Clearing óptico del sistema nervioso central del ratón Utilizando CLARITY pasiva

Summary

Las técnicas de aclarado óptico están revolucionando la forma en que se visualizan los tejidos. En este informe describimos las modificaciones del protocolo original Clear-Lipid-Exchange-Acrylamide-Hibridado-Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) que produce resultados más consistentes y menos costosos.

Abstract

Tradicionalmente, la visualización de tejidos ha requerido que el tejido de interés sea seccionado y visualizado en serie, sometiendo cada sección de tejido a deformaciones no lineales únicas, lo que dificulta drásticamente la capacidad de evaluar la morfología, distribución y conectividad celular en el sistema nervioso central (SNC). Sin embargo, las técnicas de aclaramiento óptico están cambiando la forma en que se visualizan los tejidos. Estos enfoques permiten indagar profundamente en las preparaciones de órganos intactos, proporcionando una gran comprensión de la organización estructural de los tejidos en la salud y la enfermedad. Técnicas como Clear Lipid-influid-Exchange-Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) logran este objetivo al proporcionar una matriz que se une a biomoléculas importantes al tiempo que permite que los lípidos que dispersan la luz se difundan libremente. La eliminación de lípidos, seguida de la coincidencia del índice de refracción, hace que el tejido sea transparente y se visualice fácilmente en 3 dimensiones (3D). Sin embargo, la limpieza electroforética de tejidos (ETC) utilizada en el protocolo CLARITY original puede ser difícil de implementar con éxito y el uso de una solución patentada de coincidencia de índice de refracción hace que sea costoso usar la técnica de forma rutinaria. Este informe demuestra la implementación de un protocolo de limpieza óptica simple y económico que combina CLARITY pasivo para mejorar la integridad del tejido y 2,2′-tiodiethanol (TDE), una solución de coincidencia de índice de refracción descrita anteriormente.

Introduction

La capacidad de obtener imágenes de estructuras neuroanatómicas completas es inmensamente valiosa para comprender el cerebro en la salud y la enfermedad. Tradicionalmente, las imágenes 3D han requerido el corte de tejido para proporcionar la resolución axial y visualizar estructuras anatómicas profundas. Este enfoque puede producir conjuntos de datos de alta resolución, pero requiere técnicas sofisticadas de reconstrucción de imágenes y es muy laborioso. Como resultado, se ha limitado a la obtención de imágenes de pequeños volúmenes de tejido^1-3. El corte óptico, por otro lado, es muy adecuado para la creación de imágenes 3D de alta resolución de tejidos marcados con fluorescencia. Dado que el corte óptico es inherentemente tridimensional, no requiere un cálculo extenso para producir un volumen de imagen 3D. Sin embargo, la dispersión de la luz y la opacidad de los tejidos limitan la profundidad a la que se pueden seccionar ópticamente los tejidos. La profundidad de las imágenes se limita a unos 150 μm en la microscopía confocal de barrido láser y a menos de 800 μm utilizando microscopía de excitación de dos fotones^4-8.

Con el fin de superar estas limitaciones, se han desarrollado recientemente varias técnicas de limpieza óptica y luego se han refinado aún más para permitir la obtención de imágenes microscópicas profundas de tejidos intactos. El uso de alcohol bencílico y benzoato de bencilo (BABB) para hacer transparentes los tejidos fijos fue uno de los primeros enfoques⁹. Sin embargo, este abordaje se vio limitado por el enfriamiento de la fluorescencia en las muestras y el aclaramiento incompleto de las estructuras altamente mielinizadas¹⁰. Los refinamientos de esta técnica, como la obtención de imágenes en 3D de órganos aclarados con disolventes (3DISCO), han dado lugar a un aclaramiento muy rápido y completo de los tejidos, pero aún sufren una rápida pérdida de señales fluorescentes, especialmente de la proteína fluorescente amarilla (YFP)¹⁰. Las soluciones de limpieza a base de agua, como Sca/e¹¹ y SeeDB¹², conservan las señales fluorescentes, pero no eliminan completamente los tejidos altamente mielinizados. Clear, Unobstructed Brain Imaging Cocktails and Computational analysis (CUBIC) es una nueva y prometedora tecnología de limpieza óptica que parece superar las limitaciones de las soluciones de limpieza a base de agua desarrolladas anteriormente¹³. A diferencia de otras técnicas de aclaramiento óptico, el Tejido-hYdrogel compatible con imágenes rígidas (CLARITY)¹⁴ con acrilamida intercambiada por lípidos transparentes incrusta el cerebro en una matriz porosa que proporciona integridad estructural a las proteínas, ácidos nucleicos y moléculas pequeñas, al tiempo que deja los lípidos libres. A continuación, los lípidos se eliminan electroforéticamente, culminando en un cerebro ópticamente aclarado que puede visualizarse fácilmente y sondearse con la misma facilidad utilizando técnicas comúnmente disponibles.

La limpieza electroforética de tejidos (ETC) se utiliza para eliminar los lípidos de los tejidos incluidos en hidrogel en CLARITY, sin embargo, el ETC puede ser difícil de implementar de manera consistente y los tejidos sujetos a electroforesis pueden exhibir distorsión tisular, pardeamiento, pérdida de fluorescencia y reactividad de anticuerpos. La limpieza pasiva de lípidos evita estas limitaciones, pero requiere mayores tiempos de aclarado^15-17. El desbroce pasivo también permite el desbroce de un gran número de muestras en paralelo, ya que no está limitado por el número de aparatos ETC disponibles. La disminución de la concentración de paraformaldehído y la exclusión de la bis-acrilamida del hidrogel han llevado a grandes aumentos en la velocidad de aclaramiento a expensas de una mayor expansión del tejido¹⁶. Se han desarrollado alternativas menos costosas a la solución de adaptación del índice de refracción utilizada en la técnica CLARITY original^17-19. El 2,2'-tiodietanol (TDE) es un agente de limpieza cerebral barato y rápido que revierte parte de la expansión del tejido que se produce durante la eliminación de lípidos¹⁸. Este informe incorpora la limpieza pasiva del tejido incrustado en hidrogel y el uso de TDE como una solución de coincidencia de índice de refracción con la técnica CLARITY original para producir un protocolo altamente reproducible y económico para la limpieza óptica del sistema nervioso central del ratón.

Protocol

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con el Cuidado de Animales institucional y el empleo directrices del Comité (IACUC). ratones Thy1-YFP, PLP-EGFP y PV-tdTomato se utilizaron para estos experimentos, pero cualquier ratones que expresan las proteínas fluorescentes se pueden borrar y la imagen con éxito.

1. Preparación del tejido

Precaución: El paraformaldehído (PFA) y acrilamida son tóxicos e irritantes. Realizar experimentos que utilizan estos reactivos en una campana de humos y con equipo de protección personal (bata de laboratorio, guantes y protección para los ojos).

1. Sacrificar al animal en la cámara de eutanasia con ~ 1 ml de isoflurano hasta que la respiración cesa (~ 2 - 3 min).
2. Utilice una bomba peristáltica ajustado a ~ 5 ml / min para perfundir intracardially el ratón con solución de perfusión (Tabla 1) a 4 ° C hasta que la sangre se elimina de los tejidos (5-10 min).
3. Cambiar el líquido de perfusión a la solución de fijación (Tabla 1)a 4 ° C hasta que el cuello y la cola han endurecido significativamente (5-10 min).
4. Poner fin a la perfusión y decapitar al animal. Diseccionar con cuidado el cerebro del cráneo mediante la eliminación de primero el tejido conectivo que rodea el cráneo y luego la eliminación de hueso de la superficie ventral del cráneo y levantando el cerebro fuera (Figura 1a), como se describe en ^20.
   Nota: Prestar especial atención a la eliminación de hueso que rodea los lóbulos floculonodular del cerebelo y los bulbos olfativos.
   1. Diseccionar la médula espinal de la columna vertebral, insertando suavemente la punta de una multa afilada tijera, entre la médula espinal y la columna vertebral y el corte de los segmentos de la columna vertebral de distancia individuales, tal como se describe en el ^21.
5. Hemisect el cerebro mediante la colocación en una matriz de cerebro de ratón de plástico y corte a lo largo de la línea media con una cuchilla de matriz.
6. Añadir cada hemisferio y la médula espinal para separar 50 ml bañera de centrífugaes con ~ 40 ml de solución de hidrogel (Tabla 1). A partir de este punto hacia adelante la cubierta de los tubos con papel de aluminio para proteger los fluoróforos durante todas las etapas subsiguientes.
7. Incubar el tubo que contiene la muestra en hidrogel a 4 ° C con agitación suave (~ 30 rpm) durante 7 días.

2. La polimerización

1. Desechar ~ 25 ml de hidrogel, la preservación de la muestra y ~ 25 ml de hidrogel en el tubo de centrífuga.
2. Desoxigenar la muestra mediante la eliminación de la tapa y colocar el tubo de centrífuga en el vaso de desecador y conectar el frasco a un vacío. Aplicar el vacío durante al menos 10 minutos para permitir que los gases disueltos a salir de las burbujas de la solución y la forma. agitar suavemente para desalojar las burbujas.
3. Reemplazar el vacío en el frasco desecador con gas de nitrógeno 100% durante 2 - 3 min. Una vez que la presión se iguala (una vez se puede abrir la parte superior del frasco desecador), la tapa rápidamente el tubo para evitar la reintroducción de oxígeno.
4. Polímeroize el hidrogel colocando el tubo con la muestra en un baño de agua a 37 ° durante 3 horas hasta que la polimerización es completa. Hidrogel polimerizado se enfrentará a una consistencia (Figura 1b) similar a un gel. Nota: Una pequeña cantidad de hidrogel polimerizado en la parte superior es aceptable.
5. Use una espátula para eliminar la muestra polimerizado del tubo de centrífuga, y luego cortar el exceso de hidrogel de la muestra.
6. Retire el hidrogel restante colocando la muestra en un trapo sin pelusa y frotar suavemente y rodando el tejido en él, dejando sólo una fina capa de hidrogel polimerizado en la muestra.

3. La eliminación de los lípidos

Nota: el tejido de lípido-limpiado es frágil, manejar con cuidado. Use un filtro de células durante el drenaje del tubo para evitar la pérdida de muestra. Además, la muestra se hinchará a lo largo del proceso de limpieza, sin embargo, la hinchazón puede ser invertida durante el proceso de adaptación de índice de refracción.

Precaución: Sodium dodecil sulfato (SDS) y el ácido bórico son irritantes. Realizar experimentos utilizando en una campana de humos y con equipo de protección personal (bata de laboratorio, guantes y protección para los ojos).

1. Transferencia de la muestra polimerizado a un tubo de centrífuga limpio de 50 ml y añadir 45 ml de la limpieza de tampón (Tabla 1). Incubar a 45 ° C con agitación suave (~ 30 rpm). Cambiar el tampón al día durante un período inicial de 7 días mediante el vertido de la memoria intermedia de compensación utilizada en los desechos químicos y la adición de ~ 45 ml de tampón de compensación fresco. Mantener los tubos de centrífuga que contienen las muestras cubiertas de papel de aluminio para proteger los fluoróforos.
2. Después de los primeros 7 días, se incuba la muestra a 40 ° C y el intercambio de tampón de compensación cada 2 - 3 días. Continuar compensación hasta que todos los lípidos se solubilizan y el tejido alcanza la transparencia (Figura 1c). Esto será de 4 - 6 semanas para un hemisferio de cerebro de ratón y 2 - 4 semanas para una médula espinal.
3. Una vez que se elimina el tejido, transferirmuestra a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml y lavar 4 veces en PBST (Tabla 1) a 40 ° C con agitación suave (~ 30 rpm) durante 24 hr para eliminar residual SDS.

4. La tinción Molecular

Precaución: 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol dihidrocloruro (DAPI) es un irritante y cualquier experimentos que utilizan que se debe realizar en una campana de humos y con equipo de protección personal (bata de laboratorio, guantes y protección para los ojos).

1. Transferir la muestra a un tubo de centrífuga limpio de 15 ml y se llenan de 1 g / ml DAPI en 1 x PBST, pH 7,5. Se incuba a temperatura ambiente (RT) durante 24 hr. Mantener los tubos de centrífuga que contienen las muestras cubiertas de papel de aluminio para proteger los fluoróforos.
2. Lavar 3 veces en PBST a TA durante al menos 6 hr / lavado.

5. Índice de Refracción Matching

Precaución: 2,2 'tiodietanol (TDE) es un irritante y cualquier experimento que utiliza shOuld llevar a cabo en una campana de humos y con equipo de protección personal (bata de laboratorio, guantes y protección para los ojos).

1. Transferir la muestra a un tubo de centrífuga limpio de 15 ml y llenarlo con un 30% (v / v) TDE en 1 x PBS, pH 7,5. Incubar a 40 ° C con agitación suave (~ 30 rpm) durante 24 hr.
2. Cambio de TDE 30% al 63% (v / v) de TDE en 1 x PBS, pH 7,5. Incubar a 40 ° C con agitación suave durante 24 hr.
   Nota: La muestra se contraerá a su tamaño original, aproximadamente.
3. En una superficie plana, limpia rodar un trozo de adhesivo reutilizable en un cilindro con diámetro uniforme ligeramente mayor que el espesor de la muestra.
4. Coloque el cilindro adhesiva reutilizable en un círculo abierto (~ 25 mm de diámetro interior con una pequeña abertura en la parte superior) en un plato de cristal inferior a 40 mm. Si correcciones deben hacerse, retire el cilindro del vidrio y cortar con una cuchilla de afeitar.
5. Utilice una punta de pipeta P1000 para crear un sello entre el adhesivo reutilizable y vidrio porrodar alrededor del borde exterior del cilindro.
6. Place ~ 100 l 63% TDE en el plato de vidrio y se extendió alrededor para cubrir la superficie del vidrio dentro del círculo de adhesivo reutilizable.
7. Usando una espátula, se coloca cuidadosamente la muestra en el centro del círculo, teniendo cuidado de no formar burbujas.
8. Pipetear otros 100 l de 63% de TDE directamente sobre la muestra, a continuación, colocar inmediatamente una cubierta de vidrio circular de 40 mm sobre el adhesivo reutilizable.
9. Utilizando el índice, medio y anular de ambas manos, presione con cuidado alrededor del perímetro del círculo hasta que la cubierta de vidrio ha puesto en contacto con la muestra.
10. Lentamente el plato de fondo de cristal a una posición vertical descansando contra una superficie, a continuación, añadir 63% TDE con una pipeta hasta que la solución llega a la pequeña abertura en la parte superior. Use un trapo sin pelusa para secar la punta de la pipeta para que la solución no gotee sobre el cristal. Para evitar las burbujas en la cámara, no vaciar la pipeta hasta el final.
11. Ala pequeña abertura, añadir elastómero de silicio para encerrar el círculo y crear una cámara cerrada. Espere 5 minutos para que se seque antes de exponer.

6. Microscopía

Precaución: Los láseres utilizados en confocal, solo plano de iluminación y microscopía de lámina de luz son muy potente y puede causar ceguera. Cualquier experimento que utilizan láseres deben realizarse después de una amplia formación y con gran precaución y protección ocular adecuada.

1. Coloque la cámara de imágenes con la muestra dentro de la etapa de un microscopio láser confocal de barrido.
2. Abra el software de imagen (véase la Tabla de Materiales). Para encender el láser de argón de excitación, haga clic en la pestaña de configuración en la parte superior del programa y luego el icono de láser. Marque la casilla junto al argón para alimentar el láser y mover la escala deslizante a 30%. Observe el puntero calentar lentamente hasta la posición seleccionada.
   1. Volver a la ficha adquirir en la parte superior. En la caja grande "Configuración trayectoria del haz y# 34; ir al cargar / guardar cuadro de ajuste y seleccione el menú desplegable para seleccionar un canal de longitud de onda apropiada a la imagen YFP (527 nm).
3. Seleccionar los objetivos adecuados para la formación de imágenes mediante la localización de un hipervínculo de color rojo con la etiqueta "Objetivo: objeto actual" en el cuadro de configuración de canal. Al hacer clic en la pestaña abre todos los objetivos disponibles y una selección rotará automáticamente la torreta.
   1. Use objetivos (por ejemplo., 10x) con una distancia grande de trabajo (mayor que el espesor del tejido para formar imágenes, por ejemplo, 11 mm) y una gran apertura numérica (por ejemplo., 0,3) para maximizar la resolución de la imagen en el plano y minimizar espesor de la sección óptica.
4. En la columna izquierda de menús desplegables, abra el "XY: resolución" ventana para establecer la matriz de adquisición, llamado "formato", de 1.024 x 1.024 o un valor adecuado para el límite de resolución lateral del objetivo. Establecer el factor de zoom lo más bajo posible (por ejemplo., 10.7).
5. En la misma ventana, set 8 y media de la línea 1 del marco parámetros medios dejando caer abajo en los menús marcados individualmente en consecuencia. Utilice valores grandes para una alta relación señal-ruido y los valores pequeños para la adquisición rápida.
   Nota: 8 promedios de línea y 1 media de trama adquirirán imágenes de alta calidad de un hemisferio cerebral del ratón en aproximadamente 4 horas.
6. Busque la muestra usando los controles de la etapa. Una vez que un campo representativo es visible, establecer la ganancia y offset.
   Nota: La ganancia y el desplazamiento puede variar sustancialmente en función del tipo de tejido, fluoróforos, y / o característica anatómica está formando la imagen. Para YFP, los valores de fijar de 760 a la 780: de la ganancia y de -1,0 a -1,5 para el desplazamiento.
7. Seleccione "exploración baldosas" y seleccione los límites de la región de interés. Establecer los límites superior e inferior de la pila Z a adquirir. Ajuste el espesor de la sección óptica basada en el límite de la sección de resolución óptica del objetivo.
   Nota: Un objetivo delímite de la sección de resolución óptica se define principalmente por su apertura numérica. La mayoría del software de control de microscopio calculará automáticamente un valor apropiado para el objetivo que se utiliza. Para un objetivo de 10X con una apertura numérica de 0,3 que sería de aproximadamente 11 micras.
8. Iniciar la adquisición.
   Nota: Este proceso puede tardar varias horas.
9. Recoge imágenes de mayor resolución usando objetivos de mayor aumento de las regiones específicas de interés.

Results

La visualización de la organización estructural del cerebro es fundamental para la comprensión de cómo la morfología y la conectividad afectan la función cerebral en la salud y la enfermedad. técnicas de compensación ópticas hacen posible poblaciones celulares imagen en 3D en los tejidos intactos, que nos permite estudiar la morfología y la conectividad de manera cohesiva.

Los ratones que expresan proteínas fluorescentes impul...

Discussion

compensación pasiva de los tejidos de hidrogel incrustado (claridad pasiva) es un método sencillo y barato para la limpieza de piezas grandes de tejido. Este enfoque no requiere un equipo dedicado y se puede realizar fácilmente en un agitador de temperatura controlada. En el lapso de unas pocas semanas, los tejidos, incluso grandes, altamente mielinizados, como todo un cerebro o la médula espinal, llegarán a ser transparentes y adecuados para la microscopía. A pesar de que este informe se ha centrado en la limpieza de t...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Fisher	BP399-1	tampones
32% paraformaldehído (PFA)	Electrónica Microscopy Sciences	15714-5	perfusión e hidrogel
2,2'-tiodiethanol (TDE)	Sigma-Aldrich	166782-500G	solución de coincidencia de índice de refracción
40% acrilamida	Bio-Rad	161-0140	hidrogel
2% bis-acrilamida	Bio-Rad	161-0142	hidrogel
VA-044 iniciador	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	VA044	hidrogel Ácido
bórico	Sigma-Aldrich	B7901	tampón de limpieza
Dodecil sulfato de sodio (SDS)	Fisher	BP166-5	tampón
de limpieza Hidróxido de sodio	Fisher	55255-1	tampones
Azida de sodio	Sigma-Aldrich	52002-100G
conservante Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500G
tampones Heparina	Sigma-Aldrich	H3393-50KU	perfusión
Nitrato de sodio	Perfusión Fisher	BP360-500	DAPI
Sondas moleculares	D1306	tinción nuclear
99,9% isoflurano	Phoenix	57319-559-06	anestésico
Ácido hidrocolórico	Fisher	A1445-500	tampones
Plato con fondo de vidrio	Willco	HBSB-5040	Platos Willco
Adhesivo reutilizable	Bostick	371351	Blu-Tack
Elastómero de silicona	World Precision	Instruments KWIK-CAST	Kwik-Cast
Toallita sin pelusa	Kimberly-Clark	34120	KimWipe
Matriz cerebral de ratón	Roboz	SA-2175	tejido
de corteCuchillas matriciales	Roboz	RS-9887	tejido de corte
Bomba peristáltica	Cole-Parmer	77122-24	de pefusión
Microscopio confocal de barrido láser	Microscopía	Leica	SP5
Software de imagen	Microscopía	Leica	LAS AF