Este manuscrito describe el uso de una cepa bioluminiscente de tripanosomas africanos para permitir el seguimiento de la infección en etapa tardía y demuestra cómo se pueden usar imágenes en vivo in vivo para visualizar infecciones dentro del sistema nervioso central en tiempo real.
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Artículo de método
Imágenes de bioluminiscencia para detectar la infección en fase tardía de la tripanosomiasis africana
En este artículo
Resumen
Resumen
La tripanosomiasis africana humana (HAT) es una enfermedad multietapa que se manifiesta en dos etapas: una etapa temprana en la sangre y una etapa tardía cuando el parásito invade el sistema nervioso central (SNC). El estudio in vivo de la etapa tardía ha sido limitado, ya que las metodologías tradicionales requieren la extracción del cerebro para determinar la presencia de los parásitos.
Las imágenes de bioluminiscencia son una forma no invasiva y altamente sensible de imágenes ópticas que permite la visualización de un patógeno transfectado con luciferasa en tiempo real. Mediante el uso de una cepa de tripanosoma transfectada que tiene la capacidad de producir enfermedad en etapa tardía en ratones, podemos estudiar la cinética de una infección del SNC en un solo animal durante el curso de la infección, así como observar el movimiento y la diseminación de una infección sistémica.
Aquí describimos un protocolo robusto para estudiar las infecciones del SNC utilizando un modelo de bioluminiscencia de la tripanosomiasis africana, proporcionando observaciones no invasivas en tiempo real que pueden analizarse más a fondo con enfoques opcionales posteriores.
Introducción
La tripanosomiasis africana humana (HAT), o enfermedad del sueño, es causada por los parásitos protozoarios transmitidos por vectores del Trypanosoma brucei spp1. El número estimado de casos actuales es de menos de 7 mil cada año, con casi 70 millones de personas expuestas al riesgo de infección por el parásito en el continente africano. La enfermedad, que suele ser letal si no se trata, comprende una etapa hemolinfática temprana en la que los parásitos están presentes en la sangre, progresando a la etapa tardía en la que los parásitos invaden el sistema nervioso central (SNC) y ya no son susceptibles al tratamiento con fármacos tripanosómicos en e....
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Protocolo
Ética
Todo el trabajo se llevó a cabo bajo la aprobación del Ministerio del Interior británico los Animales (Procedimientos Científicos) de la Ley de 1986 y la London School of Higiene y Medicina Tropical de Bienestar Animal y la Junta de Revisión de Ética. LLEGA directriz se siguen en este informe.
1. En Vivo La aprobación de Trypanosoma brucei brucei bioluminiscente
- Retirar una acción criopreservados (denominado estabilizado) de T. segundo. brucei cepa GVR35-VSL-2 (disponible en el profesor John Kelly en la London School of Higiene y Medicina Tropical través MTA) de 9 de n....
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Resultados
Este protocolo demuestra cómo seguir la progresión de la enfermedad después de la infección de ratones con T. segundo. brucei, un modelo para la tripanosomiasis africana humana. La Figura 1 muestra la línea de tiempo del protocolo experimental, lo que demuestra el calendario de tratamiento de imágenes y pasos. La figura 2 muestra un campo típico de vista en un frotis de sangre teñido con Giemsa fija que se utiliza para cuantificar la parasitemia.......
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Discusión
El desarrollo de un T. bioluminiscente segundo. brucei cepa GVR35 permite la visualización de una infección por tripanosoma de principios a la etapa tardía. Modelos de infección anteriores eran incapaces de detectar la fase de retraso, cuando los parásitos están en el cerebro, en tiempo real desde la microscopía de frotis de sangre, y requieren el sacrificio y la eliminación de los cerebros de los ratones infectados para determinar la carga parasitaria 12. La bioluminiscencia reduce la varia.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a John Kelly y Martin Taylor (Escuela de Higiene y Medicina Tropical) para proporcionar T. segundo. brucei GVR35-VSL-2 y el Dr. Andrea Zelmer (LSHTM) para el asesoramiento en imágenes in vivo. Este trabajo fue apoyado por el Programa Bill y Melinda Gates, la Fundación Mundial de la Salud (número de concesión OPPGH5337).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| PBS | Sigma, Reino Unido | P4417 | comprimidos pH 7,4 |
| Glucosa | Sigma, Reino Unido | G8270 | 99,5% (molecular) grado |
| Cloruro de amonio | Sigma, Reino Unido | A9434 | 99,5% (molecular) grado |
| Heparina (sal de litio) | Sigma, Reino Unido | H0878 | |
| Hi-FCS | Gibco, Life Technologies, Reino Unido | 10500-064 | 500 ml |
| DPBS | Sigma, Reino Unido | D4031 | Filtrado estéril |
| Mr. Frosty | Nalgene, Reino Unido | ||
| Giemsa | Sigma, Reino Unido | G5637 | |
| D-Luciferina | Perkin Elmer, Reino Unido | ||
| Sigma, Reino Unido | 115144-35-9 | ||
| Aceturato de dimenezeno | Sigma, Reino Unido | D7770 | Grado analítico |
| IVIS Lumina II | Perkin Elmer, Reino Unido | otros bioimagers disponibles p. ej. de Bruker, Kodak | |
| Living Image v. 4.2 | Perkin Elmer, Reino Unido | software propietario para los instrumentos IVIS de Perkin Elmer; otros instrumentos pueden tener su propio | |
| ml Jeringa | Fisher Scientific, Reino Unido | 10142104 | |
| 20 ml Jeringa | Fisher Scientific, Reino Unido | 10743785 | |
| agujas de | 25 gGreiner Bio-one | N2516 | |
| Agujas de 21 g | Greiner Bio-one | N2138 | |
| Portaobjetos de microscopio de doble esmerilado | VWR, Reino Unido | 631-0117 | |
| Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml | StarLab, Reino Unido | I1415-1000 | |
| Tubo Bijou de 7 ml | StarLab, Reino Unido | E1412-0710 | |
| Sujetador de ratón | Sigma, Reino Unido | Z756903 | Nuestro restricción se fabricó internamente, este es un modelo similar |
Referencias
- Brun, R., Blum, J., Chappuis, F., Burri, C. Human African trypanosomiasis. Lancet. 375 (9709), 148-159 (2010).
- Rodgers, J. Trypanosomiasis and the brain. Parasitology. 137 (14), 1995-2006 (2010).
- Barrett, M. P., Boykin, D. W., Brun, R., Tidwell, R. R.
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Reimpresiones y permisos
