Orientación de Biofilm Asociadas<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Uso de Ensayo de susceptibilidad a fármacos Basado resazurina

Resumen

La mayoría de las infecciones bacterianas producen una biopelícula. En virtud de su entorno, las bacterias asociadas a la biopelícula suelen ser fenotípicamente resistentes a los fármacos. Por lo tanto, las nuevas moléculas antibacterianas que matan las bacterias en las biopelículas son una alta prioridad. Establecemos un ensayo para detectar rápidamente compuestos antimicrobianos que sean eficaces para erradicar las biopelículas.

Resumen

La mayoría de las bacterias patógenas son capaces de formar biopelículas durante la infección, pero debido a la dificultad de manipular y evaluar las biopelículas, la gran mayoría del trabajo de laboratorio se realiza con células planctónicas. Aquí, describimos un ensayo de biopelícula de placa de clavija realizado con Staphylococcus aureus. Las biopelículas bacterianas se cultivan en clavijas unidas a una tapa de placa de microtitulación de 96 pocillos, se lavan mediante una inmersión suave en tampón y se colocan en una placa de desafío con medicamentos. Tras la posterior incubación se vuelven a lavar y se trasladan a una placa de recuperación final, en la que el colorante fluorescente resazurina sirve como indicador de viabilidad. Este ensayo ofrece una mayor facilidad de uso, fiabilidad y reproducibilidad, así como una gran cantidad de datos cuando se realiza como una lectura cinética. Además, este ensayo se puede adaptar a un enfoque de cribado de fármacos de rendimiento medio mediante el cual se toma una lectura fluorescente de punto final, lo que ofrece un camino para los esfuerzos de descubrimiento de fármacos.

Introducción

Los microbios patógenos pueden formar biopelículas in vivo que conducen a infecciones crónicas no agudos ^1. Infección por biofilm asociado es un factor de riesgo grave de procedimientos médicos que implican la implantación de cuerpos extraños (por ejemplo, substituciones de huesos artificiales, implantes de pecho) o la instalación de los tubos traqueales o catéteres urinarios ^2. En estos contextos, la terapia anti-infecciosa es casi siempre necesario como infecciones basado en biopelícula rara vez se borran por su cuenta, incluso en individuos inmunocompetentes. Staphylococcus aureus es uno de los patógenos más frecuen....

Protocolo

1. Iniciación de biopelículas

1. Hacer crecer una cultura de producción de biofilm organismo en un medio rico en nutrientes. Inocular Staphylococcus aureus cepa Newman en 10 ml de medio Mueller-Hinton de un stock de glicerol. Realizar todos los trabajos que impliquen la manipulación de S. aureus con guantes y dentro de una cabina de bioseguridad.
2. Incubar durante 16 horas a 37 ° C en un agitador rotatorio (100 a 200 rpm).
3. Determinar _DO600 del cultivo usando un espectrofotómetro y una cubeta estándar (longitud de recorrido: 1 cm).
4. Calcular el volumen (V) de la cultura necesaria para preparar 20 ml de in....

Resultados

El ensayo de la resazurina es suficientemente sensible para detectar con fiabilidad muy pocas células viables capaces de replicarse en medio libre de fármaco después de la exposición. En esta metodología, se define el biofilm erradicar la concentración mínima como la concentración más baja a la que no se observa una conversión de resazurina dentro de las 24 horas. El ensayo se basa en la resazurina moléculas oxidativas que se encuentran en las células metabólicamente activas que conviert.......

Discusión

Aquí, hemos descrito un ensayo de biopelícula modificado para determinar la actividad de los inhibidores de la prueba sobre S. biopelículas aureus que se centran en el estado metabólico de las células del biofilm asociado. Mientras que la iniciación de la biopelícula se describe y procedimientos reto recomendaciones del fabricante sobre todo imitaba, el uso de resazurina tinte para detectar y cuantificar las células del biofilm-asociado que sobreviven a un desafío inhibidor de 24 hr simplifica enormeme.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Mueller-Hinton Medium	Oxoid	CM0405	Siga las recomendaciones del fabricante
RPMI-medium	Corning	17-105-CV
CRPMI	Ref 9		RPMI-1640 chelexado medio durante 1 hora con resina Chelex 100 y luego suplementado con 10% sin chelexed RPMI-1640
Chelex 100 Resina	Bio Rad	142-2822
MBEC-placas	Innovotech	19111
Resazurin Sal de Sodio	Sigma	R7017	800 µ g/ml en agua desionizada        Plataforma de agitación de microplacas estériles de filtro
	Heidolph Titramax 1000
Cytation 3 Lector de placas	Biotek
Gen5 software	Biotek		Registro y análisis de la conversión de resazurina
Neocuproína	Sigma	N1501	preparar 10 mM de stock en etanol 100%, almacenar a -80 º C
Sulfato de cobre	Acros Organics	7758-99-8	prepare una solución madre de 100 mM en agua, almacene a 4 º C
Cu-Neocuproína	fabricación		Generada mediante la mezcla de molaridades iguales de neocuproína y sulfato de cobre. La mezcla se diluyó en medio CRPMI hasta la concentración deseada.
Gentamicina	Sigma	G3632-1G

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