuestos a 10 M PD123319 y losartan, mientras que "la unión total 'portaobjetos se expusieron a 10 mM PD123319. Los portaobjetos se incubaron después con 125 I-SI-Ang II en presencia de PD123319 de 'la unión total', y PD123319 y losartán para NSP en tampón de ensayo, seguido por varios lavados '' en tampón, y agua para eliminar la sal y la no radioligando específicamente unido. Los portaobjetos se secan con secadores, luego se expuso a una película de autorradiografía usando una película especializado y casete. La película se desarrolla y las imágenes se escanea en un ordenador para densitometría visual y cuantitativa usando un sistema de imagen propia y una hoja de cálculo. Un conjunto adicional de diapositivas están teñidas con tionina para las comparaciones histológicos.

La ventaja de utilizar autorradiografía del receptor es la capacidad de visualizarAng II receptores in situ, dentro de una sección de una muestra de tejido, y anatómicamente identificar la región del tejido comparándola con una sección de referencia histológico adyacente.

Introduction

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La enfermedad cardiovascular sigue siendo la principal causa de muerte y discapacidad en los Estados Unidos, causando más de un 30% de las muertes en los EE.UU. en 2011 1. Las estadísticas más recientes de la American Heart Association indican que más de una de cada tres personas tiene uno o más tipo de enfermedad cardiovascular. la investigación cardiovascular sigue haciendo avances contra la comprensión de esta enfermedad, pero a medida que las generaciones comienzan envejecer es imprescindible para continuar estos esfuerzos. El sistema renina-angiotensina (RAS) desempeña un papel central en la regulación del sistema cardiovascular principalmente mediante la promoción de la aterosclerosis, la inflamación, la vasoconstricción sistémica y la activación del sistema nervioso simpático (Figura 1) 2-8.

El RAS es un sistema hormonal que se activa cuando las células yuxtaglomerulares del riñón secretan renina en el torrente sanguíneo en respuesta a la disminución de la presión arterial, aumento de sympatestimulación hetic o disminución del flujo de sodio por la mácula densa. La renina metaboliza angiotensinógeno (sintetizado en el hígado) para formar la angiotensina I (Ang I). a continuación, Ang I es metabolizada por la enzima convertidora de angiotensina (ACE), un ectoenzyme en el lado luminal de las células endoteliales vasculares, principalmente en los pulmones y riñones, para formar angiotensina II (Ang II), el principal péptido efector de la RAS. Ang II es capaz de activar dos subtipos de receptores; el receptor de tipo 1 (AT 1 R) y el receptor de tipo 2 (AT 2 R), tanto que regulan el sistema cardiovascular, mantener la homeostasis de líquidos y electrolitos y ahora se consideran para afectar la función cognitiva y enfermedades neurodegenerativas procesos de 8,9. A RAS local específica del cerebro se informó de sintetizar de forma independiente Ang II. En el cerebro, el angiotensinógeno proteína precursora se sintetiza en astroglia 10 convertido a Ang I por una enzima 3 renina-como, posiblemente prorrenina unido al receptor prorrenina11, y posteriormente convertida a Ang II por la enzima convertidora de la angiotensina que se expresa abundantemente en la superficie extracelular de las neuronas en el cerebro 12. Este intrabrain generada Ang II es el agonista para el cerebro AT1 y 2 receptores que están aislados de transmisión sanguínea Ang II.

Mientras que el AT 1 R juega un papel fisiológico importante, es mejor conocida por sus efectos fisiopatológicos en todo el cuerpo, que afecta principalmente al sistema cardiovascular y los riñones (Figura 2). Cuando Ang II se une a la AT 1 R, que causa vasoconstricción; aumento de la resistencia al flujo de la sangre y el aumento de la presión arterial. También promueve la síntesis y secreción de aldosterona y vasopresina, lo que aumenta la retención de sodio y agua. Estos efectos también pueden inducir daño cerebral isquémico y deterioros cognitivos y está relacionado con la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, y Diabetes, además de ser identificado recientemente a afectar el aprendizaje y la memoria 13 a 15. Hay un bucle de retroalimentación en el RAS en que AT 1 R sobre las células yuxtaglomerulares en el riñón inhibe la secreción de renina. Curiosamente, el AT 2 R generalmente contra-regula la acción de AT 1 R, causando vasodilatación, el crecimiento de neuritas, la regeneración axonal, anti-proliferación, y cerebroprotection entre muchos otros 16-20. El AT 2 R también ha sido identificado como un objetivo para anti-hipertensión y recientemente, fármacos contra el cáncer 21. La determinación de la localización y la densidad de los receptores de Ang II en diversos tejidos y la forma en que se ven afectados por diversos tratamientos y estados de enfermedad utilizando autorradiografía cuantitativa del receptor densitométrico ayudará a descubrir el papel del SRA juega en enfermedades específicas.

autorradiografía del receptor se ha utilizado durante más de 30 años como un método eficaz para indicar la presencia de angiotensina II receptores y otros componentes de las RAS en el cerebro y otros tejidos de la rata, ratón, cobaya, perro y humano bajo una variedad de condiciones experimentales 22-34. La importancia de la localización de los receptores de Ang II dentro del cerebro es que se puede aplicar la neuroanatomía funcional a las acciones de Ang II en el cerebro, por ejemplo, la presencia de AT 1 R en el núcleo paraventricular del hipotálamo (PVN) sugiere una función de Ang II en el cerebro para estimular la vasopresina, oxitocina o la liberación de la hormona liberadora de corticotropina (CRH), o la activación del sistema nervioso simpático. Por lo tanto, los fármacos que bloquean el AT 1 R podrían disminuir algunos de estos efectos mediados por PVN asociados con respecto a la actividad de los RAS cerebrales. Trabajo en curso sugiere que el uso de antagonistas AT 1 R puede disminuir postraumático Trastorno de estrés (TEPT) inducida por la liberación de CRH y mejorar los síntomas de trastorno de estrés postraumático (Hurt et al., Presentado para su publicación). El PVN, subfornicalórgano (OFS), y la amígdala son conocidos por regulación de la homeostasis, el apetito / sed, sueño, la memoria, las reacciones emocionales, y son las áreas objetivo de este estudio de demostración. Estas regiones se examinaron mediante la recopilación de secciones coronales de un cerebro en portaobjetos de microscopio, y el tratamiento de las secciones con inhibidores específicos junto con un radioligando específico para los receptores de Ang II. En este estudio, todos los materiales y reactivos, junto con los vendedores sugeridas están en la lista, yodo-125 se usó para radiomarcar un antagonista de Ang II receptor, sarcosina 1, isoleucina 8 Ang II (SI Ang II), que luego se purificó como el mono 125 I -SI Ang II usando métodos de HPLC como se describió anteriormente 35. El uso de esta alta actividad específica de radioligando permite la visualización de áreas de densidad baja, moderada y alta receptor después de la exposición de las secciones radiomarcados a película de rayos x. Al calibrar la película con las normas de pasta cerebrales que contienen cantidades conocidas de yodo-125, la cantidad específicade la unión en un área de receptores de angiotensina II puede ser cuantificado. En estudios experimentales, la unión en los cerebros de sujetos experimentales receptor de Ang II puede ser comparada a la de los cerebros de los sujetos control. Esto puede indicar si las acciones de Ang II se alteran en respuesta a una condición genética, anormalidad fenotípica, estado de la enfermedad o el tratamiento de drogas. Este conocimiento puede ser aplicado al desarrollo de terapias para tratar enfermedades asociadas con la desregulación de la RAS. Las técnicas alternativas que identifican los sitios de unión al receptor, pero con reducida resolución anatómica, son ensayos que utilizan preparaciones de membrana de tejido derivados de homogeneizados de tejido, que son incubados con el radioligando en un intervalo de concentraciones para evaluar la afinidad de unión de radioligando como la constante de disociación (K D vinculantes ) y capacidad de unión máxima (Bmax) del tejido de interés.

El protocolo descrito aquí puede ser dividido en 5 grandes components: Preparación de secciones de tejido de los receptores de autorradiografía; La autorradiografía del receptor; Exposición de la película y el Desarrollo; Histología; y Análisis de Imágenes densitométrico.

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Protocol

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Todos los animales procedimientos llevados a cabo para este estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Nova Southeastern de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, 8ª edición (The National Academies Press, Washington, DC, 2011 ).

1. Preparación de secciones de tejido de los receptores de autorradiografía

  1. Después del sacrificio, la cosecha tejidos cerebrales frescas, y se envuelven en papel de aluminio y colocar en un congelador a -20ºC tan pronto como sea posible. Para mantener la forma correcta, colocar en un molde cerebro cerebro que simula el interior del cráneo, envolver en papel de aluminio y colocar en un - 20 ° C congelador. Después de 30 minutos, colocar los tejidos en una bolsa de almacenamiento en el congelador se puede sellar y se mueven a un congelador -80 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
    1. Obtener una muestra de tejido fresco congelado de interés de la descongelación del congelador -80 ° C, y la transferencia a un criostato se establece en un mínimo de -10 ° C y una máxima de 18 ° C, para evitar.
    2. Colocar la muestra sobre el tejido se montan con un glicol y medio de inclusión a base de resina, solamente la incorporación de una pequeña parte de la muestra en el medio. Para el cerebro, el cerebro está montado verticalmente para permitir el corte en el plano coronal.
  2. , El soporte para el tejido en el microtomo dentro del criostato y apretar firmemente en su lugar. Asegúrese de que el lado izquierdo y derecho del cerebro se encuentran en las mismas coordenadas antero-posterior y que el eje dorso-ventral es atlas del cerebro perpendicular al uso común.
  3. Comenzar a cortar en el espesor deseado (20 micras recomendado) y descongelar montar las secciones en portaobjetos de microscopio en una dirección vertical a tener una mayor área de superficie de espacio en la diapositiva. Recoger las secciones sobre portaobjetos en series secuenciales de cinco, es decir, el primer conjunto de diapositivas están etiquetados 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, y 1-5 ​​(Figura 3).
  4. Después de llenar una serie de diapositivas con las secciones, permiten que las diapositivas se sequen al aire para un máximo de 1 hora, a continuación, colocar el SLIdes en una caja de plástico de diapositivas en una bolsa de almacenamiento en el congelador de auto-sellado, y se almacena a -20 ° C.

2. Receptor autorradiografía

PRECAUCIÓN: La radiactividad. Usar vestimenta protectora para manejar la radiactividad. Eliminación se dependía de la creación, y debe seguir las directrices de la corrupción correctamente (vida media de 60 días) o ser recogido por una empresa certificada.

  1. Retire las diapositivas "-1" y "-2" de interés desde el congelador a -20ºC y montar en sujeciones de filtro (Figura 5). Montar las diapositivas "-1" en conjunto para el tratamiento "no específica", y los "-2" se desliza para el tratamiento "total". Tarros 'no específicos' contendrán 10 mM finales concentraciones de PD123319 un AT 2 antagonista de R, y losartán un AT 1 antagonista de R, en tampón medio de ensayo (AM5) (Tabla 1), el "total" tarros de unión contendrán solamente 10 M PD123319 en AM5.
  2. Invertir la diapositivapinzamientos para Colocar los portaobjetos en los frascos de Coplin pre-incubación llenos de 35 a 40 ml de AM5, e inhibidores respectivos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Iniciar juegos posteriores en su baño de pre-incubación a intervalos de 4 min.
  3. Transferir inmediatamente los portaobjetos de la solución de incubación pre a los anuncios publicitarios de la incubación de diapositivas, que contiene 10 ml de AM5, además de una concentración predeterminada de 125 I-SI-Ang II (calculado en la Figura 4) con los inhibidores respectivos, por 60 a 90 min en la sala temperatura. Si hay suficiente radioligando, 10 muestras se pueden colocar (espalda contra espalda) en sujeciones de filtro modificados y se incubaron con 125I-SI-Ang II en frascos de Coplin.
  4. Colocar los portaobjetos de nuevo en las sujeciones de filtro (si es necesario), mancha, y enjuagar suavemente por arremolinándose por 1-2 seg en 400 ml de agua destilada en dos recipientes separados.
  5. Transferir los portaobjetos secuencialmente en cuatro jarras Coplin que contienen 35-40 ml de AM5 por exactamente 1 min cada uno (como se ilustra en la Figura 4 </ Strong>).
  6. Después del último enjuague 1 min, agitar suavemente las secciones de 1-2 segundos en cuatro cambios de agua destilada enfriada con hielo.
  7. Seque los portaobjetos con aire frío (Precaución: el aire caliente se volatiliza el compuesto radiactivo) utilizando cuatro secador de pelo creados desde diferentes ángulos de 4 minutos (Figura 5), hasta que todas las secciones estén secas, a continuación, colocar sobre una toalla de papel.
  8. Monte desliza hacia arriba con los tejidos en un cartón para la aposición a película de rayos X usando cinta de doble cara.
  9. Monte al menos uno, 125 de calibración de yodo de diapositivas estándar en cada uno de cartón (Figura 6).
    Nota: Los estándares de calibración consisten en pasta de cerebro mezclado a fondo con 125 yodo unido a un compuesto que contiene un anillo de fenol, compactado por centrifugación en una jeringa de tuberculina de 1 ml, que son criostato seccionada en el mismo grosor que las secciones de cerebro y descongelar montados en microscopio diapositivas. Alternativamente, 125 patrones de calibración I enresina de plástico se seccionaron a 20 micras de espesor se puede obtener comercialmente. La resina de plástico en estas normas protege parcialmente la película de la radiación de tal manera que una equivalencia de tejido de ~ 40% debe tenerse en cuenta en la calibración.

3. Exposición y Desarrollo de Cine

  1. Proceder a un cuarto oscuro con una placa de rayos X de la correa de recogida y autorradiografía película. Abra el casete y colocar el cartón con desliza en el interior (Figura 6).
    1. Apagar las luces y encender la luz de seguridad. Abra cuidadosamente la caja de la película X-Ray, retire una película, y colocar el lado brillante película de arriba (con el borde dentado en la esquina inferior derecha) en la parte superior de las diapositivas de la casete. Cierre cuidadosamente el casete, y girar las barras de cierre para sellar la luz (Figura 6). Exponer las diapositivas de varios días a varias semanas a -20 ° C.
  2. En el cuarto oscuro, abrir el cassette y proceder con el desarrollo de la película process.
    1. Colocar los portaobjetos en las bandejas de forma consecutiva; desarrollador de 2 min, en agua que contiene 5% de ácido acético glacial durante 30 segundos, y el fijador de 5 min. Las películas se la coloca en una bandeja con agua corriente durante 20 minutos, después se colocan en Photoflo por no más de 10 seg y se cuelgan.
      Nota: El tiempo de exposición se determina empíricamente y puede implicar múltiples películas con diferentes tiempos de exposición: el tiempo suficiente para obtener señales medibles de las zonas con baja unión, pero no tan largo como para saturar la película de áreas con alta unión. Una vez que se obtienen las exposiciones aceptables, a continuación, proceder al siguiente paso.

4. Histología

  1. Preparar la mancha tionina y reactivos de tinción (Tabla 2, Figura 7).
    1. Colocar los portaobjetos "-3" en el bastidor deslizante, y la transferencia en orden secuencial comenzando con agua desionizada durante 1 min, a continuación, tionina solución de tinción durante 10 minutos seguido de tres sumerge en deionaguas zados, y un lavado de 30 segundos en agua desionizada.
    2. Tras el agua, coloque la parrilla corrediza en lavados de etanol de la siguiente manera; 50%, 70% y 90% durante 30 segundos, seguido de dos lavados con etanol al 100% durante 1 min cada uno. Por último, colocar la parrilla corrediza en xileno durante 3 min, luego transferir a una segunda solución de xileno durante 5 min.
  2. Retire una diapositiva a la vez desde el último baño de xileno, y cubrir el borde superior de la diapositiva con una base de resina en medio de montaje disolvente orgánico, y colocar una 24 mm x 60 mm cubreobjetos sobre el portaobjetos. Permitir que se desliza a lo suficientemente seco para ~ 48 horas y luego escanear en el equipo a 2.400 dpi en escala de grises.

5. Análisis de Imágenes Densitométricas

  1. Coloque el lado brillante película hacia abajo, con el borde dentado en la esquina inferior izquierda y escanear con un escáner patentada capaz de transmitir la información de densidad de la película sin ningún tipo de distorsión en el ordenador del sistema de formación de imágenes.
  2. Abra el archivo sys exposición patentadaTEM y utilizar las barras de calibración para establecer patrones de calibración para el análisis densitométrico futuro de las imágenes de la película (Figuras 9 - 12).
  3. medir áreas de interés, ya sea estableciendo una plantilla o empíricamente describiendo las áreas de interés. Los datos se recogieron y se separó el basado en la película, ya sea de control o de tipo salvaje (sección), y la región. Asegúrese de incluir la densidad (fmol / g), área de lectura, y el área total proyectada en las mediciones (Figura 9).
    1. Ajuste bares área de escaneo, asegurando que la región de interés se encuentra entre los parámetros de relieve (Figura 10).
    2. Exportar datos en una hoja de cálculo (Tabla 4). Multiplicar los tiempos densidad del área total del objetivo, y se divide por el área de escaneado con el fin de obtener el valor de la unión de esa área específica. Una vez que esto se hace para todos los valores medidos, el sustrato La no específica establecida de total para dar el p de unión específicaresentirse de. Promedios también pueden llevarse a cabo para estos valores.

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Results

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La visión general de la vía metabólica del sistema renina-angiotensina se muestra en la Figura 1 y el enfoque directo sobre los subtipos de receptores de la angiotensina II (AT 1 R y AT 2 R) se describe en la Figura 2. La Figura 3 muestra la transferencia de cerebro coronal secciones en portaobjetos de microscopio, que luego se ejecutan a través de un procedimiento de autorradiografía del receptor usando una concent...

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Discussion

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El protocolo descrito identifica la visualización de "total" y "no específica" de unión del radioligando en las secciones adyacentes de las secciones coronal de un cerebro de roedores previamente cosechado y almacenado a -80 ° C, y puede ser fácilmente aplicable a prácticamente todos los tejidos que ha resuelto anatómicamente subestructuras que muestran cantidades diferenciales de los receptores o sitios de unión de radioligando. Los procedimientos descritos en el protocolo son simples y el análisis ...

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Disclosures

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Robert Speth ha licenciado anticuerpos contra los receptores de angiotensina II a un proveedor comercial y recibe regalías por la venta de dichos anticuerpos. Los otros autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

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Este trabajo fue apoyado por la subvención HL-113905 de los NIH

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
500 ml Vasos de PlásticoFisher02-591-30
24 mm x 60 mm CubreobjetosFisher22-050-25
Película de imagen de autorradiografía 24 mm x 30 cmCarestream-Biomax Película MR891-2560
Bacitracina (de Bacillus licheniformis)SigmaB-0125
Hoja de cartón 8 x 11Crescent Tablero de ilustración #201201
Frascos CoplinFisher ScientificE94
Secadores de pelo comercialesConairModelo SD6X
Tubos de cultivo desechablesFisher14-961-26
EDTA (sal disódica, dihidratada)USB Corporation15-699
EtanolFisher16-100-210 
Sustituto del formulario para el formulario D-19 DeveloperPhotographers, Inc. 01-0036
Ácido Acético GlacialFisherA38 SI-212
Histoprep/OCTFisherSH75-125D
Fijador de películaKodak5160320
Photo floKodak1464502
LosartanFisher/Tocris37-985-0
MCID™ Core 7.0MCIDN/A
NaClFisherS271
Pelar a la vía PortaobjetosVWR48440-003
PermountFisherSP15-100
PD123319Fisher13-615-0
Portaobjetos cargados de primera calidad,portaobjetos de microscopio Premiere de borde rectificado fino9308W
125I LigandosPerkin ElmerNEX- 248
125SI-Ang II Universidad George WashingtonRadioyodado por el Dr. Speth
Slide MailersFisher ScientificHS15986
Fosfato dibásico de sodio anhidro (Na2PO4)FisherRDCS0750500
Acetato de sodio (anhidro)FisherBP333-500
Thionin FisherT409-25
Casette de rayos X (10 x 12)Spectronics CorporationFour Square
XyleneFisher X3P-1GAL

References

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