La fibrosis sostenida con depósito excesivo de proteínas de la matriz extracelular conduce a la cirrosis. El abuso del alcohol es una de las principales causas de enfermedad hepática grave. Establecimos un modelo de hígado fibrótico de pez cebra inducido por etanol para estudiar los mecanismos y estrategias de promoción de la regeneración de hepatocitos tras la lesión inducida por el alcohol.
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Artículo de método
Desarrollo de un Modelo de hígado fibrótico inducida por etanol en el pez cebra para el Estudio de células progenitoras mediada por la regeneración de hepatocitos
En este artículo
Resumen
Resumen
< clase p = 'jove_content'>La fibrosis hepática sostenida con continuación de la acumulación de proteínas de la matriz extracelular (MEC) resulta en la pérdida de la competencia celular del hígado, lo que conduce a cirrosis con disfunción hepatocelular. Entre las múltiples lesiones hepáticas, el abuso del alcohol puede provocar problemas de salud importantes, como insuficiencia hepática y carcinoma hepatocelular. Sin embargo, la identidad de las fuentes celulares endógenas que regeneran los hepatocitos en respuesta al alcohol no se ha investigado adecuadamente. Además, pocos estudios han modelado eficazmente la regeneración de los hepatocitos a partir de lesiones inducidas por el alcohol. Recientemente informamos sobre el establecimiento de un modelo de hígado fibrótico inducido por etanol (EtOH) en pez cebra en el que las células progenitoras hepáticas (HPC) dieron lugar a hepatocitos tras la pérdida casi completa de hepatocitos en presencia de estímulos fibrogénicos. Además, a través de cribados químicos utilizando este modelo, identificamos múltiples moléculas pequeñas que mejoran la regeneración de los hepatocitos. En este trabajo se describen en detalle los procedimientos para desarrollar un modelo de hígado fibrótico inducido por EtOH y para realizar cribados químicos utilizando este modelo en pez cebra. Este protocolo será una herramienta crítica para delinear los mecanismos moleculares y celulares de cómo se regeneran los hepatocitos en el hígado fibrótico. Además, estos métodos facilitarán el descubrimiento potencial de nuevas estrategias terapéuticas para la enfermedad hepática crónica in vivo.
Introducción
A pesar de la notable capacidad de regeneración de los hepatocitos 1, que son el principal tipo de células de parénquima del hígado, insuficiencia hepática crónica afecta esta capacidad, dando lugar a células progenitoras hepáticas (HPC) la regeneración dependiente de 2.
Daño hepático crónico se deriva principalmente de abuso de alcohol, el virus de la hepatitis C crónica (VHC) 3 y enfermedad de hígado graso no alcohólica (EHNA) 4. Esto conduce a la fibrosis hepática sostenida, que se asocia con la acumulación de proteínas de la matriz extracelular (ECM). La persistencia de la acumulación de ECM....
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Protocolo
El pez cebra fueron criados y criados utilizando un protocolo estándar que cumpla con los criterios de los Institutos Nacionales de Salud y aprobadas por el Instituto de Tecnología de Georgia Institucional Cuidado de Animales y el empleo.
1. Preparación de soluciones
- Preparar el agua de huevo 20 L (utilizado indistintamente con 'medio de embrión') para mantener embriones de pez cebra / larval. Disolver 1,5 g de CaSO 4 y 6 g de sal del mar del océano instantánea en 250 ml de agua destilada. Verter en un bidón lleno de 20 litros de agua destilada y agitar.
- Preparar 1 litro (PTU) solución madre-2-tiourea 1-fenil (20x). Dis....
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Resultados
Figura 1 muestra el desarrollo de un modelo de hígado fibrótico EtOH inducida en larvas de pez cebra. Para optimizar un protocolo para la exposición de las larvas de pez cebra para EtOH, se evaluó la toxicidad primera EtOH. 2,5 días post-fertilización (DPF) larvas fueron expuestas a la concentración de EtOH 1%, 1,5% o 2% durante 24 horas seguido de un 24 hr EtOH tratamiento concurrente / MTZ. La exposición al 2% EtOH causó una mortalidad elevada, mientras que casi todas .......
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Discusión
Se observó la regeneración de hepatocitos HPC mediada en los hígados se recuperan con tratamiento MTZ EtOH /, lo que sugiere que incluso en presencia de una cantidad sustancial de proteínas ECM, incluyendo el tipo fibrilar de colágeno I, las HPCs conservan su competencia para regenerar como hepatocitos. La única MTZ-tratamiento no aumentó la deposición de proteínas ECM significativamente, mientras que el único tratamiento EtOH no indujo la activación HPC 15. Al utilizar el tratamiento combinado EtOH / MTZ, he.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del GTEC (2731336 y 1411318), el NIH (K01DK081351), y la NSF (1.354.837) a CHS Agradecemos Alem Giorgis para la lectura crítica del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sulfato de calcio hemihidrato (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Sulfato de magnesio (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| Ácido 1,4-piperazinadietanosulfónico (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)- N,N,N′,N′ -ácido tetraacético (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Etanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 prueba |
| de formaldehído | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazol (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-fenil-2-tiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Éster etílico de ácido 3-aminobenzoico (Tricaína) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | comprimido Amresco | E404 | Disolver un comprimido con 100 ml de agua destilada |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Albúmina sérica bovina | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Low-melting agarosa | Amresco | BP165 | |
| Biblioteca de compuestos de señalización de células madre | Selleck Chemicals | L2100 | 10 Stock de mM en DMSO |
| ActiProbe-1K Library | Timtec | ActiProbe-1K | 10 mM stock en DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Disolver con DMSO a 10 mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Disolver con DMSO a 10 mM |
| Anticuerpo anti-colágeno I | Abcam | ab23730 | Uso a escala 1:100 para inmunotinción, reacciona con peces |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-conejo IgG (H+L) | Sondas moleculares | A31573 | Uso a 1:200 para inmunotinción |
| Medios de montaje (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm Placa de Petri | VWR | 25384-088 | |
| 24 pocillos placa | VWR | 10062-896 | |
| Pinza | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Corredera de vidrio | VWR | 48312-003 | 75x25 mm |
| Cubreobjetos | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Envoltura de plástico | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Papel de aluminio | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrótomo | Leica | VT1000 S | |
| Microscopio estereoscópico | Leica | M80 | |
| Microscopio de efluorescencia | Leica | M205 FA | |
| Microscopio Confocol | Zeiss | LSM700 |
Referencias
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
- Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J.
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Reimpresiones y permisos
