Conversión epigenética como un método seguro y simple para obtener células secretoras de insulina a partir de fibroblastos de la piel de adultos

Summary

Aquí, se presenta un nuevo método que permite la conversión de fibroblastos adultos de la piel en células secretoras de insulina. Esta técnica se basa en la conversión epigenética, no implica el uso de vectores retrovirales ni la adquisición de un estado pluripotente estable. Por lo tanto, es muy prometedor para aplicaciones de medicina traslacional.

Abstract

La medicina regenerativa requiere células nuevas y completamente funcionales que se entregan a los pacientes para reparar los tejidos degenerados o dañados. Cuando estas células no están fácilmente disponibles, pueden obtenerse utilizando diferentes enfoques que incluyen, entre los muchos, la reprogramación y la transdiferenciación, con ventajas y limitaciones que son específicas de las diferentes técnicas. Aquí se describe una nueva estrategia para la conversión de un fibroblasto maduro adulto en una célula secretora de insulina, designada arbitrariamente como células epigenéticas convertidas (EpiCC). El método se ha desarrollado sobre la base de la creciente comprensión de los mecanismos que controlan la regulación epigenética del destino y la diferenciación celular. En particular, el primer paso utiliza un modificador epigenético, a saber, la 5-aza-citidina, para llevar a las células adultas a un estado "altamente permisivo". A continuación, aprovecha esta breve y reversible ventana de plasticidad epigenética para redirigir las células hacia un linaje diferente. El enfoque se denomina "conversión celular epigenética". Es una forma sencilla y robusta de obtener un conmutador interlinaje celular eficiente, controlado y estable. Dado que el protocolo no implica el uso de ninguna transfección de genes, está libre de vectores virales y no implica un estado pluripotente estable, es muy prometedor para aplicaciones de medicina traslacional.

Introduction

Un objetivo fundamental de la medicina regenerativa es la generación de células nuevas y funcionales que se pueden utilizar para reparar o reemplazar dañado, degenerado tejidos. Rehacer células adultas fácilmente disponibles en otros nuevos, mediante la conversión de un tipo de célula a otra, es un enfoque particularmente atractivo, especialmente cuando la población de células requerido no es abundante o de difícil acceso. Sin embargo, las células adultas son extraordinariamente estables. Adquieren su estado diferenciado a través de una restricción gradual en sus opciones y, una vez que lleguen a la terminal de especialización madura, que se retengan de manera establ....

Protocol

Nota: Todos los procedimientos descritos a continuación deben realizarse bajo campana de flujo laminar en condiciones estériles. Asegúrese de que todos los procedimientos de cultivo se llevan a cabo en etapas termostáticas y las células se mantienen a 37 ° C en toda su manejo.

1. Aislamiento de fibroblastos de la piel

1. Preparar Cultura Solución de revestimiento del plato
   1. Disolver 0,1 g de gelatina porcina en 100 ml de agua (concentración final 0,1%). Esterilizar la solución con autoclave.
   2. Añadir 1,5 ml de gelatina porcina estéril 0,1% a 35 mm placas de Petri. Esperar 2 horas para revestir, manteniéndolas a temperatura ambiente.

Results

Establecimiento de cultivo primario a partir de biopsias de la piel
Las biopsias de piel se cortaron en fragmentos pequeños y se colocan en platos de gelatina pre-revestidas. Después de 6 días, los fibroblastos empezaron a crecer fuera de los fragmentos de tejido y formaron una monocapa de células (Figura 1A). Las células mostraron una típica forma alargada y, como se esperaba, mostraron una inmune-positividad uniforme para el fibroblasto vimentina marcador específi.......

Discussion

El presente manuscrito describe un método que permite la conversión de fibroblastos de piel humana en células productoras de insulina, a través de una exposición transitoria y breve a 5-aza-CR, seguido de un protocolo de inducción específica de tejido. Este enfoque permite un interruptor del mesodermo a las células relacionadas con endodermo, sin la expresión forzada de factores de transcripción o microRNAs ni la adquisición de un estado pluripotente estable, que hace que las células más inestable y propenso a errores <.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco	Sigma	D5652	PBS; para el lavado celular y la preparación de soluciones
Solución antibiótica antimicótica	Sigma	A5955	Componente de fibroblastos, HP y medios pancreáticos
Placa de Petri de 100 mm	Sarstedt	83.3902	Para el aislamiento de fibroblastos
Gelatina porcina	Sigma	G1890	Para el recubrimiento de platos
Water	Sigma	W3500	Para la preparación de soluciones
Placas de Petri de 35 mm	Sarstedt	83.39	Para el aislamiento de fibroblastos
DMEM, glucosa alta, piruvato	Life Technologies	41966052	Para medio de cultivo de fibroblastos
Suero fetal bovino	Life Technologies 10500064		FBS; Componente de fibroblastos y medios HP
Solución de L-glutamina	Sigma	G7513	Componente de fibroblastos, HP y medios pancreáticos
Solución de tripsina-EDTA	Sigma	T3924	para la disociación de fibroblastos
KOVA GLASSTIC SLIDE 10 CON REJILLAS	Hycor Biomedical	87144	Recuento
de células 5-Azacitidina	Sigma	A2385	5-aza-CR, para células crécreas Plasticidad en fibroblastos
Mezcla de nutrientes F-10	Life Technologies	31550031	para medio HP
DMEM, glucosa baja, piruvato	Life Technologies	31885023	para medio HP
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828028	componente de la
solución de aminoácidos no esenciales MEM	Life Technologies	11140035	Componente de HP y medios basales pancreáticos
2-Mercaptoetanol		Sigma M7522	Componente de HP y medios basales pancreáticos
Guanosina	Sigma	G6264	Componente de stock de mezcla de nucleósidos del medio HP
Adenosina	Sigma	A4036	Componente de stock de mezcla de nucleósidos del medio HP
Cytidine	Sigma	C4654	Componente de stock de mezcla de nucleósidos del medio HP
Uridine	Sigma	U3003	Mezcla de nucleósidos componente de stock de medio HP
Thymidine	Sigma	T1895	Mezcla de nucleósidos componente de stock de medio HP
Millex-GS 0,22 & m	Millipore	SLGS033SB	Para la esterilización de la solución
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein	Life Technologies	PHG0261	bFGF; Componente del medio basal HP y pancreático
Albúmina sérica bovina Sigma		A3311	BSA; Componente del medio basal pancreático
DMEM/F-12	Life Technologies	11320074	para medio basal pancreático
B-27 Suplemento Menos Vitamina A	Life Technologies	12587010	Componente del medio pancreático
N-2 Suplemento	Technologies	17502048	componente del medio basal pancreático
Activina A Proteína humana recombinante	Technologies	PHG9014	Para el medio pancreático
Ácido retinoico	Sigma	R2625	Para el medio pancreático
Dimetilsulfóxido	Sigma	D2650	DMSO; para la preparación de caldos de ácido retinoico
Insulina-Transferrina-Selenio	Life Technologies	41400045	ITS; para el medio final pancreático
Anticuerpo anti-Vimentina	Abcam	ab8069	Para análisis inmunocitoquímicos. Dilución de trabajo 1:100
4′,6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato	Sigma	32670	DAPI. Para análisis inmunocitoquímicos. Dilución de trabajo  1 y micro; g/ml
5-Metilcitidina	Eurogentec	MMS-900P-B	Para análisis inmunocitoquímicos. Dilución de trabajo 1:500
Anticuerpo de péptido anti-C	Abcam	ab14181	Para análisis inmunocitoquímicos. Dilución de trabajo 1:100
Anticuerpo anti-PDX1	Abcam	ab47267	Para análisis inmunocitoquímicos. Dilución de trabajo 1:500
Mercodia Insulina ELISA	Mercodia	10-1113-10	Para la detección de liberación de insulina