Presentamos métodos para la construcción de electrodos que registren simultáneamente la actividad neuronal extracelular y liberen múltiples sustancias neuroactivas en las proximidades de los sitios de registro en ratones despiertos. Esta técnica permite el análisis detallado de las entradas sinápticas locales putativas a la neurona de interés.
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Artículo de método
Extracelular de grabación de la actividad neuronal junto con la aplicación de sustancias Microiontophoretic neuroactivos en ratones Awake
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Resumen
Resumen
Las diferencias en la actividad de los neurotransmisores y neuromoduladores, y por consiguiente diferentes respuestas neuronales, se pueden encontrar entre los animales anestesiados y despierto. Por lo tanto, se requieren métodos que permiten la manipulación de los sistemas de sinápticas en animales despiertos con el fin de determinar la contribución de entradas sinápticas con el procesamiento neuronal no afectado por los anestésicos. A continuación, presentamos metodología para la construcción de electrodos para registrar simultáneamente la actividad neuronal extracelular y liberar varias sustancias neuroactivos en las proximidades de los sitios de grabación en ratones despiertos. Mediante la combinación de estos procedimientos, se realizó inyecciones microiontophoretic de gabazine para bloquear selectivamente los receptores GABA A en las neuronas del colículo inferior de los ratones de cabeza-restringido. Gabazine modificado correctamente las propiedades de respuesta neural, como la zona de respuesta de frecuencia y adaptación a estímulos específicos. De este modo, se demuestra que nuestros métodos son adecuados para recording actividad de una sola unidad y para disecar el papel de los receptores de neurotransmisores específicos en el procesamiento auditivo.
La principal limitación del procedimiento descrito es el tiempo de grabación relativamente corto (~ 3 hr), que se determina por el nivel de habituación del animal a las sesiones de grabación. Por otra parte, múltiples sesiones de grabación se puede realizar en el mismo animal. La ventaja de esta técnica sobre otros procedimientos experimentales utilizados para manipular el nivel de la neurotransmisión o neuromodulación (tales como inyecciones sistémicas o el uso de modelos optogenética), es que el efecto del fármaco se limita a las entradas sinápticas locales a la neurona diana. Además, la costumbre-fabricación de electrodos permite el ajuste de los parámetros específicos de acuerdo con la estructura neural y el tipo de neurona de interés (tales como la resistencia de punta para mejorar la relación señal-ruido de las grabaciones).
Introducción
La interacción de la excitación neuronal y la inhibición es fundamental para el procesamiento de la información sensorial 1. También se sabe que la anestesia tiene un fuerte impacto sobre la dinámica de la activación cortical y el patrón temporal de entradas sinápticas 2,3. Por ejemplo, se ha observado que los anestésicos alteran la duración de las respuestas evocadas visualmente en las neuronas corticales 3,4. Además, la relación entre excitatorios e inhibitorios entradas sinápticas es diferente en animales anestesiados y despiertos 4,5, alterando tanto evocados y las tasas de actividad espontánea 6,7. Mediante ....
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Protocolo
Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo en la Universidad de Salamanca con la aprobación y el uso de métodos que se ajusten a las normas de la Universidad de Cuidado de Animales de Salamanca, así como las normas de la Unión Europea (Directiva 2010/63 / UE) para el uso de animales en la investigación en neurociencias.
1. Los electrodos de tungsteno
Nota: La fabricación de electrodos de tungsteno se basa en la técnica original descrito en Merrill y Ainsworth 27 y Ainsworth et al 28 y realiza utilizando la configuración de estación de trabajo se describe en Bullock et al 17... <....
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Resultados
Se registró la actividad de una sola unidad de 4 neuronas bien aisladas del CI. Las relaciones típicas de señal a ruido obtenidos durante las grabaciones extracelulares en ratones despiertos se muestran en la Figura 3B. La Figura 4A muestra el área de respuesta de frecuencia (FRA) de cada neurona antes y durante el bloqueo de la GABA A receptores con gabazine. Se observó un incremento en la intensidad de la respuesta (picos / estímulo), así co.......
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Discusión
El microiontophoresis de sustancias neuroactivos en animales despiertos es una técnica poderosa para sondar y diseccionar el papel de entradas sinápticas específicas sobre la actividad de las neuronas individuales 40,41. Más importante aún, este procedimiento permite la determinación de los efectos de los neurotransmisores y neuromoduladores en los circuitos neurales sin la interferencia potencial de los anestésicos. Aquí, nos demuestran que la aplicación de gabazine en el CI de los ratones despiertos cambió .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este proyecto fue financiado por el MINECO otorga BFU201343608-P y PSI2013-49348-CAD, y la subvención a la financiación SA343U14 JCYL HSH y MRC núcleo de ARP. YAA llevó a cabo una CONACyT (216.106) y una beca-SEP-.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Alambre de tungsteno | Harvard Apparatus LTD | 33-0099 | 0.005 pulgadas x 3 pulgadas |
| Capilar de vidrio de borosilicato | Harvard Apparatus LTD | 30-0053 | Pared estándar de borosilicato sin filamento, 1,5 mm de diámetro exterior, 0,86 mm de diámetro interior, 100 mm de largo |
| Capilares de vidrio multibarril | Instrumentos de precisión mundial | 5B120F-4 | Capilar de 5 barriles, 4 pulgadas de largo, 1,2 mm de diámetro exterior, con filamento |
| Diaplus | DiaDent | 2001-2101 | Adhesivo fotopolimerizable, utilizado para fijar el electrodo de tungsteno a la pipeta multibarril de vidrio |
| G-Bond | GC Corporation | 2277 | Adhesivo fotopolimerizable, utilizado para fijar el poste de la cabeza al cráneo del animal |
| Charisma | Heraeus Kulzer | 66000087 | Compuesto fotopolimerizable, utilizado para reforzar la unión del poste de la cabeza con el cráneo |
| Araldit Cristal | Expoxy, | 2 componentes, de Ceys, que se utiliza para asegurar aún más la fijación del electrodo de tungsteno a la pipeta multibarril de vidrio | |
| Incluye bombas de iontoforesis IP-2 (una para cada canal de administración de fármacos) y un módulo de equilibrio | |||
| Extractor de pipetas de vidrio multibarril | Narishige | Modelo PE-21 | |
| Lámpara LED | Technoflux | CV-215 | 5 W, 430-485 nm |
| MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | Aguja de plástico flexible, 34 AWG |
| Imalgene | Merial | Ketamina, 100 mg/mL | |
| Rompun | Bayer | Xilacina, 20 mg/mL | |
| Gabazina / SR-95531 | Sigma | S106 | Preparar ~ 1000µ l de 20 mM de gabazina en agua destilada y ajustar el pH a 4 |
Referencias
- Harris, K. D., Thiele, A. Cortical state and attention. Nat Rev Neurosci. 12 (9), 509-523 (2011).
- Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Effects and mechanisms of wakefulness on local cortical networks. Neuron. 69 (6), 1061-1068 (2011).
- Sellers, K. K., Bennett, D. V., Hutt, A., Williams, J.....
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Reimpresiones y permisos
