Este protocolo está preparado para compartir nuestro método de aislamiento de células endoteliales coronarias de ratón con fines de obtención de imágenes o para realizar experimentos de biología molecular.
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Artículo de método
Aislamiento de células endoteliales de ratón coronaria
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células endoteliales revisten la pared interna de los vasos sanguíneos y juegan un papel importante en la regulación del tono vascular, la permeabilidad vascular y la formación de nuevos vascular. disfunción de la célula endotelial está implicada en el desarrollo y la progresión de muchas enfermedades cardiovasculares que incluyen la enfermedad cardíaca isquémica. Para examinar la función y caracterización de células endoteliales coronarias, aislamiento de células es el primer paso y requiere alta pureza y cantidad para llevar a cabo los experimentos posteriores. Este protocolo describe un método eficaz para aislar las células endoteliales coronarias de ratón adulto. El corazón de ratón se diseca y picada en trozos pequeños. Después de la digestión del corazón usando dispasa y colagenasa II, las células se lavaron y se incubaron con perlas magnéticas que están conjugados con el anticuerpo anti-CD31. Las perlas con las células endoteliales son lavados varias veces y están listos para usar en diversas aplicaciones, incluyendo formación de imágenes y EXPERIME biológica molecularNTS. Aislamiento eficaz rinde aproximadamente 10 4 células por un solo corazón con más del 90% de pureza.
Introducción
Los modelos de ratón de diversas enfermedades cardiovasculares y los trastornos metabólicos tienen cambios fisiológicos y moleculares que son similares a los encontrados en pacientes. Por otra parte, la alteración genética de los ratones es una poderosa herramienta que nos permite investigar el papel patogénico de genes específicos en el desarrollo y progresión de enfermedades. Hoy en día, gen-knock-in célula de tipo específico o ratones salida privado se generan fácilmente en muchos laboratorios y la medición de los niveles de ARNm y de proteína en tipos específicos de células es el primer paso en la determinación de si los ratones fueron verdaderamente genéticament....
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Protocolo
La investigación en ratones fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Universidad de Arizona y se llevó a cabo de acuerdo con el Instituto Nacional de Salud (NIH) Directrices.
NOTA: Las secciones 1, 2 y 3 deben llevarse a cabo el día antes del experimento como configuración.
1. Preparación de Soluciones
- tampón de CD31 (50 ml)
- Añadir 50 ml de 1 x tampón fosfato salino (PBS) a un tubo de 50 ml. Pesar 0,05 g Albúmina de suero bovino (BSA) y 0,037 g de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y se añade al tubo de 50 ml y colocar el tubo de girar durante aproximadamente 1 h hasta que el pol....
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Resultados
El éxito en el aislamiento de las células endoteliales coronarias de un corazón de ratón produce normalmente alrededor de 10 4 células con más del 90% de pureza con una forma de adoquines. Para una población pura de células endoteliales, se debe tener cuidado durante todo el protocolo para asegurar un ambiente estéril libre de cualquier contaminación. La aparición de células alargadas o células ampliadas dentro de la población indica contaminación con otros tipos de células, c.......
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Discusión
Las células endoteliales más ampliamente utilizado en la investigación son células humanas endoteliales de vena umbilical (HUVEC) debido a su comodidad y facilidad de cultivo. Sin embargo, una gran cantidad de investigación requiere la disponibilidad de un modelo fisiológico alcanzado por el aislamiento de células endoteliales de otros órganos específicos 10. Las células endoteliales forman una población muy minoritaria de las células en el tejido del corazón; su aislamiento y el cultivo puede llegar a ser mu.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la subvención de los Institutos Nacionales de Salud (HL115578 de A. Makino).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher SH3026801 | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Bicarbonato de sodio | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucosa | Sigma | G7021-1KG | |
| DynaBeads perlas de IgG para ratón | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Rata anti-ratón CD31 Anticuerpo | BD Biosciences | 550274 | |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispasa (Proteasa Neutra) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Colagenasa Tipo II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | I3021-50 ml | |
| Cóctel de inhibidores de la fosfatasa | Sigma | P0044-1ml | |
| Cóctel de inhibidores de la proteasa | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparina | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valina | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | Corning 356006 | ||
| Penicilina/Estreptomicina | Fisher/Mediatech | MT-30-002-CI |
Referencias
- Michiels, C. Endothelial cell functions. J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).
- Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. Cells in focus: endothelial cell. Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).
- Cines, D. B., et al.
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Reimpresiones y permisos
