Análisis para el Desarrollo de riñón de pez cebra con time-lapse de uso de un microscopio de disección equipado para seccionamiento óptico

Summary

El método aquí descrito permite realizar un análisis cronológico del desarrollo de órganos en embriones de pez cebra mediante el uso de un microscopio de fluorescencia de disección capaces de realizar seccionamiento óptico y estrategias simples de reajuste para corregir la deriva focal y plana.

Abstract

Con el fin de entender la organogénesis, las alteraciones espaciales y temporales que se producen durante el desarrollo de los tejidos necesitan ser grabada. El método aquí descrito permite realizar un análisis cronológico del desarrollo normal y alteración renal en embriones de pez cebra mediante el uso de un microscopio de fluorescencia equipado para la disección de iluminación estructurada y la adquisición z-pila. Para visualizar nefrogénesis, el pez cebra transgénico (Tg (wt1b: GFP)) se utilizaron estructuras renales con la etiqueta fluorescente. Defectos renales han sido provocadas por la inyección de un oligonucleótido antisentido morfolino contra el gen del tumor de Wilms wt1a, un factor conocido por ser crucial para el desarrollo del riñón.

La ventaja de la configuración experimental es la combinación de un microscopio zoom con estrategias simples para los movimientos de re-ajuste en x, y o z dirección sin equipo adicional. Para evitar la deriva focal que es inducida por las variaciones de temperatura y vibraciones mecánicas, Una estrategia de enfoque automático se aplicó en lugar de utilizar una cámara ambiental por lo general es necesario. Con el fin de volver a ajustar los cambios de posición debido a la xy la deriva, se emplearon cámaras de imagen con rejillas de reubicación inducida.

En comparación con las configuraciones más complejas para el registro cronológico de seccionamiento óptico como el escaneo láser confocal o microscopios de lámina de luz, un microscopio zoom es fácil de manejar. Además, ofrece la disección de beneficios-microscopio específico, tales como alta profundidad de campo y una distancia de trabajo prolongado.

El método para estudiar la organogénesis presentado aquí también se puede utilizar con los microscopios de fluorescencia estéreo no capaces de seccionamiento óptico. Aunque limitada para alto rendimiento, esta técnica ofrece una alternativa a los equipos más complejos que normalmente se utiliza para la grabación de lapso de tiempo de los tejidos en desarrollo y la dinámica de órganos.

Introduction

Después de la gastrulación, la organogénesis es la siguiente etapa del ciclo de vida de un individuo. Se trata de la transposición, la interacción y muy a menudo la migración de las células para producir tejidos y órganos. La inexactitud en los procesos que subyacen al desarrollo de órganos a menudo conduce a enfermedades que pueden manifestarse de forma inmediata o también más tarde en la vida. Por lo tanto, la comprensión de la organogénesis ha realizado un esfuerzo importante en la biología del desarrollo y la investigación biomédica. Con el fin de ser capaz de investigar el desarrollo de un órgano en particular, tiene que ser visible incluso a través de la pared del cuerpo del embrión. Esto permite la grabación de las alteraciones espaciales y temporales que se producen durante el desarrollo. También con el fin de analizar la importancia de los factores involucrados en la organogénesis, que tiene que ser susceptible a la manipulación.

Un organismo que es muy adecuado para la investigación de la organogénesis in vivo es el pez cebra. su transparencia durante el desarrollo embrionario en combinación con el uso de líneas transgénicas fluorescentes permite la observación de la dinámica de localización de proteínas y de expresión, así como la visualización de los órganos internos ^1. Esto proporciona una ventaja única sobre la investigación del desarrollo de órganos en tiempo real en comparación con los modelos de mamíferos cuyos órganos son inaccesibles para el análisis microscópico. Por otra parte, diferentes herramientas están disponibles para manipular el desarrollo embrionario del pez cebra. Además de la generación de líneas mutantes, los oligonucleótidos antisentido de morfolino (MO) se pueden utilizar para derribar la actividad de genes particulares que están implicados en el desarrollo de ciertos órganos. OM o bien se dirigen a un sitio de empalme o el codón de iniciación de la traducción (AUG), y por lo tanto interfieren con la unión de pre-mRNA o la traducción.

El riñón embrionario del pez cebra, el pronefros, es un modelo anatómico sencillo pero muy valioso para estudiar el desarrollo del riñón y la función del genes relacionados con enfermedades renales ^2. Se compone de sólo dos unidades funcionales, llamadas nefronas. Cada nefrona consta de un glomérulo, donde la filtración de la sangre se lleva a cabo ^3. Otros componentes son la región del cuello corto, así como el túbulo segmentado para la secreción y reabsorción de solutos y el conducto, que termina en la cloaca ^4. Independientemente de su composición simple, la organización y los diferentes tipos de células de los pronefros de pez cebra son muy similares a la de riñón de mamífero ^5,6.

Un factor, que es críticamente implicado en el desarrollo del riñón, es codificada por el gen del tumor de Wilms supresor Wt1 ^7. El pez cebra posee dos paralogs llamados wt1a y wt1b se expresa en un patrón idéntico de solapamiento, pero no durante el desarrollo de los pronefros ^8. Mediante el uso de pez cebra transgénico con estructuras pronefros GFP-etiquetados, se ha demostrado que completa knock-down de wt1a </ em> o de un empalme forma particular, conduce a malformaciones graves o leves de riñón embrionario ^9,10, respectivamente.

El método aquí descrito permite realizar un análisis cronológico de nefrogénesis normal y alterada en embriones de pez cebra mediante el empleo de un microscopio de fluorescencia equipado para la disección de la sección óptica a través de la iluminación estructurada. secciones ópticas en general permiten la adquisición de imágenes que sólo contienen información de enfoque. Fuera de la información de enfoque se puede evitar mediante diversos enfoques tales como algoritmos matemáticos (por ejemplo. Deconvolución), diseño óptico (por ejemplo, láser confocal de microscopía de barrido) o una combinación de ambos (por ejemplo, la iluminación estructurada).

Para inducir defectos en el desarrollo del riñón se utilizó un antisentido contra MO wt1a que se inyectó en una línea de pez cebra transgénico (Tg (wt1b: GFP)). Esta línea muestra la fluorescencia de GFP-en el glomérulo, el cuello y la parte anteriorparte del túbulo ^9,10. En comparación con las configuraciones más complejas para las grabaciones con lapso de tiempo con seccionamiento óptico como el escaneo láser o microscopios de lámina de luz, un microscopio zoom es fácil de manejar y menos costoso. Por otra parte, el equipo para la iluminación estructurada fácilmente se puede combinar con el equipo convencional de fluorescencia (por ejemplo, la fluorescencia de la lámpara, los filtros) y ofrece ventajas de disección-microscopio específico, como una distancia de trabajo extendida y gran campo de visión. Problemas con la deriva se resolvieron sin necesidad de utilizar equipos adicionales (cámara ambiental, mesa antivibraciones) normalmente requerido para obtener resultados estables. Para corregir la deriva de coordinación se estableció una estrategia de enfoque automático y se utilizaron cámaras de imagen con rejillas de reubicación impresos para volver a ajustar el posicionamiento después de una desviación en dirección xo y.

El método presentado también se puede aplicar a los microscopios sin opciones seccionamiento óptico, tales como estéreo fluorescencia microscopes y ofrece una alternativa a los equipos más complejos que normalmente se utiliza para la grabación de lapso de tiempo de los tejidos en desarrollo y la dinámica de órganos.

Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los "Principios de cuidado de los animales de laboratorio", así como a la versión actual de la Ley alemana de protección de los animales.

1. Preparación de antisentido morfolino-(MO)

1. Para preparar una solución de 3 mM MES, añadir 100 l de agua ultrapura estéril a la MO liofilizado (300 nmol en vial de vidrio). Para la disolución completa, calentar la solución madre a 65 ° C durante 5 min. Sellar el vial con Parafilm y almacenar la solución madre de MO a temperatura ambiente (TA). No enfriar la solución madre de MO, ya que ello podría causar una asociación de la MO con las paredes del vial.
2. Preparar una solución de trabajo MO 1 mM por dilución de la solución madre de MO con agua ultrapura estéril y añadir solución de color rojo 0,5% de fenol a una concentración final de 0,05%.
   1. Para obtener 10 l de una solución de trabajo MO, añadir 3,3 l de solución madre MO y 1 l de solución de rojo fenol al 0,5% a 5,7 l de agua. Sertanto la preparación de un nuevo lote de solución de trabajo de calentar la solución MES Stock a 65 ° C durante 5 min.
3. Antes de su uso, centrífuga de la solución de trabajo de MO para evitar la obstrucción de la aguja. Por ejemplo, girar 10 l de solución madre de MO a 15.000 xg durante 5 min (RT) y retire 8 l del sobrenadante para la inyección.
   NOTA: La pérdida de actividad puede ocurrir en las soluciones de morfolino con el tiempo ^11. Para excluir esto, se puede probar las soluciones por espectrometría UV siguiendo el protocolo suministrado por el fabricante. En el caso de los wt1a utilizados morfolino una eficacia reducida no se ha observado durante un largo período de almacenamiento (solución de trabajo 3 mM fue almacenado más de una año).

2. Configuración de parejas de apareamiento y Recogida de huevos fertilizados

1. La tarde antes de la microinyección, estableció cinco pares de la Tg (wt1b: GFP) de línea, cada una en un recipiente de cultivo equipado con un tamiz desmontable para separarmachos y hembras durante la noche.
   NOTA: Para asegurarse de que haya suficientes huevos están disponibles para un experimento de inyección de éxito, de pescado utilizada como parejas de apareamiento debería haber sido pre-seleccionados y evaluados como "productores" buenas.
2. A la mañana siguiente, después de que las luces se encienden, puso el macho y hembra juntos por encima del tamiz que impide que los peces crezcan de forma desmesurada sus huevos.
3. Ver el desove. Una vez que una cantidad de huevos son puestos que se pueden inyectar antes de la etapa de 4 células se alcanza (aproximadamente 50), macho hembra separada de nuevo. La transferencia de los huevos con una pipeta Pasteur en una placa de Petri llena de agua de embriones para una primera ronda de inyección. Para obtener rondas adicionales de los huevos, colocar un par de acoplamiento juntos y por separado varias veces.

3. El trabajo preparatorio para la microinyección

NOTA: Realice los pasos 3.1 y 3.2 por adelantado.

1. Para preparar un plato que contiene los embriones en posición durante la inyección (plato microinyección) insertar un gldiapositiva culo en un ángulo de 40-45 ° en una placa de Petri de 94 mm lleno transparente, silicona líquida, pura calidad alimentaria. Retire la diapositiva cuando se endurece el silicio. Que produce una ranura en la capa de silicio.
   NOTA: Como alternativa, utilice 1,5-3% de agarosa en lugar de silicio y almacenar el plato a 4 ° C.
2. Generar agujas de inyección de capilares de vidrio con un extractor de aguja.
   1. Utilice capilares que contienen filamentos internos.
      NOTA: El filamento ayudará a transportar la solución MO hacia la punta de la aguja después de relleno (ver 3.3).
   2. Establecer configuración apropiada de la aguja extractora. Buenas agujas para la inyección en el pez cebra deben tener puntas largas y delgadas ^12. Generar las extremidades con una longitud de aproximadamente 10 mm y un diámetro de 1,5-2 micras, con su final. Por ejemplo, usar un extractor de aguja horizontal con los ajustes siguientes: Calor = 330, Pull = 0, Velocidad = 40, Tiempo = 100.
   3. Examinar la calidad de las agujas bajo unamicroscopio de disección y resolver aquellos con extremidades cortas o demasiado largas.
      NOTA: Las agujas con puntas cortas tienden a dañar el embrión, mientras que con tales consejos muy largos y delgados se doblan al tocar el corion y no penetren en ella.
3. Rellene la aguja con 2 l de solución de trabajo de MO mediante el uso de una punta microloader e insertarlo en el soporte de la aguja del aparato de microinyección.
4. A medida que las agujas están cerradas en el extremo de la punta, generar una apertura apretando de nuevo el final de la aguja con pinzas cortantes bajo el microscopio de disección. Alternativamente, puede utilizar el aparato de microinyección para empujar suavemente la punta de una superficie rígida (por ejemplo. Pequeño bloque de metal o en la espalda de pinzas).
5. Calibrar el volumen de inyección mediante la inyección de la solución de trabajo de MO en una gota de aceite mineral colocado en una retícula. Ajuste la duración de la inyección para la producción de un diámetro de la gota de 75 m para obtener un volumen de inyección de aproximadamente 200 pl.

4. Procedimiento microinyección

1. Colocar los embriones en la etapa 1 de las células a lo largo de la ranura de la placa de microinyección con el polo vegetal hacia la dirección de donde viene la aguja (hacia el ángulo de 45 ° de la ranura).
2. Perforar el corion y la yema con la aguja e inyectar 200 pl de la solución de trabajo de 1 MO mM (0,2 pmol) en la yema de 1- a los embriones de 2 células.
3. Con una pipeta Pasteur con una amplia abertura, recoger todos los embriones inyectados en una placa de Petri llena de agua de embriones y los incuban a 28,5 ° C.
4. Por la tarde, eliminar embriones muertos mediante el uso de una pipeta Pasteur con una amplia apertura y reemplazar el agua de embriones.

5. Preparación de embriones para imágenes in vivo

1. A la mañana siguiente, sustituir el agua de embriones con agua embrión que contiene 0,003% de N-feniltiourea (PTU) para inhibir la melanización. No aplique PTU antes del final de la gastrulación porque interfEres con el desarrollo embrionario temprano.
   PRECAUCIÓN: La PTU es tóxico y teratogénico. Use guantes en todo momento y evitar la inhalación y el contacto con la piel.
2. Dechorionate los embriones con pinzas cortantes bajo un microscopio de disección en la etapa de desarrollo deseado. Coge el corion con un par de pinzas y tratar de agarrar el otro lado del corion con un segundo par de pinzas. Tire con cuidado las pinzas en direcciones opuestas sin interrumpir el embrión.
3. Anestesiar al embrión mediante la sustitución del agua embrión que contiene PTU (0,003%) con agua que contiene embrión PTU (0,003%) y 0,02% de acetato de metanosulfonato de 3-aminobenzoato (tricaína).
4. Incrustar el embrión de bajo punto de fusión de agarosa en un μ-cubreobjetos plato de fondo con una rejilla reubicación de 50 micras. incrustación adecuada requiere algo de práctica.
   1. Preparar alícuotas de 1 ml de agarosa al 0,7% en 1,5 ml tubos de reacción y los puso en un bloque de calor ajustado a 36 ° C. Utilizar una pipeta Pasteur con amplia apertura de Transfer el embrión a la μ-plato. Eliminar el exceso de agua de embriones utilizando una pipeta Pasteur con punta ultra-delgado y superponer el embrión con la agarosa templado.
   2. Mientras que la agarosa es aún líquido, orientar el embrión con dos puntas de carga de gel en la posición deseada, con respecto a la estructura de interés, así como la distancia a la red de reubicación. Coloque la estructura de interés (en este caso el pronefros) lo más cerca posible a la parte inferior de vidrio (aquí: dorsal hacia abajo) y en estrecha proximidad a la red.
   3. Para obtener una calidad de imagen óptima minimizar la capa de agarosa entre el embrión y el fondo de vidrio mediante la colocación de la estructura de interés del embrión lo más cerca posible a la parte inferior. Además de eso, busque el embrión en las cercanías de la parrilla, pero tenga cuidado de que la red no se superpondrá con la estructura de interés. Incrustar 3-4 embriones en diferentes mu-platos cada uno y utilice la que se posiciona mejor.
   4. Cuando la agarosa es lo suficientemente duro para mantener la espera de embriones de 2-3 Min y superponer el embrión embebido con agua embrión que contiene 0,003% y 0,02% PTU Tricaína. Se decanta el exceso de agua de embriones o eliminarlo mediante el uso de una pipeta Pasteur con punta ultra fina. Cerrar la tapa de la μ-plato en la posición de bloqueo para evitar la evaporación.
      NOTA: evitar la aparición de burbujas de aire en el μ-plato, ya que serían perjudiciales para la grabación de imágenes.

6. Microscopía

NOTA: Utilice un microscopio equipado para el seccionamiento óptico a través de la iluminación estructurada. grabar imágenes con un software que contiene los siguientes módulos: multicanal, Z-Stack, series de tiempo, software de enfoque automático como extendida.

1. Adquisición de Z-pilas
   1. Invertir la μ-plato. El fondo de cristal se enfrenta ahora hacia el objetivo y la μ-plato sirve como una cámara de imágenes.
   2. Mueva el control deslizante a la posición en la parrilla y activar el modo de iluminación estructurada en los controles de software.
   3. Calibrarel foco rejilla para el canal (s) de elección con la muestra a ser examinada (embrión embebido) siguiendo las instrucciones del asistente de calibración de enfoque.
   4. Activar el modo de adquisición Z-Stack y cambie al modo de centro. Centrarse en el centro de la probeta y establecerlo como el plano central de la pila z haciendo clic Center. Establecer la dimensión de la pila Z mediante la definición de la gama de alrededor de la posición central.
      NOTA: estructuras de objetos no deben ser vistos bruscamente fuera del primer y el último plano de la z-pila.
   5. Ajustar el espacio entre secciones ópticas. Para obtener la mejor resolución z-clic en el botón óptima. Sobre la base de la profundidad de los objetivos de campo el software fijará una distancia recomendada siguiendo el criterio de Nyquist (50% de superposición).
      NOTA: Si el objetivo de menor tamaño de archivo y los permisos de estructura, establecer un tamaño mayor separación manualmente. Configuración de pasos más pequeños que los recomendados únicamente dará lugar a archivos de mayor tamaño sin aumentar más adelanteinformación al.
2. Time-lapse
   1. Abra la herramienta de series temporales y establecer el intervalo del experimento de series de tiempo. Por ejemplo grabar imágenes z-pila cada 30 min durante un período de 5 horas.
   2. Para corregir la deriva de coordinación con el tiempo, establecer una estrategia de enfoque automático. Marque la casilla de diálogo estrategia de enfoque, seleccione Software de enfoque automático de la lista desplegable y seleccione el canal TL-campo claro como canal de referencia.
   3. Comience cada punto de tiempo con el enfoque automático. Con el fin de asegurar un rango de búsqueda fiable dentro de un marco de tiempo optimizado, establecer una relación de 200 micras rango de búsqueda fijo. Esta gama se escanea completamente (parámetro Rango de cobertura) con una calidad básica (parámetro de calidad) en un (parámetro de muestreo) tamaño máximo de paso.
   4. Para aumentar la precisión del enfoque automático, active la medición dentro de una región foco de interés (ROI enfoque) y la posición de retorno de la inversión, dijo foco en la ventana de visualización en vivo alrededor de la estructura de interés.
      NOTA: Siel sistema carece de enfoque automático del módulo de software que actualiza el z-posición central de forma automática durante la grabación de lapso de tiempo, hacer una pausa en el experimento en un momento dado y ajustar el enfoque de forma manual y continuar el experimento.
   5. Para compensar un potencial xy la deriva durante la grabación de series de tiempo, la posición de un punto de la cuadrícula impresa (de la cámara de imágenes) en particular en el punto de mira del software y guardar el posicionamiento al hacer una captura de pantalla.
   6. Iniciar el experimento de series de tiempo. Antes de que el intervalo de series de tiempo ha terminado, hacer una pausa en el experimento y, si es necesario, vuelva a ajustar el posicionamiento de acuerdo con la pantalla. Continuar con el experimento.

Procesamiento 7. Imagen

1. Cambie a la pestaña de procesamiento y seleccione la Profundidad de Foco Extendida (EDF) en el cuadro de diálogo Método. Desde secciones ópticas se adquieren, aplicar el algoritmo de máxima proyección de la serie de imágenes.
   NOTA: Aquí el algoritmo se proyectará el brightest o el píxel más oscuro de la pila de una imagen 2D compuesta en un primer paso y, finalmente, usar el uno con el mayor varianza de una imagen de resultado para cada punto de tiempo como.
2. Utilice el método de película de exportación para crear una película de lapso de tiempo (por ejemplo, AVI o mover archivos) de la serie de imágenes del FED.

Results

La microscopía de lapso de tiempo es una técnica poderosa para observar procesos biológicos dinámicos durante un período de tiempo más largo. Un problema que a menudo ocurre cuando se toman imágenes de lapso de tiempo es un movimiento en x, y o z dirección, denominada de deriva, que es inducida por las variaciones de temperatura y vibraciones mecánicas. El método que aquí se presenta permite la grabación de las estructuras de la etiqueta fluorescente en embriones de pez cebra o larvas en un microscopio de disección sin cámara ambiental y mesa antivibraciones de lapso de tiempo.

Para la compensación de la deriva xy, el espécimen fue incrustado en una cámara de imágenes con una rejilla reubicación Impresa (Figura 1). La ubicación de un punto de la red en relación con el punto de mira de la herramienta de software en particular se utiliza para devolver el espécimen a la posición pre-ajustado (Figura 2A). Los resultados presentados se obtuvieron usando un microscopio zoomcon un control deslizante integrado para seccionamiento óptico a través de iluminación estructurada (Figura 2B). Para la corrección focal continua, se estableció una estrategia de enfoque automático. En esta estrategia, el enfoque automático de software se utiliza para encontrar el enfoque basado en el contraste máximo antes de cada punto de tiempo. Este plano focal así definida se establece posteriormente como plan de centro para la adquisición z-pila. Con el fin de minimizar la fototoxicidad en la muestra, el canal de campo claro de luz transmitida se utiliza como canal de referencia, ya que permite tiempos de exposición suficientemente cortos durante la etapa de enfoque automático (Figura 2C).

El método se aplicó para el análisis comparativo del desarrollo renal en embriones morphant Control- y wt1a de una línea de pez cebra transgénico (Tg (wt1b: GFP)). Durante nefrogénesis principios de esta línea muestra la fluorescencia verde en el mesodermo intermedio, se presentan los progenitores de riñón de ^9,10 y más tardeen los túbulos que forman y primordios nefrona (Figura 3).

Grabación de la imagen de lapso de tiempo revela que en nefrogénesis de control morpholino inyectado embriones no se altera en comparación con los no inyectados (resultados no mostrados) y sigue los pasos que se describen el desarrollo del riñón de pez cebra temprana ^3. A las 20 HPF los túbulos pronéfricos en desarrollo son visibles y en sus extremidades anteriores, acumulaciones esféricas de células, que representan a los primordios de nefronas que forma se pueden detectar. Durante las próximas horas, túbulos y primordios nefrona crecen y más tarde en los primordios comienzan a fusionarse en la línea media (Figura 4, vídeo 2). Por el contrario, nefrogénesis está gravemente perturbado en embriones wt1a morphant. Aunque las estructuras tubulares GFP-positivas son visibles a las 20 HPF, que parecen ser más difusa y menos desarrollados. Por otra parte, no se han formado los primordios de la nefrona adecuados. La diferencia más notable a tque controla los embriones en este punto de tiempo, sin embargo, es la aparición de un gran número de células fluorescentes fuera de las pronefros en desarrollo (Figura 4, vídeo 2). Posteriormente, estas células dejan el campo pronephric y migran hacia ventral (vídeo 2).

El desarrollo del riñón en los embriones de control y morphants wt1a de la línea transgénica wt1b se han comparado previamente por la toma de imágenes en diferentes puntos de tiempo fijo ^9,10. En contraste con este método estático, grabación a intervalos regulares permite seguir la dinámica de nefrogénesis normal y misrouting de células progenitoras renales causados ​​por el agotamiento wt1a.

Figura 1: Ilustración esquemática de un embrión Incluidos en una Cámara comercialmente disponible con Reubicación Grids. El plato tienecuatro rejillas, cada subdividen en una distancia de repetición de 50 micras, impresa en una parte inferior cubreobjetos de vidrio. El embrión en ser fotografiado está incrustado al revés, con la estructura de los riñones en las proximidades de una plaza de observación, pero sin superposición con la red. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2:. Ajustes por Compensación de la deriva en time-lapse y cuadrícula de proyección de luz estructurada una posición distinta de la parrilla de reubicación se metía en el centro de la imagen (marcadas por cruces amarillas) y sirve como punto de referencia para más adelante xy alineación en el caso de pequeños desplazamientos. El rectángulo rojo representa la región de interés (ROI) que se utiliza en la estrategia de enfoque automático (A). wa seccionamiento ópticos obtenido por la iluminación estructurada. La imagen muestra una estructura de rejilla proyectado en el plano focal después de la calibración correcta (B). El retorno de la inversión para la estrategia de enfoque automático (rectángulo rojo) está configurado para cubrir las estructuras embrionarias distintivos altos en contraste (en este caso somitas) que permiten un enfoque automático fiable en la estructura de interés (C). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: wt1b transgénicos:. GFP embriones con Fluorescencia verde en el riñón en desarrollo de superposiciones de dorsal (A) o la transmisión lateral (B) y las imágenes de fluorescencia se muestran con anterior a la izquierda. np, primordio nefrona; pt, túbulo pronephric; regularácaros. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Derribo de wt1a Interrumpe el Desarrollo de riñón embrionario Representante, gran profundidad de foco imágenes de las grabaciones con lapso de tiempo.. En los embriones inyectados de control de morfolino, el desarrollo del riñón muestra progreso normal con el crecimiento de los túbulos y los primordios de nefronas que comienzan a fusionarse en la línea media. Por el contrario, morphants wt1a no pueden formar primordios nefrona adecuada y una cantidad masiva de células GFP positivas están fuera del campo pronephric. (np, primordio nefrona; pt, túbulo pronephric). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Suplementario vídeo 1. grabación de lapso de tiempo del desarrollo normal de los riñones de embriones inyectados de control de morfolino. (Haga clic derecho para descargar). El vídeo muestra cómo crecen y túbulos nefrona primordios comienzan a fusionarse. A partir de 20 hpf, se tomaron imágenes en intervalos de 30 min durante un período de 5 horas.

Suplementario de vídeo de grabación 2. lapso de tiempo de nefrogénesis perturbado en embriones wt1a morphant. (Haga clic derecho para descargar). El vídeo muestra la migración de las células GFP-positivas fuera de la región pronephric. A partir de las 20 HPF, se tomaron imágenes en 30 millasn intervalos durante un período de 5 horas.

Discussion

El pez cebra se ha convertido en un organismo modelo popular para los estudios de desarrollo de los vertebrados y modelos de enfermedades humanas. Debido a embriones de pez cebra permanecen transparentes, los órganos en desarrollo como el cerebro y el corazón se pueden observar con un microscopio preparación estándar. Aprovechando las líneas transgénicas con fluorescencia específica de órganos permite la evaluación de la organogénesis a lo largo de las diferentes etapas de desarrollo en embriones vivos por microscopía de fluorescencia. Una limitación para obtener imágenes de los detalles estructurales de órganos enteros con microscopía de epifluorescencia estándar es el impacto de las señales de los objetos encima y por debajo del plano focal. Esta luz fuera de foco no sólo resulta en la disminución de contraste de imagen y resolución, sino que también puede oscurecer las estructuras importantes de interés ^13,14. Varias técnicas tales como confocal- de escaneo láser, hilatura confocal- disco o microscopía multifotónica se han desarrollado para reducir al mínimo la información fuera de foco y de este modo Increase contraste de la imagen así como la resolución axial. Un método alternativo para obtener secciones ópticas es la microscopía libre estructurado iluminación láser y escáner, una basada en el amplio campo técnica de iluminación que es fácil de implementar y en un microscopio normal ^15. Los resultados presentados aquí muestran que la sección óptica, alcanzado por la iluminación estructurada, implementado en un microscopio de disección y se combina con la reconstrucción de imágenes de enfoque extendidas, permite la visualización de detalles estructurales de normal y perturbado el desarrollo del riñón en el pez cebra. En particular, las células positivas para GFP en morphants wt1a se dispersan a diferentes profundidades focales, y las imágenes de un solo plano con la falta de definición foco fuera de la red sería subestimar la complejidad de tres dimensiones del fenotipo.

Para seguir la dinámica del órgano organización, reorganización o la interrupción, la microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo es un potente aunque compleja técnica. Durante lapso de tiempode imágenes ligeras vibraciones o cambios de temperatura menores causan derivas en x, y o z. Esto exige equipo adicional (cámara ambiental, mesa de anti-vibración) con el fin de obtener resultados estables. El método presentado utiliza la capacidad de un microscopio de disección con una unidad de enfoque motorizado para grabar imágenes con lapso de tiempo sin dispositivos adicionales. Para mantener un enfoque estable, se estableció una estrategia de enfoque automático y una rejilla reubicación impreso en la parte inferior de la cámara de formación de imágenes se utiliza para la corrección de x, la inestabilidad y-.

incrustación adecuada del embrión es un paso crítico en el protocolo. Se necesita algo de práctica para colocar la estructura de interés lo más cerca posible a la parte inferior de vidrio y en estrecha proximidad a la red sin superposición con él.

La principal ventaja del método es que es una herramienta asequible y simple para la observación directa de los procesos de desarrollo tales como el crecimiento y la migración en la vidaembriones durante varias horas. Por otra parte, los beneficios-microscopio de disección específica como gran campo de visión y la distancia de trabajo extendida facilitar el examen de las muestras más grandes, incluyendo órganos enteros. Sin embargo, algunas limitaciones tienen que ser tenidos en cuenta. La pausa del experimento para comprobar y reajustar el posicionamiento hace que el procedimiento requiere mucho tiempo y la ausencia de un control de la temperatura robusta cambia el tiempo de desarrollo "estándar", que se define como post hr fertilización a 28,5 ° C para el pez cebra ^16. Otro problema potencial es la profundidad limitada de formación de imágenes en el animal, en particular cuando la estructura de interés se encuentra dentro del embrión o larva. Tal estructura es el glomérulo pronephric pez cebra, que está situado entre los somitas y el saco vitelino. Se encontró que la profundidad límite para obtener imágenes de los glomérulos en alrededor de 200 micras, una distancia que se alcanza después de 5 días de desarrollo. En contraste, las estructuras fluorescentes que son lbicada más cerca de la superficie del animal puede ser reflejado por un tiempo más largo. Por ejemplo las células del hígado son accesibles para la formación de imágenes por lo menos hasta 9 dpf. Una limitación adicional es que la inmovilización a largo plazo del embrión o larva en agarosa y tratamiento tricaína inducir el retraso del crecimiento y el edema cardiaco, respectivamente. Debido a que esto puede interferir con el desarrollo normal, se recomienda limitar la duración de la grabación de lapso de tiempo para un cierto periodo de interés. Para asegurar que durante las estructuras de formación de imágenes de interés se desarrolla normalmente es útil para comparar (al final) la apariencia general con la de un animal mantuvo en las mismas condiciones experimentales, pero sin incorporar y anestesia.

Grabación de un z-pila de secciones ópticas cada 30 minutos durante un período de 5 horas y el posterior cálculo de la profundidad de foco imágenes a cabo siempre la información espacial y temporal sobre los primeros eventos de la normal y perturba el desarrollo del riñón que fue inducida bdesmontables de wt1a y morfolino-mediada. Experimentos morpholino desmontables realizados anteriormente ya han demostrado que Wt1a cumple un papel temprano y esencial en la formación de pronefros La hibridación in situ con marcador renal ^17,18 y el empleo de la wt1b transgénico:. GFP línea para el desarrollo pronefros de imagen a tiempo fijo ^9,10 puntos revelado que la deficiencia en la morfogénesis wt1a glomerular perturbado y fallaron especificación de podocitos. En contraste con estos enfoques estáticos, grabaciones con lapso de tiempo visualizar directamente la dinámica de nefrogénesis temprano en embriones de control y la migración de las células GFP-positivas fuera de la región pronephric en morphants wt1a. La posibilidad de realizar un seguimiento de las células mal encaminadas en el tiempo permite un análisis más detallado fenotipo.

En general, el método que se presenta aquí proporciona un barato y fácil de usar alternativa al complejo, y menos accesibles setups normalmente utilizados para la imagen de lapso de tiempo, tales como el microscopio de barrido láser (equipado con una cámara ambiental y mesa antivibraciones) o un microscopio de lámina de luz. La rutina descrita para solucionar los problemas de deriva también puede ser aplicado para realizar imágenes con lapso de tiempo en configuraciones sin opciones seccionamiento óptico, tales como microscopios de fluorescencia estéreo.

La técnica no sólo es adecuado para investigar el desarrollo del riñón, pero también se puede aplicar para controlar la morfogénesis normal y defectuoso de otros órganos tales como el corazón o el hígado. Además, el método se puede utilizar para observar varios procesos más dinámicos en organismos modelo embrionarias y adultas, tales como la curación o regeneración de heridas.

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Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Control Morpholino	Gene tools, LLC	Oligo de control estándar	Preparado  control  oligo
wt1a Morpholinos	Gene tools, LLC	personalizado	Diseñado para apuntar al primer sitio donante de empalme, secuencia según lo publicado en Ref. 9
0.5% Solución de rojo de fenol	Sigma	P0290	Trazador de inyección
peqGOLD Agarosa universal	peqlab	35-1020	Para preparar plato de microinyección
Capilares de vidrio  (GC100F-10)	Hugo Sachs Elektronik	30-0019	Para generar agujas de inyección
Puntas de microcargador	Eppendorf	5242956003	Para cargar la aguja de microinyección
Pinzas Dumont	Fine Sience Tools	91150-20	Para generar una abertura en la punta de la aguja
Agua embrionaria (0,3x Danieaus&solución aguda)			1x: 58 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,4 mM MgSO4,  0,6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; ¡No agregue azul de metileno!
Retícula 5 mm/0,05 mm	Science Services	PY68039-02	Para el cálculo de la cantidad de inyección
Pipeta Pasteur 137 mm, 4,8 ml	Roth	E305.1	Para recoger óvulos, transferir embriones y extraer embriones muertos
Pipeta Pasteur con punta ultrafina 157 mm, 3,5 ml	Roth	E304.1	Para eliminar el exceso de agua
N-feniltiourea (PTU)	Sigma	P7629	Para la supresión de la melanización
3-aminobenzoato de etilo metanosulfonato (Tricaína)	Sigma	E10521	Para anestesiar el pez cebra
Agarosa de bajo punto de fusión	Biozym	850111	Para incrustar
µ-plato 35 mm, high Rejilla de fondo de cristal-50	ibidi	81148	Cámara de imagen
Puntas de carga de gel	Hartenstein	GS05	Para orientar el embrión para una correcta incrustación
Name	Company	Número de catálogo	Comments
< strong>Equipment
micropipetas (modelo P-97)	Instrumento		Para generar agujas de inyección
Micromanipulador	Saur Laborbedarf		Para microinyección
Thermomixer copact	Eppendorf		Thermoblock para templar la agarosa de bajo punto de fusión
SZ61 (Microscopio estereoscópico)	Olympus		Para control de inyección
Axio Zoom. V16	Zeiss		Para incrustar e obtener imágenes
ApoTome.2 slider	Zeiss		Para el corte óptico
AxioCam MRm	Zeiss		imágenes
ZEN 2012	Zeiss		Imaging