Demostramos el procedimiento para la inoculación intratraqueal de Haemophilus influenzae en las vías respiratorias inferiores de ratones. Se trata de una herramienta muy útil para estudiar las vías de señalización que regulan la inflamación de las vías respiratorias en modelos de ratón.
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Artículo de método
Administración intra-traqueal de
En este artículo
Resumen
Resumen
A continuación, describimos un procedimiento detallado de manera eficiente y entregar directamente Haemophilus influenzae en las vías respiratorias inferiores de los ratones. Demostramos el procedimiento para la preparación de H. inóculo influenzae, la instilación intratraqueal de H. influenzae en el pulmón, la recogida de fluido de lavado bronco-alveolar (BALF), el análisis de las células inmunes en el BALF, y el aislamiento de ARN para análisis de expresión génica diferencial. Este procedimiento puede ser usado para estudiar la respuesta inflamatoria pulmonar a cualquier bacteria, virus u hongos. instilación traqueal directa se prefiere sobre todo sobre los procedimientos intranasal o inhalación de aerosol, ya que ofrece más eficiente el inóculo bacteriano en el tracto respiratorio inferior con menos ambigüedad.
Introducción
La inflamación es un mecanismo inmunológico fundamental en la defensa contra agentes infecciosos. Promueve la erradicación de patógenos y la reparación del tejido dañado. También facilita la recuperación a un estado normal y saludable 1. Sin embargo, la inflamación dysregulated a menudo conduce a enfermedades inflamatorias crónicas 2. Inflamación de las vías respiratorias es un disparador inicial para diferentes enfermedades pulmonares tales como enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma y fibrosis pulmonar 3.
El Haemophilus influenzae no tipificable (no encapsulada) (NTHi) se asocia co....
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Protocolo
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Baylor Research Institute.
1. El cultivo no tipificable de Haemophilus influenzae (NTHi) y preparar el inóculo
- Placa NTHi en una placa de agar chocolate y mantener la placa boca abajo en un incubador de CO2 humidificado durante la noche a 37 ° C y 5% de CO2. El siguiente día, cultivar las bacterias en caldo de infusión de corazón cerebro. A continuación, añadir 1 ml del caldo en un tubo estéril de 1,5 ml.
- Centrifugar a 4000 xg durante 5 min a temperatura....
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Resultados
Instilación intratraqueal resultó en un marcado aumento del número de leucocitos en el BALF (Figura 1A, panel izquierdo) de la instalación con solución salina. El análisis recuento diferencial de los leucocitos mostró claramente el aumento de la infiltración de neutrófilos (Figura 1, panel derecho). El análisis FACS de las células en el BALF confirmó además el aumento del número de neutrófilos (Figura 1B). El análisis histológico de las .......
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Discusión
En este documento, se describe un procedimiento único y mínimamente invasivo para inocular los pulmones de ratones con un patógeno pulmonar bacteriana. Se demuestra que este procedimiento puede ser usado para estudiar la función de genes diferentes que utilizan ratones que son deficientes en genes de vías de señalización inflamatorias. Este procedimiento también se puede utilizar para estudiar las respuestas inflamatorias a infecciones pulmonares víricas y fúngicas. Las ventajas de este procedimiento con respecto a otro.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Carson Harrod por la lectura crítica del manuscrito. También damos las gracias al Sr. Minghui Zeng y a los Dres. Mahesh Kathania y Prashant Khare por sus contribuciones. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Sociedad Americana del Cáncer (beca de investigación, 122713-RSG-12-260-01-LIB) y el Centro de Cáncer Sammons (subvención del Proyecto Piloto) a K. Venuprasad.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Plato de agar chocolate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrosa Anhidra | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparina | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Hábil solución rápida | Sigma | GS500-500ML | |
| Aguja de jeringa 20/26G | BD( | REF305115/175) | |
| Jeringa Iml | BD | 309602 | |
| 20GA | BD | REF | |
| Tijeras de disección, rectas, de 10 cm de largo | kentscientific | INS600393 | |
| Pinzas de iris, dentadas, de 10 cm de largo | kentscientific | ||
| Pinza #5 Acero inoxidable, 11cm de largo | kentscientific | ||
| 10% Formalina | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarosa | peqlab | 35-1020 | |
| 5ml poliestireno tubos de fondo redondo | BD | REF 352058 | |
| 1,5 ml Tubos de microcentrífuga | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Motor de pellets (homogeneizador de tejidos) | Sigma | Z359971-1EA | |
| Placas de microtitulación de 96 pocillos V inferior | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Dilución de trabajo 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Dilución de trabajo 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Vivo/Muerto kit de tinción de células muertas Aqua fijable | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/ CD32 FcBlock | BD 553142 | ||
| Tubos Facs de poliestireno tubo de fondo redondo | BD | 352052 | |
| Formaldehído | Polyscience | 4018 |
Referencias
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
- Barnes, P. J.
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Reimpresiones y permisos
