Las técnicas de aclarado óptico están revolucionando la forma en que se visualizan los tejidos. En este informe describimos las modificaciones del protocolo original Clear-Lipid-Exchange-Acrylamide-Hibridado-Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) que produce resultados más consistentes y menos costosos.
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Artículo de método
Clearing óptico del sistema nervioso central del ratón Utilizando CLARITY pasiva
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Resumen
Resumen
Tradicionalmente, la visualización de tejidos ha requerido que el tejido de interés sea seccionado y visualizado en serie, sometiendo cada sección de tejido a deformaciones no lineales únicas, lo que dificulta drásticamente la capacidad de evaluar la morfología, distribución y conectividad celular en el sistema nervioso central (SNC). Sin embargo, las técnicas de aclaramiento óptico están cambiando la forma en que se visualizan los tejidos. Estos enfoques permiten indagar profundamente en las preparaciones de órganos intactos, proporcionando una gran comprensión de la organización estructural de los tejidos en la salud y la enfermedad. Técnicas como Clear Lipid-influid-Exchange-Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) logran este objetivo al proporcionar una matriz que se une a biomoléculas importantes al tiempo que permite que los lípidos que dispersan la luz se difundan libremente. La eliminación de lípidos, seguida de la coincidencia del índice de refracción, hace que el tejido sea transparente y se visualice fácilmente en 3 dimensiones (3D). Sin embargo, la limpieza electroforética de tejidos (ETC) utilizada en el protocolo CLARITY original puede ser difícil de implementar con éxito y el uso de una solución patentada de coincidencia de índice de refracción hace que sea costoso usar la técnica de forma rutinaria. Este informe demuestra la implementación de un protocolo de limpieza óptica simple y económico que combina CLARITY pasivo para mejorar la integridad del tejido y 2,2′-tiodiethanol (TDE), una solución de coincidencia de índice de refracción descrita anteriormente.
Introducción
La capacidad de obtener imágenes de estructuras neuroanatómicas completas es inmensamente valiosa para comprender el cerebro en la salud y la enfermedad. Tradicionalmente, las imágenes 3D han requerido el corte de tejido para proporcionar la resolución axial y visualizar estructuras anatómicas profundas. Este enfoque puede producir conjuntos de datos de alta resolución, pero requiere técnicas sofisticadas de reconstrucción de imágenes y es muy laborioso. Como resultado, se ha limitado a la obtención de imágenes de pequeños volúmenes de tejido1-3. El corte óptico, por otro lado, es muy adecuado para la creación de imágenes 3D de alta resolución de tejidos ma....
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Protocolo
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con el Cuidado de Animales institucional y el empleo directrices del Comité (IACUC). ratones Thy1-YFP, PLP-EGFP y PV-tdTomato se utilizaron para estos experimentos, pero cualquier ratones que expresan las proteínas fluorescentes se pueden borrar y la imagen con éxito.
1. Preparación del tejido
Precaución: El paraformaldehído (PFA) y acrilamida son tóxicos e irritantes. Realizar experimentos que utilizan estos reactivos en una campana de humos y con equipo de protección personal (bata de laboratorio, guantes y protección para los ojos).
- Sacrificar al an....
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Resultados
La visualización de la organización estructural del cerebro es fundamental para la comprensión de cómo la morfología y la conectividad afectan la función cerebral en la salud y la enfermedad. técnicas de compensación ópticas hacen posible poblaciones celulares imagen en 3D en los tejidos intactos, que nos permite estudiar la morfología y la conectividad de manera cohesiva.
Los ratones que expresan proteínas fluorescentes impul.......
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Discusión
compensación pasiva de los tejidos de hidrogel incrustado (claridad pasiva) es un método sencillo y barato para la limpieza de piezas grandes de tejido. Este enfoque no requiere un equipo dedicado y se puede realizar fácilmente en un agitador de temperatura controlada. En el lapso de unas pocas semanas, los tejidos, incluso grandes, altamente mielinizados, como todo un cerebro o la médula espinal, llegarán a ser transparentes y adecuados para la microscopía. A pesar de que este informe se ha centrado en la limpieza de t.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado generosamente por los Institutos Nacionales de / Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NIH / NINDS) y la subvención 1R01NS086981 Conrad N. Hilton Foundation Salud. Agradecemos al Dr. Laurent Bentolila y el Dr. Mateo Schibler por su valiosa asistencia con microscopía confocal. Agradecemos a todos los que han contribuido al foro CLARITY (http://forum.claritytechniques.org). Agradecemos especialmente el Dr. Karl Deisseroth para la apertura de su laboratorio para enseñar esta técnica fascinante. Los autores están muy agradecidos por el generoso apoyo de la Organización de Investigación Médica Brain Mapping,....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10x solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Fisher | BP399-1 | tampones |
| 32% paraformaldehído (PFA) | Electrónica Microscopy Sciences | 15714-5 | perfusión e hidrogel |
| 2,2'-tiodiethanol (TDE) | Sigma-Aldrich | 166782-500G | solución de coincidencia de índice de refracción |
| 40% acrilamida | Bio-Rad | 161-0140 | hidrogel |
| 2% bis-acrilamida | Bio-Rad | 161-0142 | hidrogel |
| VA-044 iniciador | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | hidrogel Ácido |
| bórico | Sigma-Aldrich | B7901 | tampón de limpieza |
| Dodecil sulfato de sodio (SDS) | Fisher | BP166-5 | tampón |
| de limpieza Hidróxido de sodio | Fisher | 55255-1 | tampones |
| Azida de sodio | Sigma-Aldrich | 52002-100G | |
| conservante Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500G | |
| tampones Heparina | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | perfusión |
| Nitrato de sodio | Perfusión Fisher | BP360-500 | DAPI |
| Sondas moleculares | D1306 | tinción nuclear | |
| 99,9% isoflurano | Phoenix | 57319-559-06 | anestésico |
| Ácido hidrocolórico | Fisher | A1445-500 | tampones |
| Plato con fondo de vidrio | Willco | HBSB-5040 | Platos Willco |
| Adhesivo reutilizable | Bostick | 371351 | Blu-Tack |
| Elastómero de silicona | World Precision | Instruments KWIK-CAST | Kwik-Cast |
| Toallita sin pelusa | Kimberly-Clark | 34120 | KimWipe |
| Matriz cerebral de ratón | Roboz | SA-2175 | tejido |
| de corteCuchillas matriciales | Roboz | RS-9887 | tejido de corte |
| Bomba peristáltica | Cole-Parmer | 77122-24 | de pefusión |
| Microscopio confocal de barrido láser | Microscopía | Leica | SP5 |
| Software de imagen | Microscopía | Leica | LAS AF |
Referencias
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Kleinfeld, D., et al. Large-scale automated histology in the pursuit of connectomes.
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Reimpresiones y permisos
