Este manuscrito describe el uso de una cepa bioluminiscente de tripanosomas africanos para permitir el seguimiento de la infección en etapa tardía y demuestra cómo se pueden usar imágenes en vivo in vivo para visualizar infecciones dentro del sistema nervioso central en tiempo real.
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Artículo de método
Imágenes de bioluminiscencia para detectar la infección en fase tardía de la tripanosomiasis africana
En este artículo
Resumen
Resumen
La tripanosomiasis africana humana (HAT) es una enfermedad multietapa que se manifiesta en dos etapas: una etapa temprana en la sangre y una etapa tardía cuando el parásito invade el sistema nervioso central (SNC). El estudio in vivo de la etapa tardía ha sido limitado, ya que las metodologías tradicionales requieren la extracción del cerebro para determinar la presencia de los parásitos.
Las imágenes de bioluminiscencia son una forma no invasiva y altamente sensible de imágenes ópticas que permite la visualización de un patógeno transfectado con luciferasa en tiempo real. Mediante el uso de una cepa de tripanosoma transfectada que tiene la capacidad de producir enfermedad en etapa tardía en ratones, podemos estudiar la cinética de una infección del SNC en un solo animal durante el curso de la infección, así como observar el movimiento y la diseminación de una infección sistémica.
Aquí describimos un protocolo robusto para estudiar las infecciones del SNC utilizando un modelo de bioluminiscencia de la tripanosomiasis africana, proporcionando observaciones no invasivas en tiempo real que pueden analizarse más a fondo con enfoques opcionales posteriores.
Introducción
La tripanosomiasis africana humana (HAT), o enfermedad del sueño, es causada por los parásitos protozoarios transmitidos por vectores del Trypanosoma brucei spp1. El número estimado de casos actuales es de menos de 7 mil cada año, con casi 70 millones de personas expuestas al riesgo de infección por el parásito en el continente africano. La enfermedad, que suele ser letal si no se trata, comprende una etapa hemolinfática temprana en la que los parásitos están presentes en la sangre, progresando a la etapa tardía en la que los parásitos invaden el sistema nervioso central (SNC) y ya no son susceptibles al tratamiento con fármacos tripanosómicos en etapa temprana2. Las terapias farmacológicas actuales para la HAT en etapa tardía tienen regímenes de tratamiento complejos y prolongados y efectos adversos graves, así como resistencias reportadas, por lo que la investigación de nuevas terapias farmacológicas es imperativa3,4.
El estudio de la tripanosomiasis africana humana (HAT) en etapa tardía dentro de modelos tradicionales de ratón es largo y complejo, y se requiere la extirpación de tejido cerebral para monitorear la carga parasitaria5. La cepa infecciosa animal T. b. brucei se utiliza como modelo de estudio de la tripanosomiasis con la aparición en estadio tardío 21 días después de la infección (dpi). Para monitorizar la infección por parásitos no bioluminiscentes de tipo salvaje en el modelo de ratón, las pruebas de sangre periférica o la PCR cuantitativa son los únicos métodos para determinar la carga parasitaria. Para la carga de parásitos en el cerebro, el ratón debe ser sacrificado, el cerebro extirpado y se debe realizar una qPCR en los tejidos, lo que hace imposible rastrear los parásitos a través de múltiples puntos de tiempo en la infección en la etapa tardía. Esto da como resultado la incapacidad de seguir las infecciones en tiempo real dentro del sistema nervioso central (SNC).
Las imágenes de bioluminiscencia (BLI) in vivo pueden proporcionar una detección altamente sensible y no invasiva de la diseminación del parásito y la progresión de la enfermedad en un modelo de ratón que se puede seguir en un solo animal durante la totalidad del experimento6. BLI se basa en la emisión de luz en el espectro visible producida por una reacción catalizada por luciferasa. A continuación, los fotones emitidos son detectados por una cámara con dispositivo de carga acoplada (CCD)7. Para ello, el patógeno se modifica genéticamente para que exprese una proteína luciferasa y el sustrato, la luciferina, se introduce en puntos de interés temporales mediante inyección. La principal ventaja de este método es la capacidad de realizar estudios longitudinales, en los que se pueden obtener imágenes del mismo animal varias veces con efectos adversos mínimos. La señal de bioluminiscencia adquirida se puede cuantificar, indicando así la carga del patógeno.
La optimización y validación de un T. b. brucei bioluminiscente desplazado al rojo ha permitido la investigación de la infección en etapa tardía a través de procedimientos no invasivos, detectando parásitos antes que la microscopía de frotis sanguíneo y reduciendo en gran medida el tiempo, el costo y el número de animales necesarios para estudiar la infección del SNC y el cribado de fármacos en la tripanosomiasis en etapa tardía8,9. En este protocolo demostramos la infección de ratones con tripanosomas bioluminiscentes y cómo luego visualizar los parásitos in vivo para la cuantificación de la progresión de la enfermedad y la penetración en el SNC.
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Protocolo
Ética
Todo el trabajo se llevó a cabo bajo la aprobación del Ministerio del Interior británico los Animales (Procedimientos Científicos) de la Ley de 1986 y la London School of Higiene y Medicina Tropical de Bienestar Animal y la Junta de Revisión de Ética. LLEGA directriz se siguen en este informe.
1. En Vivo La aprobación de Trypanosoma brucei brucei bioluminiscente
- Retirar una acción criopreservados (denominado estabilizado) de T. segundo. brucei cepa GVR35-VSL-2 (disponible en el profesor John Kelly en la London School of Higiene y Medicina Tropical través MTA) de 9 de nitrógeno líquido y se deja que se equilibre a temperatura ambiente. Diluir estabilizado a 2 x 10 4 tripanosomas / ml en pH estéril salina tamponada con fosfato de glucosa (PBS-G) 8,0 (1 L PBS + 15 g de glucosa) 10.
Nota: T. segundo. brucei GVR35-VSL-2 no es infecciosa para los humanos y no requiere licencia SAPO instalaciones para llevar a cabo los experimentos. - inject un 20-25 g ratón hembra CD1 con 0,2 ml diluidos tripanosomas por vía intraperitoneal (ip) con una aguja de 25 G. Este es el "ratón donante". Coloque el ratón infectado en un libre de patógenos (SPF) -cage y alimentación ad libitum específico.
Nota: Los ratones CD1 son una cepa no consanguínea y T. segundo. brucei infecciones GVR35 están bien caracterizados en esta cepa. Sin embargo, este protocolo también es aplicable a cepas puras o modificadas genéticamente, pero es importante tener en cuenta que el color de la piel puede afectar a la sensibilidad de formación de imágenes 6,9. - Monitorear la parasitemia periférica mediante el muestreo de sangre. Coloque el ratón en un retenedor de plástico y tomar 5 l de sangre de la cola por punción venosa con aguja 21 G o sangría y mezclar 1/10 con cloruro de amonio estéril 0,85% para lisar las células rojas de la sangre y permitir el recuento más fácil.
- Contar la sangre diluida en un hemocitómetro Neubauer.
- Cargar la sangre diluida en ambas cámaras. Contar todo el centro grIdentificación de una cámara para dar N tripanosomas. La concentración de tripanosomas en la sangre = n x 10 4 tripanosomas / ml, ajuste para cualquier factor de dilución y calcular la media de las dos cámaras.
Nota: Después de aproximadamente 5-7 días después de la infección, la parasitemia periférica debe elevarse lo suficiente como para llevar a cabo una infección a una concentración de 2 x 10 4 tripanosomas / ml.
- Cargar la sangre diluida en ambas cámaras. Contar todo el centro grIdentificación de una cámara para dar N tripanosomas. La concentración de tripanosomas en la sangre = n x 10 4 tripanosomas / ml, ajuste para cualquier factor de dilución y calcular la media de las dos cámaras.
- Cuando los niveles de tripanosomas son suficientes para el número de ratones requeridos alta, pasar al paso 1.6. Un nivel de parasitemia de 6 x 10 4 tripanosomas / ml en un ratón donante es suficiente para la infección de 10 ratones.
Nota: Para tamaños de los grupos estadísticamente significativas, n = 6 para cada grupo de tratamiento de los ratones se necesitan 8. Para otros modelos de infección, tendría que ser aplicada para determinar los tamaños de grupo apropiados los cálculos de potencia. - Coloque los ratones en una caja caliente (a 28-30 ° C durante aproximadamente 5-10 minutos) para permitir que las venas de la cola se dilaten.Para inducir la anestesia terminal, administrar 20 mg / kg iv pentobarbital con una aguja 25 G. Confirmar ratón se anestesia presionando suavemente las almohadillas de las patas para asegurar que no hay reflejo de retirada.
- Heparinizar una aguja 21 G por alícuotas de 5 ml de heparina de 5.000 unidades USP / ml en un tubo de Bijou y chupando dos veces en y fuera de la aguja unida a una jeringa de 1 ml.
- Tome el heparinizada 21 G aguja y jeringa de 1 ml, y realizar una punción cardiaca en el ratón paso anestesiado mediante la inserción de la aguja en el centro debajo de la caja torácica (una gota de sangre se acumule en la base de la aguja) y tire suavemente hacia atrás el émbolo a fin de no colapsar la cámara del corazón. Recoger un mínimo de 0,7 ml de sangre.
- Diluir la sangre infectada para producir un inóculo de 2 x 10 4 tripanosomas / ml en PBS-G pH 8,0 como paso 1.1 anteriormente.
Nota: En este punto, la sangre restante se pueden criopreservar para producir estabilizado por mezcla con 8% de glicerol, 20% inactivado por calor ca fetalsuero LF (hi-FCS) y la sangre infectada del 72%. Poco a poco se congelan a -80 ° C utilizando un lento-freezing contenedor para lograr una velocidad de enfriamiento de -1 ° C / min, antes de transferir a nitrógeno líquido.
2. La infección de ratones experimentales
- Coloque el CD1 ratones hembra (~ 21-25 g) en una caja de calentamiento para calentar suavemente para dilatar las venas. Coloque los ratones calentado en un sistema de retención de plástico e inyectar 0,2 ml de inóculo diluido por vía intravenosa con una aguja de 25 G en la vena caudal, equivalente a 4.000 tripanosomas por ratón. Colocar presión en el sitio de la inyección después de detener la hemorragia.
Nota: la infección intraperitoneal es una ruta válida de la infección y se ha utilizado en estudios previos 10, pero hemos hallado que este menos reproducible que la vía intravenosa. - Selección aleatoria de los ratones infectados y la jaula en grupos de 3 en jaulas ventiladas SPF. Como control, se inyectan ratones hembra CD1 de tipo salvaje con parásito no bioluminiscente, T. segundo. brucei GVR35 (n =3).
- Monitorear la infección a través del cine Microscopía de Sangre
- Spot 5 l de sangre de la punción venosa o sangrías en un portaobjetos de vidrio y realizar un frotis de sangre (utilizando una segunda lámina de vidrio empuje suavemente la gota de sangre a través de la corredera para producir una película delgada). Permitir que las diapositivas se sequen al aire.
- Fijar la muestra de sangre con metanol al 100% y tinción con Giemsa durante 10 minutos antes de enjuagar con H2O destilada y dejar secar al aire. En el objetivo 100X contar el número de tripanosomas en 10 campos de visión (FOV).
Nota: la filmación de la sangre se lleva a cabo junto con imágenes no invasivo animal entero tan pronto como un día después de la infección. Cuando se procesa un número de animales, se prefiere este método de cuantificación tripanosoma sobre conteo hemocitómetro que las muestras se pueden almacenar a temperatura ambiente y se contaron después.
3. La bioluminiscencia de imágenes para realizar el seguimiento de Infecciones
Nota: Para controlar la infección, toda animde formación de imágenes al no invasiva se puede utilizar.
- Preparar una solución madre de D-luciferina, el sustrato de luciferasa de luciérnaga, en Dulbecco salina tamponada con fosfato (DPBS) a 30 mg / ml. Filtro de esterilizar y congelar en alícuotas a -20 ° C.
Nota: D-luciferina es sensible a la luz, por lo tanto, protegerlo de la luz envolviendo alícuotas en papel de aluminio. No congelar y descongelar repetidamente luciferina, ya que puede afectar a la actividad 11. - Calentar una alícuota de D-luciferina a temperatura ambiente. Retirar cada ratón de la jaula (incluyendo los ratones de control infectados con nonbioluminescent cepa del parásito de tipo salvaje) e inyectar 150 mg / kg de la D-luciferina calentado (diluido en DPBS) por vía intraperitoneal con una aguja 25 G. Coloque los ratones en una cámara de isofluorano durante aproximadamente 5 min para inducir la anestesia con isofluorano al 2% / O 2 mezcla a 2,5 L / min.
Nota: Los ratones se vuelven inmóviles cuando están bajo anestesia. Para el generador de imágenes se utiliza aquí, 3 ratones pueden ser procesados a la vez. Si los ratones son anesthetracterizado por más de 30 min, oftálmica ungüento lágrima artificial se puede aplicar a evitar que los ojos de los ratones de la desecación. - Para el generador de imágenes se describe aquí, abra el software e inicializar la máquina utilizando el software según las instrucciones del fabricante. Adquirir imágenes una vez que la cámara y placa calentada han alcanzado la temperatura.
Nota: Este instrumento no está normalmente apagado, permitiendo a la máquina para realizar las calibraciones de fondo durante la noche. En el caso de que se debe reiniciarse, se debe realizar una verificación de la calibración en primer lugar. - Coloque los ratones anestesiados en el generador de imágenes (véase 3.5). Utilice separadores negros grandes entre los ratones para minimizar sangrar a través de cualquier señal bioluminiscente brillante. los ratones de imagen utilizando un conjunto de tiempos de exposición; 1, 3, 10, 30, 60 y 180 segundos, con binning medio, 1 f / stop y un filtro abierto, y el campo visual E (12,5 x 12,5 cm 2).
Nota: Los ratones de control infectados con los parásitos de tipo salvaje GVR35 nonbioluminescent proporcionan un backgrvalor bioluminiscencia ound. Desde un experimento de cinética de luciferina (Figura 6) con este modelo, hemos encontrado que los picos de señal de bioluminiscencia en 10 minutos después de la administración y de formación de imágenes se lleva a aproximadamente 5 min para 3 ratones. Tome esta escala de tiempo en la consideración al anestesiar y imágenes de los ratones. - Para asegurar la formación de imágenes a fondo de los ratones, girar para obtener un ventral, dorsal y lateral. Mantener la coherencia en el orden de orientación para formación de imágenes entre los animales secuenciales.
- Después de proyección de imagen, permiten ratones se recuperen de la anestesia bajo observación antes de volver a SPF-jaula.
- Continuar la formación de imágenes ratones cada 7 días hasta el día 21 después de la infección. Debe haber un aumento constante de la señal de la bioluminiscencia durante todo el animal.
- En D21, imagen y frotis de sangre de los ratones como se describió anteriormente, y la dosis de los ratones con 40 mg / kg por vía intraperitoneal diminazeno aceturato. Este fármaco se borrará la parasitemia periférica, pero no va a cruzar la barrera sangre-Brain barrera, y por lo tanto permite una mejor visualización de la infección del SNC.
Nota: diminazeno aceturato es un fármaco bien establecido utilizado para tratar las primeras etapas de la tripanosomiasis animal. - Continuar imágenes y controlarse en D28 y D35.
4. Confirmación de la infección del SNC
- En D35, los ratones de imagen indicados anteriormente (pasos 3.1-3.4).
- Después de proyección de imagen, permiten ratones se recuperen de la anestesia y ratones Exsanguinate como se detalla en el paso 1.6 hasta 1.8, la recogida de sangre para su posterior análisis.
- Después de punción cardíaca, perfundir los ratones con 20 ml de PBS (opcional: añadir 3 mg / ml de luciferina para solución de perfusión) a través del corazón para limpiar la sangre de los órganos y de volver a introducir la etiqueta luciferina que podrían haber desaparecido de la región del cerebro durante el intervalo de tiempo desde el paso 4.1.
- eliminar suavemente el cerebro, mediante el uso de tijeras curvas, el corte de la base alrededor de la circunferencia del cráneo, y el levantamiento de la parte superior del cráneo, para permitir que el cerebropara ser levantado suavemente con fórceps curvos.
- Coloque el cerebro extirpado en una sección de plástico negro y pipeta de 50 l de 15 mg / ml de luciferina sobre el órgano antes de la imagen, para asegurar luciferina adecuada se ha añadido al cerebro extirpado. Imagen utilizando la configuración que el anterior. Esto demostrará la localización de la infección a los hemisferios cerebrales.
Nota: cuantificación Aguas abajo de parasitemia en el cerebro extirpado se puede llevar a cabo por qPCR como se describió previamente 8. Otras aplicaciones posteriores alternativas podrían incluir la histología o inmunohistoquímica para identificar los parásitos en el tejido cerebral después de la fijación.
5. La cuantificación de la bioluminiscencia Imaging
Nota: La bioluminiscencia se puede cuantificar utilizando la región de interés (ROI) con el software de imágenes y corregida para el fondo bioluminiscencia.
- Con la herramienta de retorno de la inversión, crear un ROI rectangular para la cuantificación de un animal enterond posicionarlo la imagen del ratón sobre para cubrir la punta de la nariz a la base de la cola del ratón. Utilice el mismo cuadro de tamaño para cada animal y cada punto de tiempo. Al mirar el retorno de la inversión para el cerebro, utilizar un ROI circular de la misma manera, el posicionamiento por encima de la región de la cabeza del ratón en la imagen.
- Si se desea, ajustar las imágenes a aparecer en el mismo espectro de una representación visual de la infección.
Nota: El software utilizado aquí genera un mapa de colores para cada imagen se ajusta automáticamente para el recuento mínimo y máximo de fotones. Para permitir la comparación visual entre una serie de imágenes, la escala de color debe estar ajustado a los mismos valores para todas las imágenes.- El uso de la imagen de mayor bioluminiscencia y la pestaña 'Ajuste de imagen "en la paleta de herramientas, seleccione una escala logarítmica y un mínimo de la escala de color adecuado y la máxima (a determinar empíricamente). Aplicar esta escala para todas las imágenes a lo largo del experimento.
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Resultados
Este protocolo demuestra cómo seguir la progresión de la enfermedad después de la infección de ratones con T. segundo. brucei, un modelo para la tripanosomiasis africana humana. La Figura 1 muestra la línea de tiempo del protocolo experimental, lo que demuestra el calendario de tratamiento de imágenes y pasos. La figura 2 muestra un campo típico de vista en un frotis de sangre teñido con Giemsa fija que se utiliza para cuantificar la parasitemia...
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Discusión
El desarrollo de un T. bioluminiscente segundo. brucei cepa GVR35 permite la visualización de una infección por tripanosoma de principios a la etapa tardía. Modelos de infección anteriores eran incapaces de detectar la fase de retraso, cuando los parásitos están en el cerebro, en tiempo real desde la microscopía de frotis de sangre, y requieren el sacrificio y la eliminación de los cerebros de los ratones infectados para determinar la carga parasitaria 12. La bioluminiscencia reduce la varia...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a John Kelly y Martin Taylor (Escuela de Higiene y Medicina Tropical) para proporcionar T. segundo. brucei GVR35-VSL-2 y el Dr. Andrea Zelmer (LSHTM) para el asesoramiento en imágenes in vivo. Este trabajo fue apoyado por el Programa Bill y Melinda Gates, la Fundación Mundial de la Salud (número de concesión OPPGH5337).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| PBS | Sigma, Reino Unido | P4417 | comprimidos pH 7,4 |
| Glucosa | Sigma, Reino Unido | G8270 | 99,5% (molecular) grado |
| Cloruro de amonio | Sigma, Reino Unido | A9434 | 99,5% (molecular) grado |
| Heparina (sal de litio) | Sigma, Reino Unido | H0878 | |
| Hi-FCS | Gibco, Life Technologies, Reino Unido | 10500-064 | 500 ml |
| DPBS | Sigma, Reino Unido | D4031 | Filtrado estéril |
| Mr. Frosty | Nalgene, Reino Unido | ||
| Giemsa | Sigma, Reino Unido | G5637 | |
| D-Luciferina | Perkin Elmer, Reino Unido | ||
| Sigma, Reino Unido | 115144-35-9 | ||
| Aceturato de dimenezeno | Sigma, Reino Unido | D7770 | Grado analítico |
| IVIS Lumina II | Perkin Elmer, Reino Unido | otros bioimagers disponibles p. ej. de Bruker, Kodak | |
| Living Image v. 4.2 | Perkin Elmer, Reino Unido | software propietario para los instrumentos IVIS de Perkin Elmer; otros instrumentos pueden tener su propio | |
| ml Jeringa | Fisher Scientific, Reino Unido | 10142104 | |
| 20 ml Jeringa | Fisher Scientific, Reino Unido | 10743785 | |
| agujas de | 25 gGreiner Bio-one | N2516 | |
| Agujas de 21 g | Greiner Bio-one | N2138 | |
| Portaobjetos de microscopio de doble esmerilado | VWR, Reino Unido | 631-0117 | |
| Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml | StarLab, Reino Unido | I1415-1000 | |
| Tubo Bijou de 7 ml | StarLab, Reino Unido | E1412-0710 | |
| Sujetador de ratón | Sigma, Reino Unido | Z756903 | Nuestro restricción se fabricó internamente, este es un modelo similar |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
