De imagen confocal de medición de las fluctuaciones de calcio en el retículo sarcoplásmico de células musculares lisas cultivadas Uso de FRET a base de

Summary

Actualmente, la mayoría de los indicadores de calcio disponibles se utilizan para cuantificar los transitorios de calcio citoplasmático como medidas indirectas del calcio liberado del retículo sarcoplásmico en células de músculo liso cultivadas. Este protocolo describe el uso de un indicador específico basado en FRET que permite la medición directa de las señales de calcio dentro de la luz del retículo sarcoplásmico.

Abstract

El mantenimiento de los niveles de calcio (^Ca2+) en estado estacionario en el retículo sarcoplásmico (SR) de las células del músculo liso vascular (VSMCs) es vital para su salud general. Una parte significativa del contenido intracelular de Ca²⁺ se encuentra dentro de las reservas de SR en los VSMC. Como el único orgánulo intracelular con una asociación cercana con el espacio extracelular circundante a través de las uniones membrana plasmática-SR, se puede considerar que el SR constituye la primera línea de respuesta a cualquier irregularidad en los transitorios de Ca²⁺ o estrés experimentado por la célula. Entre sus muchas funciones, una de las más importantes es su papel en la transmisión de señales reguladas por Ca²⁺ a través de la célula para inducir más reacciones posteriores en toda la célula. El uso más común de los indicadores citoplasmáticos de Ca²⁺ en este sentido es en general insuficiente para la investigación de los cambios altamente dinámicos en el almacenamiento intraluminal de Ca²⁺ SR que aún no se han caracterizado completamente. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para la medición directa y clara de luminal SR^{Ca 2+}. Esta herramienta es útil para la investigación de los cambios matizados en SR Ca²⁺ que tienen efectos posteriores significativos en la función normal y la salud de la célula. Las fluctuaciones en el contenido de SR Ca²⁺ específicamente pueden proporcionarnos una cantidad significativa de información relacionada con las respuestas celulares a las enfermedades o condiciones de estrés experimentadas por la célula. En este método, se utiliza una versión modificada de un indicador de Ca²⁺ dirigido a SR, D1SR, para detectar fluctuaciones de Ca²⁺ en respuesta a la introducción de agentes en células de músculo liso aórtico (SMC) cultivadas en ratas. Después de la incubación con el indicador D1SR, se utilizan microscopía de fluorescencia confocal e imágenes basadas en la transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) para observar directamente los cambios en los niveles intraluminales de SR^{Ca 2+} en condiciones de control y con la adición de agentes agonistas que funcionan para inducir el movimiento intracelular de Ca²⁺.

Introduction

Ca ^{2 +} es un ion muy importante que se encuentra en abundancia dentro de cada célula en el cuerpo. Tiene un papel importante en muchos diferentes funciones celulares, incluyendo el crecimiento, la proliferación, la migración y apoptosis ^1-4. Está bien establecido que el Ca ²⁺ puede afectar a estos procesos a través de ambas acciones directas e indirectas, y por lo tanto, los cambios en las concentraciones intracelulares normales de este ion puede dar lugar fácilmente a resultados negativos para las células afectadas. La SR se considera como el más grande ²⁺ tienda intracelular de Ca en la célula ^5. Niveles de est....

Protocol

declaración de la ética: Todos los experimentos y los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de Bioseguridad en el Laboratorio de la Universidad de British Columbia, Vancouver, Canadá.

1. Preparación de placas de cultivo de 35 mm con fondo de cristal para Microscopía Confocal basados ​​en FRET

1. Preparar las placas mediante el siguiente procedimiento hr 36-48 antes de los experimentos.
2. Recuperar mezcla de proteína gelatinosa elegido y 0,25% de tripsina-EDTA de -20 ° C de almacenamiento y mantenerlos en baño de hielo hasta su uso móvil.
   NOTA: La mezcla de proteína de recubrimiento sólo debe ser expuesto a la ....

Results

Esta sección proporciona ejemplos de los resultados que se pueden obtener mediante el método descrito para capturar Ca ²⁺ datos de concentración luminal SR, en comparación con la forma comúnmente empleado para medir indirectamente cambios a orgánulos Ca ²⁺ concentraciones de tienda mediante la observación de las fluctuaciones en citoplasmática ^de Ca2 ⁺ .

La Figura 1A.......

Discussion

Este protocolo describe la transfección de CMLV con el adenovirus D1SR para estudiar las concentraciones de ^{Ca2 +} en el lumen de la SR. Este método permite la medición directa de Ca ²⁺ dentro de este orgánulo, así como su movimiento en / fuera de la SR como resultado de la aplicación de diferentes agentes de calcio en movimiento. Este método tiene muchas ventajas para los investigadores que trabajan hacia una comprensión global de cómo los cambios en los niveles de SR y citoplásmicos Ca ²⁺

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (alta glucosa, piruvato)	Life technologies	11995-065	Warm in 37 ° C Baño de agua antes de usar
Matrigel Membrana Basal Matriz Factor de Crecimiento Reducido, 5 ml	Corning	356230	Mantener a -20 ° C hasta justo antes de usar
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20 ° C hasta justo antes
de usar placas con fondo de vidrio de 35 mm	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 ml 0.2 μ Matraz de tapón con tapón de sellado azul ventilado	BD Falcon	353136
Tripsina/EDTA Soluciones	Tecnologías de vida	25200056	Mantener a -20 & grados; C hasta justo antes de usar
50 ml Tubo cónico de polipropileno	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Regalo
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Mantener a -20 ° C hasta justo antes
de usar 1,5 ml Tubos de microcentrífuga negros	Argos Technologies	T7100BK
Microscopio confocal Leica TCS SP5	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (con aplicación FRET SE Wizard)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.