Artículo de método

De un solo paso negativo Purificación cromatográfica de

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DOI:

10.3791/54043

18 de junio de 2016

En este artículo

Resumen

Un método de alto rendimiento para la purificación negativa de un solo paso de Helicobacter pylori recombinante proteína activadora de neutrófilos (HP-PAN) sobreexpresado en Escherichia coli mediante el uso de resinas de dietilaminoetilo en modo batch se describe. HP-PAN purificado por este método es beneficioso para el desarrollo de vacunas, medicamentos o diagnósticos para H. pylori -asociado enfermedades.

Resumen

Helicobacter pylori proteína activadora de neutrófilos (HP-PAN) es un importante factor de virulencia de Helicobacter pylori (H. pylori). Desempeña un papel crítico en H. pylori inducida por inflamación gástrica mediante la activación de varios leucocitos innatos incluyendo neutrófilos, monocitos y mastocitos. Las propiedades inmunogénicas e inmunomoduladoras de HP-NAP lo convierten en un candidato potencial de diagnóstico y de vacuna para H. pylori y un nuevo fármaco candidato para la terapia del cáncer. Con el fin de obtener cantidades sustanciales de purificado HP-NAP utilizado por sus aplicaciones clínicas, un método eficaz para purificar esta proteína con alto rendimiento y pureza necesita ser establecido.

En este protocolo, hemos descrito un método para una sola etapa de purificación cromatográfica negativo de HP-NAP recombinante sobreexpresada en Escherichia coli (E. coli) mediante el uso de dietilaminoetilo resinas de intercambio iónico (DEAE) (por ejemplo., Sephadex) iel modo por lotes n. Recombinante HP-PAN constituye casi el 70% del total de proteínas en E. coli y está casi completamente recuperado en la fracción soluble tras la lisis celular a un pH de 9,0. Bajo la condición óptima a pH 8,0, la mayoría de HP-NAP se recupera en la fracción no unida, mientras que las proteínas endógenas de E. coli se eliminan de manera eficiente por la resina.

Este método de purificación mediante cromatografía de lote modo negativo con resinas de intercambio iónico DEAE produce funcional HP-NAP de E. coli en su forma nativa con alto rendimiento y pureza. El HP-PAN purificada podría ser utilizado más para la prevención, tratamiento y pronóstico de la H. pylori -asociado enfermedades, así como la terapia del cáncer.

Introducción

Helicobacter pylori (H. pylori) es una causa importante de gastritis y úlcera péptica. Esta bacteria también ha sido clasificado como un carcinógeno en humanos por parte de la Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer, que forma parte de la Organización Mundial de la Salud, en el año 1994. Se ha estimado que la prevalencia de H. pylori es del 70% en los países en desarrollo y del 30-40% en los países industrializados 1. A pesar de que la tasa de infección de H. pylori está disminuyendo en los países industrializados, la tasa de infección de H. pylori en los países en desarrollo sigue siendo alt....

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Protocolo

La sangre humana se obtuvo de voluntarios sanos con consentimiento informado por escrito antes y aprobación de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Nacional Tsing Hua, en Hsinchu, Taiwán.

1. La expresión del recombinante HP-PAN en E. coli

  1. Preparar el plásmido pET42a-NAP que contiene la secuencia de ADN de HP-NAP de H. pylori cepa 26695 16 como se describió previamente. Preparar los plásmidos que contienen la secuencia de ADN de HP-NAP con las mutaciones puntuales deseadas como se describe (véase el Protocolo, paso 8).
  2. Transformar 10 ng de los plásmidos de ADN anteriores en E. coli BL21....

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Resultados

El diagrama esquemático del procedimiento experimental de la purificación negativa de recombinante HP-NAP expresa en E. coli mediante el uso de resinas de intercambio iónico de DEAE en modo por lotes se muestra en la Figura 1. Esta técnica de purificación se basa en la unión de proteínas y / o impurezas que no sean HP-PAN a la resina de la célula huésped. A pH 8,0, casi no hay otras proteínas, excepto HP-NAP en su forma nativa se recuperan de la fracción no unid.......

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Discusión

La cromatografía por lotes modo negativo con resinas de intercambio aniónico DEAE que aquí se presenta es adecuado para la purificación de HP-NAP recombinante sobreexpresada en E coli. Los valores de pH de los tampones utilizados en las etapas de lisis celular y la purificación son muy críticos para asegurar la solubilidad de HP-NAP en E. Los lisados ​​de E. coli y la separación eficiente de HP-NAP recombinante a partir de las impurezas de la célula huésped, respectivamente. Las células bacter.......

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Divulgaciones

HWF e YCY son inventores de las patentes TW I 432579 y US 8,673,312 para el método de purificación en un solo paso de la proteína activadora de neutrófilos Helicobacter pylori . Todos los materiales descritos en el manuscrito estarán disponibles para fines de investigación. Los autores confirman que esto no altera su adhesión a todas las políticas de JoVE sobre el intercambio de datos y materiales.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Chao-Sheng Cheng de la Universidad Nacional Tsing Hua, Taiwán, por realizar la medición del dicroísmo circular. También agradecemos a los doctores Evanthia Galanis e Ianko D. Iankov de la Clínica Mayo, EE. UU., por proporcionar el anticuerpo monoclonal anti-HP-NAP. Agradecemos a los Dres. Han-Wen Chang y Chung-Chu Chen del Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwán, por brindar asesoramiento para la aplicación del IRB, al Sr. Te-Lung Tsai del Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwán, por supervisar el análisis de neutrófilos aislados, y a la Sra. Ju-Chen Weng de la Universidad Nacional Tsing Hua, Taiwán, por su asistencia técnica. Este trabajo fue a....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Material
pET42a-NAP N/AN/Apreparado como se describe en los datos suplementarios de la Referencia 15 
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317
E. coli BL21 (DE3)Thermo Fisher Scientific IncC6000-03
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003 KanamicinaAmresco25389-94-0
http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx Isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)MD Biomedical Inc101-367-93-1http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name
=IPTG%20
fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)Sigma-Aldrich10837091001inhibidor de la proteasa
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW
N-alfa-tosil-L-lisinil-clorometilcetona (TLCK)Sigma-AldrichT7254
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW
N-tosil-L-fenilalaninil-clorometilcetona (TPCK)Sigma-AldrichT4376
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW
Estándar de proteínas (albúmina sérica bovina)Sigma-AldrichP5619 una proteína estándar para Bio-Rad Protein Assay
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW
DEAE– Sephadex   Forma de cloruro A-25Sigma-AldrichA25120Tubo
diálisis de espectro http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW/PorSpectrumSpectrum 132720con corte de peso molecular de 14 kDa
http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;
Unidades Acrodisc® con Mustang® Membrana EPall MSTG25E3para la eliminación de endotoxinas; operado a caudales que oscilan entre 1 y 4 ml/min
http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992
anticuerpo monoclonal de ratón MAb 16F4N/AN/Alevantado contra el HP-NAP purificado de la cepa NCTC 11637 de H. pylori como se describe en la Referencia 23;   Un regalo de los doctores Evanthia Galanis e Ianko D. Iankov de Mayo Clinic, EE. UU
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585
HiLoad 16/600 Superdex 200 pgGE Healthcare Life Sciences28989335para cromatografía de filtración en gel
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335
Kit de tinción de plata PlusOne, proteínaGE Healthcare Ciencias de la Vida17-1150-01http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare Ciencias de la Vida17-1440-02para la centrifugación en gradiente de densidad para purificar neutrófilos humanos
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure
_16963/17144002
Placa blanca de fondo plano de 96 pocillosThermo Fisher Scientific Inc236108http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html
LuminolSigma-AldrichA8511protegida de la luz
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW
Expand   Sistema de PCR de plantilla largaSigma-Aldrich 11681834001fuente de mezcla de enzimas de PCR de alta fidelidad
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW
Dpn INew England BiolabsR0176Shttps://www.neb.com/products/r0176-dpni
Xho INew England BiolabsR0146Shttps://www.neb.com/products/r0146-xhoi
E. coli DH5 y alfa;Thermo Fisher Scientific Inc18265-017https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017
NombreCompanyNúmero de productoComentarios
Equipment
 
Espectrofotómetro UV/VIS de doble haz U-2800Hitachi N/Afuera del mercado y actualizado a un nuevo modelo
http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers
homogeneizador de alta presión EmulsiFlex-C3Avestin IncC315320 http://www.avestin.com/English/c3page.html
Hitachi Koki himac CP80WX ultracentrífuga generalHitachi Koki Co90106401para la separación de las fracciones proteicas solubles e insolubles de lisados de E. coli
http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html
Ä KTA FPLCGE Healthcare Life Sciences18-1900-26para cromatografía de filtración en gel
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026
Aviv modelo 62ADS Espectrofotómetro CDAviv BiomedicalN/Afuera de mercado y actualizado a un nuevo modelo http://www.avivbiomedical.com/circular.php
sistema de imagen LAS-3000FujifilmN/Adescatalogado y reemplazado
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810
Contador multietiqueta Wallac 1420 (Victor2)Perkin-Elmer1420-018para detección de quimioluminiscencia
http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018
Inhibidor de la proteasa Inhibidor de la proteasa de

Referencias

  1. Centers for Disease Control and Prevention. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. Brunette, G. W., et al. , Oxford University Press. (2015).
  2. Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer....

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