Desarrollo y caracterización de In Vitro Red de microvasos y mediciones cuantitativas de endotelial [Ca 2+] i Y la producción de óxido nítrico

Summary

Las células endoteliales primarias de la vena umbilical humana (HUVECs) se cultivaron hasta la confluencia dentro de un dispositivo de red microfluídica. Se ilustró la unión de las células endoteliales y las distribuciones de F-actina, y se cuantificaron en tiempo real los cambios en la concentración de calcio intracelular y la producción de óxido nítrico en respuesta al trifosfato de adenosina (ATP) a nivel de células individuales.

Abstract

Las células endoteliales (EC) que recubren las paredes de los vasos sanguíneos in vivo están constantemente expuestos a fluir, pero ECs cultivadas a menudo se cultivan en condiciones estáticas y exhiben un fenotipo pro-inflamatoria. Aunque el desarrollo de dispositivos de microfluidos ha sido abrazado por los ingenieros de más de dos décadas, sus aplicaciones biológicas siguen siendo limitados. Un modelo in vitro de microvasos fisiológicamente más relevantes en validada por aplicaciones biológicas es importante para avanzar en el campo y salvar las diferencias entre in vivo e in vitro estudios. A continuación, presentamos los procedimientos detallados para el desarrollo de la red de microvasos cultivan utilizando un dispositivo de microfluidos con una capacidad de perfusión a largo plazo. También demuestran sus aplicaciones para mediciones cuantitativas de los cambios inducidos por agonistas en EC _I y el óxido nítrico (NO) [Ca ^2+] en tiempo real utilizando confocal y microscopía de fluorescencia convencional. La red de microvasos formadotrabajo con perfusión continua mostró uniones bien desarrollados entre los CE. VE-cadherina distribución estaba más cerca de la observada en los microvasos intacto que monocapas CE estáticamente cultivadas. ATP-indujo aumentos transitorios en la CE [Ca2 ^+] _i y la producción de NO se midió cuantitativamente en los niveles de células individuales, que haya validado la funcionalidad de los microvasos cultivadas. Este dispositivo de microfluidos permite ECs para crecer bajo un bien controlado, el flujo fisiológicamente relevante, lo que hace que el entorno de cultivo celular más cercano a in vivo que el de los cultivos 2D convencionales, estáticas. El diseño de la red de microcanales es altamente versátil, y el proceso de fabricación es simple y repetible. El dispositivo se puede integrar fácilmente en el sistema microscópico confocal o convencional que permite imágenes de alta resolución. Lo más importante, ya que la red de microvasos cultivadas puede estar formado por ECs humanos primarios, este enfoque servirá como una herramienta útil para investigar cómopatológicamente componentes sanguíneos alterados a partir de muestras de pacientes humanos afectan a los EC y dar una idea de los problemas clínicos. También puede ser desarrollado como una plataforma para la detección de drogas.

Introduction

Las células endoteliales (EC) que recubren las paredes de los vasos sanguíneos in vivo están constantemente expuestos a fluir, pero ECs cultivadas a menudo se cultivan en condiciones estáticas y exhiben un fenotipo pro-inflamatoria ^1,2. La tecnología microfluídica permite un fluido controlada con precisión a través de una microescala geométricamente limitados (sub-milímetro) ^los canales ^3, lo que proporciona la oportunidad para que las células cultivadas, especialmente para ECs vascular, creciendo bajo condiciones de flujo deseadas. Estas características hacen que las condiciones de cultivo celular in vivo más cerca ....

Protocol

1. La fabricación de dispositivos de microfluidos

1. La fabricación estándar de fotolitografía de un SU-8 maestro molde 50
   1. Limpiar la oblea de silicio antes de spin-coating. Enjuagar una oblea de silicio de 2 pulgadas desnudo con acetona durante 15 min seguido de alcohol isopropílico (IPA) para 15 min. Deshidratar la oblea colocándolo en una placa caliente a 150 ° C durante 1 hr. Después de la deshidratación, enfriar la oblea a temperatura ambiente.
   2. Spin-capa de la oblea de silicio con SU-8 fotoprotector. Añadir 2 ml SU-8 fotoprotector sobre la oblea. Rampa de la oblea a 500 rpm a 100 rpm de aceleración / s durante 10 s, seguido de 1.000 rp....

Results

Esta sección muestra algunos de los resultados obtenidos con la red de microvasos cultivaron desarrollado con este protocolo. El patrón de microcanales es una red de ramificación de tres niveles (Figura 1A). En este diseño, unas 159 micras de ancho ramas del canal madre en dos canales de 126 micras de ancho, y las ramas de nuevo en cuatro canales de 100 micras de ancho hija. Una simulación numérica 3D se realizó para estimar la distribución de esfuerzo cortante bajo el c.......

Discussion

En este artículo, se presentan los protocolos detallados para el desarrollo de la red de microvasos culta, la caracterización de los cruces de la CE y el citoesqueleto de actina F de distribución, y las mediciones cuantitativas de la CE [Ca2 ^+] _i y la producción de NO usando un dispositivo de microfluidos. El dispositivo de microfluidos perfundido proporciona un modelo in vitro que permite un cierre de simulación de las geometrías microvasculares in vivo y las condiciones de.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
Acetona	Fisher Scientific	A929
Punzón de biopsia	Miltex	33-31 AA
Albúmina bovina	MP Biomedicals 810014
Extracto de cerebro bovino (BBE)	Lonza	CC-4098
Cubreobjetos	Fisher Scientific	12-542C
DAF-2 DA	Calbiochem	251505
Dextrano	Sigma-Aldrich	31390
Burro anti-Cabra IgG (H+L) Anticuerpo secundario	technologies	A-11055
DPBS, sin calcio, sin magnesio	Gibco	14190-250
DRAQ5 (tinción de núcleos)	Tecnología de señalización celular	4084
Suplemento de crecimiento de células endoteliales (ECGS)	Sigma-Aldrich	E2759-15MG
Suero fetal bovino	Gibco	16000-044
Fibronectina	Gibco	PHE0023
Fluo-4 AM	Life technologies	F-14201
Gelatina de piel porcina	Sigma-Aldrich	G1890-100G
Gentamicina (50 mg/ml)	Gibco	15750-078
Cubreobjetos de vidrio	Fisher Scientific	12-548B
Pippette de vidrio Pasteur	VWR	14672
Sal sódica de heparina de mucosa intestinal porcina	Sigma-Aldrich	H3393-10KU
HEPES Solución salina tamponada	Lonza	CC-5024
Células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC)	Lonza	CC-2517
Alcohol isopropílico (IPA)	VWR	89125
L-Glutamina (200 mM)	Gibco	25030-081
Solución de Ringer de Mamífero Ingrediente
NaCl (132 mM)	Fisher Scientific	S671-3
KCl (4.6 mM)	Fisher Scientific	P217-500
CaCl2 · 2H2O (2.0 mM)	Fisher Scientific	C79-500
MgSO4 · 7H2O (1,2 mM)	Fisher Scientific	M63-500
Glucosa (5,5 mM)	Fisher Scientific	BP350-1
NaHCO3 (5,0 mM)	Fisher Scientific	S233-500
Hepes Salt (9,1 mM)	Research Organics	6007H
Hepes Acid (10,9 mM)	Research Organics	6003H
MCDB 131 Tecnologías de vida del medio de cultivo		10372-019
Ciencias de la microscopía electrónica	con paraformaldehído	15710
Faloidina (tinción con f-actina)	Sigma-Aldrich	P1951
Solución salina tamponada con fosfato	Life technologies	14040-133
Polidimetilsiloxano (PDMS)	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
Bisturí	Exel Int	29552
Cinta adhesiva		3M 34-8711-3070-3
Oblea de silicio	VWR	14672
SU-8 fotorresistente	MicroChem	SU-8 2050 Y111072
Revelador SU-8	MicroChem	Y020100
matraces de cultivo de tejidos	Sigma-Aldrich	Z707503-100EA
Triton X-100	Chemical Book	T6878
Solución neutralizadora de tripsina	Gibco	R-002-100
Solución de tripsina/EDTA (TE)	Gibco	R-001-100
Tubo	Cole-Parmer	Tubo de microperforación de PTFE, 0.012" de diámetro interno x 0.030" de diámetro exterior
VE-cadherin	Santa Cruz Biotechnology	SC-6458
Nombre del equipo	Company	Número de catálogo	Comentarios/Descripción
Biosafety Campana laminar	NuAire	NU-425 Clase II, Tipo A2
Cámara CCD	Hamamatsu	ORCA
Microscopio confocal	Leica	TCS SL
Desecador	Bel-Art	F42022
Placa calefactora	Wenesco	HP-1212
Incubadora	Forma Scientific	3110
Horno Isotemp	Barnstead	3608-5
Litografía banco	Karl Suss	MA6 Contacto Litografía
Microscopio óptico	Nikon	L200 ND & Diaphod 300
Obturador para la cámara CCD	Sutter Instrument Lambda	10-2
Limpiador	plasma PVA TePla/Harrick plasma	M4L/PDC-32G
Recubrimiento por centrifugado	Brewer Science	Cee 200X
Sistema de bomba de jeringa	Harvard Apparatus 703005
Nombre del software	Empresa	Número de catálogo	>Comments/Description
CAD software de simulación Autodesk	AutoCAD	2015
CFD	COMSOL COMSOL	Multiphysics 4.0.0.982
Adquisición y análisis de imágenes para la producción de NO	Imagen universal	Metafluor