Orientación de Biofilm Asociadas<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Uso de Ensayo de susceptibilidad a fármacos Basado resazurina

Resumen

La mayoría de las infecciones bacterianas producen una biopelícula. En virtud de su entorno, las bacterias asociadas a la biopelícula suelen ser fenotípicamente resistentes a los fármacos. Por lo tanto, las nuevas moléculas antibacterianas que matan las bacterias en las biopelículas son una alta prioridad. Establecemos un ensayo para detectar rápidamente compuestos antimicrobianos que sean eficaces para erradicar las biopelículas.

Resumen

La mayoría de las bacterias patógenas son capaces de formar biopelículas durante la infección, pero debido a la dificultad de manipular y evaluar las biopelículas, la gran mayoría del trabajo de laboratorio se realiza con células planctónicas. Aquí, describimos un ensayo de biopelícula de placa de clavija realizado con Staphylococcus aureus. Las biopelículas bacterianas se cultivan en clavijas unidas a una tapa de placa de microtitulación de 96 pocillos, se lavan mediante una inmersión suave en tampón y se colocan en una placa de desafío con medicamentos. Tras la posterior incubación se vuelven a lavar y se trasladan a una placa de recuperación final, en la que el colorante fluorescente resazurina sirve como indicador de viabilidad. Este ensayo ofrece una mayor facilidad de uso, fiabilidad y reproducibilidad, así como una gran cantidad de datos cuando se realiza como una lectura cinética. Además, este ensayo se puede adaptar a un enfoque de cribado de fármacos de rendimiento medio mediante el cual se toma una lectura fluorescente de punto final, lo que ofrece un camino para los esfuerzos de descubrimiento de fármacos.

Introducción

Los microbios patógenos pueden formar biopelículas in vivo que conducen a infecciones crónicas no agudos ^1. Infección por biofilm asociado es un factor de riesgo grave de procedimientos médicos que implican la implantación de cuerpos extraños (por ejemplo, substituciones de huesos artificiales, implantes de pecho) o la instalación de los tubos traqueales o catéteres urinarios ^2. En estos contextos, la terapia anti-infecciosa es casi siempre necesario como infecciones basado en biopelícula rara vez se borran por su cuenta, incluso en individuos inmunocompetentes. Staphylococcus aureus es uno de los patógenos más frecuentemente observados implicados en las complicaciones relacionadas con la biopelícula que se producen durante el uso de dispositivos médicos invasivos ^3.

Desafortunadamente, la naturaleza misma de biofilms como una barrera protectora hace más resistentes al tratamiento que las células planctónicas ^1,4, y la evaluación de la eficacia clínica predicho es una parte crítica de tanto inicialel desarrollo de fármacos, así como vigilar la resistencia. Existe una creciente reconocimiento de que las condiciones de laboratorio, se centró en las culturas planctónicos, pueden no representar fielmente la enfermedad en el mundo real ^5. Agravando aún más el problema, la replicación de los fenotipos de biopelícula es difícil, y los modelos de biopelículas existentes son tediosos y sufren de alta variabilidad inter e intra-ensayo ^6. Por lo tanto, muchos investigadores, por necesidad, por defecto a ensayos de células planctónicas de susceptibilidad a los fármacos, lo que potencialmente descuidar un aspecto importante de la virulencia bacteriana y la enfermedad.

Aquí se describe el protocolo para el ensayo de bacterias, específicamente S. aureus, en los biofilms pre-crecido que utilizan un sistema de biopelícula ^7,8 basadas en 96 pocillos. Mientras que el protocolo para la formación de biopelículas y el desafío sigue esencialmente la recomendación del fabricante, se presenta una metodología rica en información alternativa para cuantificar la viabilidad de la bioFILM después de la exposición. Brevemente, las bacterias se cultivan en la placa de clavija, donde las biopelículas se forman en las clavijas sobresalientes unidos a la tapa de la placa. Después de la formación de biopelículas, las clavijas se sumergen suavemente en pocillos de una placa fresca llena con PBS para eliminar las células planctónicas. El PEG-tapa, con biofilms adjuntos, se transfiere a una nueva placa de desafío, que contiene varias concentraciones de antibióticos a ensayar. Después de una segunda incubación, las tapas se retiran de nuevo, se lavaron y se transfirieron a una placa de recuperación que contiene resazurina tinte, donde se someten a una incubación final. conversión resazurina se puede grabar cinéticamente o toma como una lectura de punto final después de un período de recuperación definido. Este método basado en el colorante de la cuantificación de la viabilidad de biofilms difiere considerablemente de las CFU (unidades formadoras de colonias) tediosas metodología basada en contar se describe en el protocolo original ^7. OD ₆₀₀ mediciones de la placa desafío de las drogas y resazurina cinética de conversión sirven como lectura viabilidadouts de células planctónicas y biofilm, respectivamente, que ofrecen un ensayo rápido, fiable, rico en información y técnicamente simple para la supervivencia de biopelículas.

Protocolo

1. Iniciación de biopelículas

1. Hacer crecer una cultura de producción de biofilm organismo en un medio rico en nutrientes. Inocular Staphylococcus aureus cepa Newman en 10 ml de medio Mueller-Hinton de un stock de glicerol. Realizar todos los trabajos que impliquen la manipulación de S. aureus con guantes y dentro de una cabina de bioseguridad.
2. Incubar durante 16 horas a 37 ° C en un agitador rotatorio (100 a 200 rpm).
3. Determinar _DO600 del cultivo usando un espectrofotómetro y una cubeta estándar (longitud de recorrido: 1 cm).
4. Calcular el volumen (V) de la cultura necesaria para preparar 20 ml de inóculo con OD _{600 (inóculo)} de 0,1 en chelexed medios Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) ⁹ usando la fórmula: [V = 20 ml * 0,1 / OD _{600 (cultivo )]}
   Nota: Referencia 9 proporciona detalles sobre la preparación cRPMI.
   1. Añadir el volumen de cultivo calculado (desde arriba) a un tubo de centrífuga y las células de pellets por centrifugación durante 1 min a 10.000 x g. para prepare inóculo biofilm, aspirar el pellet de células medio de cultivo y se resuspenden en 20 ml pasado cRPMI.
5. Verter inóculo en un depósito de 25 ml.
6. Retirar con cuidado la tapa de una placa de PEG de 96 pocillos estériles tirando de él hacia arriba.
   Nota: Se debe tener cuidado de no contaminar las clavijas que cuelgan por debajo de la tapa. La tapa se puede colocar boca abajo sobre una superficie limpia dentro de una cabina de bioseguridad.
7. Usando una pipeta multicanal l 200, añadir 125 l de inóculo a cada pocillo de las filas A a G de la placa inferior.
8. Llenar medio cRPMI 125 l estéril en cada pocillo de la fila H como un control de esterilidad.
9. Tome la clavija-tapa y mantenerla por encima del fondo del plato con las clavijas hacia abajo. alinee con cuidado las clavijas individuales con sus respectivos pozos. Evitar el contacto físico entre la placa y las clavijas. Una vez alineado, baje la tapa con cuidado hacia abajo. Evitar desajustes como reajustes realizados después de las clavijas han tocado la placa inferior puede contcontroles de esterilidad aminar en la fila H.
10. Sellar la tapa a la placa con película de parafina para evitar la evaporación y colocar en una bolsa de plástico con cierre, sellado herméticamente. Mantenga el volumen de aire en la bolsa lo más bajo posible para minimizar la evaporación.
11. Se incuba sin agitación a 37 ° C durante 48 horas en un incubador de _CO2 al 5%.
    Nota: 48 h de crecimiento ha sido óptima para S. aureus, pero variará basado en el organismo utilizado.
    Nota: Aunque la incubación estática es un buen punto de partida para optimizar el ensayo, agitando suavemente a 150 rpm en un agitador de microplacas es una posible variación que pueden mejorar la formación de biopelículas de algunos S. aureus aislados.

2. Preparación de la placa de biofilm Challenge

1. En el día del desafío biopelícula tomar una placa de 96 pocillos fresca y añadir 100 l de cRPMI, se equilibraron a temperatura ambiente, a cada pocillo de las filas B a H. Para evitar inconsistencias en los resultados, utilizar una placa de 96 pocillos que tiene capacidad para 200 lde medios de comunicación cuando las clavijas están en el interior, y cuenta con pozos con dimensiones idénticas a las de la placa de iniciación biofilm.
2. Diluir hasta 4 compuestos de ensayo por separado en 1.0 ml de cRPMI a 2x la concentración final deseada, con el fin de dar cuenta de una dilución final en el paso 2.7.
   Nota: Un buen punto de partida es 8 veces por encima de la concentración inhibitoria de las células planctónicas.
3. Añadir 200 l de compuesto 1 en los pocillos A1 a A3, compuesto 2: pocillos A4 a A6, el compuesto 3 en pozos A7 a A9 y el compuesto 4 en pocillos A10 a A12.
4. Diluciones seriadas de los compuestos de ensayo utilizando una pipeta multicanal y la transferencia de 100 l de la fila A a la fila B y mezclar.
5. De esa manera, continúe el traspaso de 100 l pozo en pozo. Mezclar después de cada traslado y la parada en la fila F.
6. Después de mezclar, expulsar a 100 l de la fila F en un contenedor de residuos. No transfiera cualquier líquido a las filas G y H.
7. Añadir 100 l de cRPMI a cada pocillo de la placa usando una pipeta multicanal allevar el volumen a 200 l. Ver Figura 1 para la disposición final de la placa.

3. El biofilm Challenge

1. Añadir 200 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una placa de 96 pocillos estéril fresco que cuenta con pozos con dimensiones idénticas a las de la placa de iniciación biofilm.
2. Retire la bolsa de plástico y lámina de parafina de la placa se incubó la iniciación de biopelículas.
3. Levante la tapa hacia arriba. Evitar el contacto entre las clavijas y el fondo del plato, ya que podría dañar la biopelícula. Mantenga la parte inferior para su posterior análisis OD ₆₀₀ (véase la sección 3.8).
4. Enjuague las células planctónicas mediante la colocación de la clavija-tapa sobre la placa que contenía PBS (del paso 3.1). Sumergir las clavijas durante 5 segundos, sacar de la PBS, y se sumerja de nuevo, teniendo cuidado de no golpear las clavijas contra los lados así.
5. Coloque la clavija-tapa se enjuaga en la placa de desafío. Evitar el contacto innecesario entre las clavijas y la placa inferior, ya que dañará la biopelícula que lleva aresultados inconsistentes.
6. La placa del sello con la película de parafina y colocar en una bolsa de plástico con cierre, como se describe en el paso 1.10.
7. Se incuba la placa sin agitación durante 24 horas a 37 ° C en una incubadora de _CO2 al 5%.
8. Tomar parte inferior de la placa de biofilm iniciación de 3,3. Volver a suspender las bacterias en cada pocillo usando una pipeta multicanal y medir el diámetro exterior ₆₀₀ con un lector de microplacas adecuado para confirmar el crecimiento se produce en todos los pozos, pero los controles de esterilidad en la fila H.

4. Determinación de biopelículas

1. Use un lector de placas equipado con una cámara de incubación y capaz de tomar lecturas de fluorescencia cinéticos para la detección de resazurina conversión. Configurar una medición de fluorescencia cinética de 24 horas usando una excitación de 530 nm y 590 nm de emisión.
2. Ajuste la temperatura de la cámara a 37 ° C y tiene la placa de leer cada 20 minutos. Ajuste el lector de placas para medir desde la parte inferior de la placa de acuerdo con instrucciones del fabricanteciones.
3. Preparar la placa de lavado mediante la adición de 200 l de PBS con una pipeta multicanal a una placa de 96 pocillo estéril.
4. Preparar medio de recuperación de biopelícula mediante la adición de 400 l de 0,8 mg / ml de solución madre de resazurina a 20 ml de medio cRPMI a una concentración final de 16 mg de resazurina / ml.
   Nota: La resazurina es un irritante conocido piel. Use una bata de laboratorio, gafas protectoras contra salpicaduras y guantes durante la manipulación. CRPMI como el medio de recuperación de biopelícula se utilizó ya que proporciona la señal de fondo más baja, pero puede ser sustituido por medios de Mueller Hinton si es apropiado.
5. Añadir 150 l de medio de recuperación de la biopelícula con una pipeta multicanal a cada pocillo de una placa de 96 pocillos fresca.
6. Transferencia placa desafío de la incubadora en una cabina de bioseguridad y retirar con cuidado bolsa de plástico y lámina de cierre.
7. Retire la clavija-tapa de la placa de desafío y enjuagar las células planctónicas en PBS como se describe en 3.4. Mantenga la parte inferior de la placa de desafío para la posterior OD ₆₀₀ analisis (véase 4.10).
8. Después de aclarar, coloque la clavija-tapa en la parte inferior placa que contiene el medio de recuperación de biopelícula.
9. Envolver el lado de la placa con película de parafina, teniendo cuidado de no obstruir el fondo de los pocillos de perímetro. Inmediatamente después de concluir la placa, colocarla en el lector de placas y empezar una lectura cinética durante un período de 24 horas, iniciando el hecho previamente resazurina protocolo cinética desde el paso 4.1.
10. Para cuantificar el crecimiento de las células planctónicas que pueden o no pueden ocurrir durante desafío, leer la OD ₆₀₀ de toda la placa inferior desafío usando un lector de micro placa. Siga las instrucciones dadas en el paso 3.8.
    Nota: resuspender cuidadosamente el contenido de cada pocillo como células vertimiento de la biopelícula tienden a crecer en grupos en la parte inferior del pozo. Cualquier burbuja dentro del pozo serán fuertemente interferir con las lecturas de DO _{a 600} y deben ser evitadas o eliminadas antes de la lectura.

Resultados

El ensayo de la resazurina es suficientemente sensible para detectar con fiabilidad muy pocas células viables capaces de replicarse en medio libre de fármaco después de la exposición. En esta metodología, se define el biofilm erradicar la concentración mínima como la concentración más baja a la que no se observa una conversión de resazurina dentro de las 24 horas. El ensayo se basa en la resazurina moléculas oxidativas que se encuentran en las células metabólicamente activas que conviert...

Discusión

Aquí, hemos descrito un ensayo de biopelícula modificado para determinar la actividad de los inhibidores de la prueba sobre S. biopelículas aureus que se centran en el estado metabólico de las células del biofilm asociado. Mientras que la iniciación de la biopelícula se describe y procedimientos reto recomendaciones del fabricante sobre todo imitaba, el uso de resazurina tinte para detectar y cuantificar las células del biofilm-asociado que sobreviven a un desafío inhibidor de 24 hr simplifica enormeme...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Mueller-Hinton Medium	Oxoid	CM0405	Siga las recomendaciones del fabricante
RPMI-medium	Corning	17-105-CV
CRPMI	Ref 9		RPMI-1640 chelexado medio durante 1 hora con resina Chelex 100 y luego suplementado con 10% sin chelexed RPMI-1640
Chelex 100 Resina	Bio Rad	142-2822
MBEC-placas	Innovotech	19111
Resazurin Sal de Sodio	Sigma	R7017	800 µ g/ml en agua desionizada        Plataforma de agitación de microplacas estériles de filtro
	Heidolph Titramax 1000
Cytation 3 Lector de placas	Biotek
Gen5 software	Biotek		Registro y análisis de la conversión de resazurina
Neocuproína	Sigma	N1501	preparar 10 mM de stock en etanol 100%, almacenar a -80 º C
Sulfato de cobre	Acros Organics	7758-99-8	prepare una solución madre de 100 mM en agua, almacene a 4 º C
Cu-Neocuproína	fabricación		Generada mediante la mezcla de molaridades iguales de neocuproína y sulfato de cobre. La mezcla se diluyó en medio CRPMI hasta la concentración deseada.
Gentamicina	Sigma	G3632-1G

de propia