Method Article

La microinyección de transgénesis y Genoma edición en tres espinas espinosos

DOI:

10.3791/54055

⸱

May 13th, 2016

 ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Manipulaciones transgénicas y la edición del genoma son críticos para probar funcionalmente las funciones de los genes y elementos cis-regulador. Aquí se presenta un protocolo de microinyección detallado para la generación de modificaciones genómicas (incluyendo construcciones mediadas por Tol2 fluorescentes transgén reportero, Talens, y CRISPRs) para el modelo emergente de pescado, el espinoso de tres espinas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El pez espinoso de tres espinas se ha convertido en un potente sistema para estudiar la base genética de una amplia variedad de características morfológicas, fisiológicas y fenotipos de comportamiento. Las notablemente diversos fenotipos que han evolucionado a medida que las poblaciones marinas se adaptan a un sinnúmero de ambientes de agua dulce, junto con la capacidad de cruzar formas marinas y de agua dulce, proporcionan un sistema de vertebrados rara en la que la genética puede ser utilizado para mapear las regiones genómicas que controlan rasgos evolucionado. Excelentes recursos genómicos ya están disponibles, lo que facilita la disección genética molecular de los cambios evolucionados. Mientras que los experimentos de mapeo generar listas de genes candidatos interesantes, se requieren manipulaciones genéticas funcionales para poner a prueba las funciones de estos genes. La regulación génica puede ser estudiado con plásmidos informadores transgénicos y BACs integrados en el genoma utilizando el sistema de transposasa Tol2. Funciones de los genes candidatos específicos y cis-elementos reguladores pueden evaluarse mediante la inducción específicamutaciones con TALEN y CRISPR / Cas9 reactivos edición genoma. Todos los métodos requieren la introducción de ácidos nucleicos en fertilizados embriones stickleback una sola célula, una tarea que se hizo difícil por el espesor corion de embriones de espinosos y la relativamente pequeña y delgada de blastómeros. Aquí, un protocolo detallado para la microinyección de los ácidos nucleicos en embriones de espinosos se describe para aplicaciones transgénicas y edición de genoma para estudiar la expresión génica y la función, así como técnicas para evaluar el éxito de la transgénesis y recuperar líneas estables.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un componente fundamental de la comprensión de cómo surge la biodiversidad es la determinación de las bases genéticas y de desarrollo de los cambios fenotípicos evolucionado en la naturaleza. El pez espinoso de tres espinas, Gasterosteus aculeatus, se ha revelado como un excelente modelo para estudiar la base genética de la evolución. Espinosos han sufrido muchos cambios evolutivos de adaptación como los peces marinos han colonizado un sinnúmero de ambientes de agua dulce en todo el hemisferio norte, lo que resulta en morfológica dramática, fisiológicos y cambios de conducta 1. Los genomas de individuos de veintiún poblaciones de espinosos se han secuenciado y ensamblado, y un mapa de ligamiento de alta densidad se ha generado para mejorar aún más el conjunto de 2,3. Experimentos de mapeo genéticos han identificado regiones genómicas subyacente fenotipos evolucionado 4-6, y en unos pocos casos, el papel funcional de genes candidatos específicos se han probado 7,8. Un número de regiones genómicas que generan cambios morfológicos se han identificado con prometedores genes candidatos, pero estos candidatos no han sido aún probado funcionalmente 9 - 12 El. Además, los espinosos son modelos comunes para estudios de genética de poblaciones / genómica 13,14, 15 especiación, comportamiento, endocrinología 1 16 17, ecotoxicología, la inmunología y parasitología 18 19. Los estudios futuros en cada uno de estos campos se beneficiarán de la capacidad de realizar manipulaciones genéticas funcionales en los espinosos. Además de la manipulación de sus secuencias de codificación, las funciones de los genes candidatos pueden evaluarse mediante el estudio de sus secuencias cis-regulador y aumentando funcionalmente, disminuyendo o eliminando la expresión del gen candidato. Métodos de microinyección y la transgénesis en los espinosos están bien establecidos 7,8,20 y fueron inicialmente desarrollados usando una meganucleasa mediada21 método descrito por primera vez en 22 medaka. El método de microinyección modificado que aquí se presenta ha sido optimizada tanto para la transgénesis mediada por Tol2 y recientemente desarrollado reactivos de edición del genoma incluyendo Talens y CRISPRs.

Se cree que los cambios en los elementos cis-regulador a ser crítica para la evolución morfológica, como cis-regulador cambios pueden evitar las consecuencias negativas de las mutaciones pleiotrópicos 23 de codificación. Por lo tanto, las pruebas y la comparación de secuencias cis-regulador putativo se ha convertido en un objetivo central de un número creciente de estudios evolutivos. Además, la mayoría de las variantes de la enfermedad humanos son variantes de regulación 24,25 y sistemas modelo de vertebrados son muy necesarios para estudiar cis-regulador Función del elemento y la lógica. Los peces que fertilizar sus embriones externamente en un gran número de vertebrados ofrecen sistemas potentes para estudiar -Reglamento cis. El sistema de transposón Tol2, en el que foreign ADN de integrarse en el genoma está flanqueado por Tol2 transposasa sitios de unión y co-inyectados con ARNm transposasa Tol2, funciona con alta eficiencia para la integración con éxito plásmido construye en los genomas de peces 26 - 28. Típicamente, un promotor de potencial se clona aguas arriba de un promotor basal (como hsp70l 29) y el gen reportero fluorescente tal como EGFP (proteína fluorescente verde potenciada) o mCherry en una cadena principal de Tol2 y se inyecta con transposasa mRNA 26. La observación de la expresión del indicador fluorescente, ya sea en embriones o descendientes con transgenes integrados de forma estable inyectados, proporciona información acerca de la regulación espacial y temporal de la expresión génica impulsado por el potenciador putativo. En experimentos adicionales, potenciadores validados se pueden utilizar para conducir la sobreexpresión específica de tejido de genes de interés.

Para el análisis de las regiones cis-regulador más grandes, de alta calidad genoma a gran insertobibliotecas IC mediante cromosomas artificiales bacterianos (BAC) se han construido tanto para los peces espinosos marinos y de agua dulce 30. Estos BAC se pueden recombineered para reemplazar un gen con un gen indicador fluorescente en el contexto de un grande (150 a 200 kb) región genómica 31. El indicador fluorescente se expresa entonces en un patrón espacio-temporal según lo determinado por las secuencias reguladoras dentro de la CAV. Para los estudios en los peces, los sitios Tol2 se pueden añadir a la BAC para facilitar la integración genómica 32,33. En etapas posteriores del desarrollo cuando la hibridación in situ es técnicamente difícil, la lectura fluorescente de la BAC se puede utilizar para estudiar los patrones de expresión de genes, como se ha demostrado para la proteína morfogenética ósea 6 stickleback (BMP6) 20. Además, los patrones de expresión fluorescentes en un individuo pueden ser rastreados a través del tiempo, que no se puede lograr con la hibridación in situ. BAC también se puede utilizar para añadir un additional copia de una región genómica para aumentar la dosis de un gen de interés.

Para el estudio de la función génica, edición genoma es un campo en expansión explosiva que se puede utilizar para producir cambios dirigidos a secuencias genómicas en una amplia variedad de organismos 34. Transcripción nucleasas efectoras del tipo activador de (Talens) son nucleasas modulares, específicos de secuencia originalmente aisladas a partir de patógenos de plantas que pueden ser diseñados precisamente para unirse directamente a una secuencia genómica de elección y generar una doble hebra romper 35,36. Agrupados espaciadas regularmente repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) / sistemas CAS fueron encontrados originalmente en bacterias y usan una guía de ARN y la proteína Cas9 para generar una ruptura en una secuencia de ADN diana complementaria a la guía 37. La posterior reparación de la rotura de doble cadena creada por ambos Talens y CRISPRs menudo deja tras de sí una pequeña inserción o deleción, lo que puede alterar la función de la secuencia diana35-37. En los espinosos, Talens se han utilizado para alterar la expresión de genes por la orientación un promotor de 20, y ambos Talens y CRISPRs han producido con éxito mutaciones en las secuencias (datos no publicados) de codificación. Un protocolo detallado para la generación de CRISPRs para uso en el pez cebra se puede utilizar como una guía para desarrollar CRISPRs para los espinosos 38.

Transgénicos y genoma experimentos de edición requieren introducción de ácidos nucleicos en un embrión de una célula recién fertilizado. Mediante la introducción de la herramienta de transgén o de edición de genoma temprano en el desarrollo, se maximiza el número de células hijas genéticamente manipulados en el embrión. embriones inyectados se criban entonces visualmente para fluorescencia o molecularmente examinados para modificaciones del genoma. Si las células que contribuyen a la línea germinal están dirigidos con éxito, el transgén o mutación se pueden transmitir a un subconjunto de la descendencia, incluso cuando la letalidad post-inyección es alta. Los peces pueden ser de mosaico o outcrossedentrecruzan y su descendencia tamiza para recuperar los alelos mutantes o un transgén integrado de forma estable de interés. Este protocolo describe métodos para introducir los transgenes y reactivos de edición del genoma en embriones de espinosos de una sola célula y el seguimiento de las modificaciones que darán éxito.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todo el trabajo de los peces fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de California en Berkeley (número de protocolo R330).

1. Preparar los ácidos nucleicos para Inyección

  1. Tol2 plásmido transgénesis (Adaptado de Fisher 26).
    1. Cortar 10 g de plásmido transposasa (PCS-39 TP) con 10 U de NotI en tampón suministrado durante 1 hora a 37 ° C para linealizar.
      Nota: Los acuerdos de transferencia de material pueden ser necesarios para obtener los plásmidos Tol2.
    2. Extraer el plásmido cortado con un 25: 1 mezcla de fenol:: 24 cloroformo: alcohol isoamílico y precipitado en etanol con acetato de sodio de acuerdo con protocolos estándar 40. plásmido resuspender en 50 l de agua libre de RNasa.
      Nota: El fenol-cloroformo se debe utilizar en una campana y los residuos deben eliminarse adecuadamente de acuerdo con las directrices institucionales.
    3. Configurar una reacción de transcripción SP6 de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    4. Use un aislador del ARNkit ación para limpiar reacción de transcripción de acuerdo con las instrucciones del fabricante; resuspender ARN en agua 50 l RNasa libre.
    5. Eliminar una alícuota de 1 l de ARN. Se calienta a 65 ° C durante 5 min para desnaturalizar las estructuras secundarias luego enfriar inmediatamente en hielo. Congelar restante reacción de transcripción a -80 ° C.
    6. Ejecutar la alícuota de ARN en un gel de 1% de agarosa en 0,5x TAE (base Tris, ácido acético, ácido etilendiaminotetraacético) tampón de ejecución con un estándar de tamaño de ARN en un carril. El producto esperado es 2200 pb; desechar si> 5% del total de ARN aparece en una mancha más pequeña que 2.200 pb, lo que indica una degradación (Figura 1).
    7. Cuantificar el ARN usando un espectrofotómetro a 260 nm. Se diluye hasta 350 ng / l en alícuotas de agua y almacenar 1 l de RNasa gratuitas a -80 ° C (bueno por lo menos dos años).
    8. Clone Tol2 reportero plásmido (por ejemplo, usando pT2HE 8 o plásmidos de los kit Tol2 41) con cis- Elemento regulador de interés. Brevemente, amplificar por PCR una secuencia de ADN genómica de interés con cebadores que contienen sitios de restricción que se encuentran en el plásmido, digerir el producto de PCR y el vector con la enzima (s), ligar el inserto en el vector, y transformar el plásmido resultante en E. competente coli 40. Aislar el plásmido con un kit que incluye un enjuague endotoxina según el protocolo del fabricante.
    9. Realizar una segunda purificación del plásmido Tol2 con un kit de purificación de PCR según el protocolo del fabricante. Eluir en 30 l de agua libre de RNasa.
      Nota: el rendimiento de este paso puede ser baja (a veces menos del 50% del plásmido de entrada).
    10. Diluir plásmido de ~ 125 ng / l en agua libre de RNasa.

figure-protocol-1
Figura 1. transposasa gel mRNA. Pro ​​reacción de transcripción purificadaconducto (1 l) se calentó a 65 ° C, se enfrió en hielo, y se ejecuta en un gel de agarosa al 1% con 0,5 x tampón de TAE a 100 V. Los tamaños de la escalera de ARN en kilobases (kb) se indican a la izquierda . El ARNm de longitud completa transposasa es una banda brillante en ~ 2,2 kb. Una pequeña pero aceptable cantidad de ARNm degradada o incompleta es visto por debajo de 2,2 kb. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. La transgénesis BAC (Ver Suster 32,33 Técnicas para BAC recombinería)
    1. Preparar BAC de E. coli usando el kit de purificación de BAC de acuerdo con el protocolo del fabricante. Utilice la precipitación con etanol para recuperar el ADN con una extracción de sodio estándar de etilo-etanol 40 y el ADN se resuspende en ~ 250 ng / l en agua libre de RNasa.
    2. Preparar ARNm transposasa como en la sección 1.1.
  2. La mutación de inducción con Talens (Ver Cermak
  3. Utilice la aplicación basada en la web para diseñar Talens para el gen de interés 42. Si es posible, el diseño Talens para interrumpir un sitio de corte con enzimas de restricción para facilitar el análisis molecular.
  4. Clon Talens y preparar plásmidos para la transcripción siguiente protocolo 35 publicaron.
  5. Transcribir mRNA TALEN con una reacción de transcripción Sp6 de acuerdo con las instrucciones del fabricante y limpiar ARNm como se describe para la transposasa en la sección 1.1.4. Cuantificar con un espectrofotómetro y se diluye hasta 200 ng / l de RNasa libre de agua. Ejecutar TALEN ARNm en un gel para asegurar que es el tamaño adecuado y no se degrada como se describe en el paso 1.1.6.
  6. Diseño de un par de cebadores de PCR para amplificar aproximadamente 100 a 200 pb que rodea la secuencia diana TALEN usando una herramienta de diseño de cebador y la secuencia de ADN diana 43. Ordenar la enzima de restricción apropiada para detectar lesiones en el lugar de destino en función de la etapa 1.3.1.
  • La transgénesis CRISPR (Ver Talbot y Amacher 38 para Diseño y Preparación de CRISPRs):
    1. Diseñar y preparar CRISPRs y Cas9 ARNm de acuerdo con el protocolo 38, y el orden apropiado cebadores de verificación y las enzimas de restricción como se describe en el paso 1.3.4.

    • 2. Preparar los reactivos de inyección

    1. Use borosilicato capilares de prepararse agujas como se describe a continuación.
      Nota: estos capilares no son los capilares estándar utilizados para la microinyección de pez cebra, y están hechas de un vidrio más grueso y más fuerte que es crítica para la punción de la dura corion stickleback.
      1. Siempre use guantes de nitrilo o de látex cuando se tira de las agujas, y no permita que entren en contacto agujas aceites de la piel o de la piel.
      2. Determinar los parámetros de micropipeta tirando empíricamente mediante ensayos de la rampa siguiendo las instrucciones del fabricante del extractor de micropipeta. Por ejemplo, con un filamento de caja, se disuaden a los siguientes parámetrosminada a ser óptimo: (calor = 515, Pull = 60, Velocidad = 60, Delay = 85, Presión = 500). Estos ajustes producen una aguja que se estrecha abruptamente en aproximadamente 12 ° para ~ 2 mm y luego una larga extensión que se estrecha en aproximadamente 2 ° para ~ 6 mm (Figura 2).
        Nota: Los parámetros adecuados variarán según el extractor y el filamento, y ciegamente el uso de un programa sin la determinación de los parámetros primero a través de ensayos de la rampa puede destruir permanentemente filamento del extractor, que es difícil y costoso de reemplazar.
      3. Siga las instrucciones del fabricante para tirar de al menos 4 agujas de micropipeta de vidrio de borosilicato con los ajustes determinados en 2.1.2.
      4. agujas en posición vertical en el tarro de almacenamiento capilar con la punta hacia abajo.
      5. Antes de la inyección, coloque el vaso de almacenamiento capilar sobre hielo para enfriar las agujas. Añadir un pedazo de toalla de papel húmeda para el frasco para evitar la evaporación una vez que las agujas están llenos.
    2. Fertilizar los óvulos (TodoEtapas llevadas a cabo a temperatura ambiente)
      1. Tira de embrague de huevos de pez espinoso hembra grávida apretando suavemente el abdomen y acariciando en una dirección anterior a posterior para empujar los huevos a través de la cloaca y en una placa de 35 x 10 mm 2 Petri. Añadir una pieza húmeda de toalla de papel en un lado de la placa de Petri (no tocar los huevos) para crear una cámara de humedad. Coloque la tapa sobre placa de Petri así que los huevos permanecen húmedas.
      2. La eutanasia espinoso macho en 0,025% Tricaína-S tamponadas con bicarbonato de sodio al 0,1%.
      3. Cortar y abrir el abdomen, eliminar los testículos y macerar en 250 l solución de Hank (ver Westerfield 44 para la plena protocolo para la preparación de la solución de Hank).
      4. Abonar como máximo 100 huevos con una solución de 50 l de esperma y se agita suavemente con la punta de la pipeta para asegurar que todos los huevos son fertilizados. Si el embrague es> 100 huevos, fertilizar medio de los huevos posteriores para asegurar que todos los embriones se encuentran en una fase de una célula en el momento de la inyección. Los huevos se pueden dejar sin fertilizara temperatura ambiente durante un máximo de una hora, y el esperma generalmente dura 1-7 días a 4 ° C en solución de Hank.
      5. Mantener embriones Petri cubiertas de tapa de la placa después de la fertilización para evitar el secado. Permitir 20-25 min para la primera celda a surgir y hincharse (preparar materiales de inyección durante este tiempo).
      6. Llenar un plato de 150 mm x 15 mm de Petri con agua pez espinoso. (Para hacer que el agua pez espinoso, preparar primero el 10% de bicarbonato de sodio disuelto en agua desionizada. A continuación, añadir 3,5 g de la mezcla de agua de mar artificial y 0,217 ml de 10% de bicarbonato de sodio por 1 litro de agua desionizada, y revuelva / agite vigorosamente para disolver la sal.)
    3. Preparar la solución de inyección (mientras que los huevos están fertilizando)
      1. Preparar la solución de inyección de acuerdo con la Tabla 1 y almacenar en hielo.
        Nota: las concentraciones de algunos ácidos nucleicos se han incrementado de los publicados para el pez cebra debido al aumento del volumen de la blastómero stickleback.
    Reactivo inyección Tol2 inyección de BAC inyección TALEN la inyección de CRISPR
    ARNm Tol2 350 ng 350 ng - -
    ADN 150-200 ng de plásmido BAC 200-300 ng - -
    ARNm TALEN - - 200 ng de cada uno -
    ARN guía CRISPR - - - 200 ng
    ARNm Cas9 - - - 400 ng
    PBS 0,5% de fenol rojo de inDulbecco 0,5 l 0,5 l 0,5 l 0,5 l
    Agua libre de ARNasa a 5 l a 5 l a 5 l a 5 l

    Tabla 1:. Reactivos Inyección Todas las mezclas deben estar preparados para un volumen total de 5 l y se almacenan en hielo.

    1. Rellena Agujas (en el hielo; Permitir al menos 10 minutos para las agujas de relleno).
      1. Rellene al menos tres agujas con la pipeta solución inyectable 0,5 l en el extremo superior romo de la aguja, mientras que las agujas están colgando verticalmente en el tarro de almacenamiento capilar. Tenga cuidado de que la caída se mantiene en la parte superior y no gotea por un lado y evitar burbujas.
      2. Después de que el líquido rojo se haya drenado todo a la punta afilada de la aguja, añadir otros 0,5 l al extremo romo de la aguja y dejar que se drene.

    3. Preparar Inyectar Rig y la aguja para la microinyección

    Nota: Estos pasos cun general, se realizará después de la fertilización de los huevos.

    1. Encienda la luz para la transiluminación microscopio de disección y colocar una placa de vidrio ~ 13 cm x 13 cm en la base de la luz del microscopio con 15 cm de yeso hoja de sierra en la parte superior de la placa de vidrio 7. Oriente la sierra perpendicular a la del aparato de inyección con las muescas mirando hacia el soporte de la aguja.
    2. Abra el suministro de aire y asegurar que la presión se establece en ~ 200 kPa desde el regulador.
    3. Encienda la caja de control y ajustar la configuración. Presión de ajuste a ~ 150-175 kPa. Establece la duración de la inyección de 180 mseg.
    4. Aflojar el soporte de la aguja, inserte una aguja llena en el soporte hasta que la resistencia del soporte de goma se puede sentir, y apriete hasta que los dedos.
    5. Ajustar el ángulo de la aguja a aproximadamente 45 °.
    6. Utilice controles micromanipulador para ajustar la aguja por lo que el final se centra en el campo de visión. Acercar a la ampliación ~ 40X y se centran en la punta de la aguja, lo cual no debe tocarel cristal a continuación.
    7. romper suavemente la punta de la aguja, sujetándola con las pinzas de relojero. Idealmente, no se rompen de forma perpendicular, sino más bien a un ángulo de ~ 60 °. Romper cerca de la punta (no más de 2-3 anchuras fórceps de distancia desde el extremo, la Figura 2).

    figure-protocol-2
    Figura 2. agujas de microinyección no rotas y rotas. La aguja superior es ininterrumpida y la punta de la aguja inferior se ha roto con el fórceps (flecha). Las agujas se llenaron con una solución que contiene 0,05% de rojo de fenol. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    1. Presione el pedal de inyección varias veces para comprobar si la aguja se rompe. Después de un par de toques, pequeñas gotas rojas deben comenzar a salir de tes que terminó. Si no, intente romper la aguja ligeramente superior.
    2. Si la aguja tiene una burbuja de aire, aumentar la unidad de presión hacia atrás y presione el pedal varias veces rápidamente a trabajar fuera de la burbuja.
    3. Ajustar la contrapresión:
      1. Utilizar la pipeta de transferencia desechable para colocar unas gotas de agua pez espinoso en la placa de vidrio.
      2. Con cuidado baje la aguja en el agua.
      3. Aumentar la presión hacia atrás hasta que una corriente débil de líquido de color rosa emerge de la aguja (que indica la presión positiva).
        Nota: Si no hay suficiente presión de retorno, la aguja se elabore el citoplasma por acción capilar. Si hay demasiada presión de retorno, el volumen de inyección puede ser inadvertidamente demasiado grande.
      4. Retraer la aguja en la medida de lo posible de manera que no se dañe durante la preparación de los embriones (ver abajo).
    4. Como alternativa, ajustar la presión de nuevo a una graduación superior a fin de que un fuerte flujo constante de líquido sale de la aguja wuando se está sumergido en el agua. A continuación, al presionar el pedal para inyectar se hace innecesaria; Sin embargo, la inyección se debe realizar rápidamente para evitar la sobre-inyección.
      Nota: No intente esta técnica cuando primero aprender a inyectar.

    4. La microinyección

    1. Unos 25 minutos después de la fecundación, utilizar dos puntas de pipeta de 10 l para eliminar 5-10 embriones desde el embrague y la transferencia a la placa de vidrio.
    2. Aún utilizando las puntas de pipeta, separar suavemente los embriones en las muescas individuales de la hoja de sierra. Tenga cuidado de no perforar embriones.
    3. Usando una pipeta de transferencia con el extremo cortado de manera embriones de espinosos encajarán dentro, añadir agua suficiente para cubrir el espinoso los embriones, deje en el agua por 3-5 segundos, a continuación, eliminar el exceso de agua con la pipeta, dejando una pequeña cantidad de laca agua cada embrión.
      Nota: El exceso de agua hará que los chorions se endurezcan y se rompen con la aguja, pero es necesario un pequeño volumen de agua para levantar el chOrion fuera de la celda y de la yema (Figura 3A - B).
    4. A partir de la más alejada del embrión de distancia, deslice la placa de vidrio y ampliar de forma que el primer embrión llena aproximadamente el 25% del campo de visión.
    5. Bajar la aguja en el campo de visión, a continuación, utilizar la punta de la pipeta 10 l para girar suavemente el embrión para identificar el blastómeros, una protuberancia granulosa, de color ligeramente amarillo del citoplasma en la parte superior de la yema (Figura 3B), y luego girar de modo que el blastómero es directamente perpendicular al extremo de la aguja (mientras se mantiene el embrión en la sangría de la hoja de la sierra, la Figura 3C).
      Nota: las gotas de yema pueden mover como se hace girar el embrión, por lo que no utilizarlos como marco de referencia para la ubicación de la blastómeros.
    6. Bajar la aguja en el citoplasma, pero no empuje a través de la yema subyacente. Aplique presión lentamente y de manera uniforme al perforar el corion para evitar romper la aguja. Si elaguja se dobla severamente, se retraen y tratan de nuevo en una posición ligeramente diferente.
    7. Presione el pedal 3-4 veces para inyectar de forma que un bolo rojo con bordes ligeramente difusas llena de ~ 1/8 del diámetro del citoplasma (véase la figura 3D).
      1. Evitar la obtención de un bolo rojo con bordes afilados que no comienzan a difundirse, lo que indica la inyección en la yema debajo del citoplasma (Figura 3E).
      2. Si una mancha de color rosado-rojo brillante se difunde rápidamente, inserte la aguja para perforar la más blastómeros.
      3. Si el bolo de inyección se vuelve amarilla al instante, rotar el embrión para garantizar la blastómeros ha sido blanco e inyectar de nuevo (Figura 3F).

    figure-protocol-3
    Figura 3. Aspecto de embriones de espinosos antes y después de la inyección. Todos los embriones se han extraído de THe perspectiva de mirar hacia abajo a través del microscopio (a excepción de C 'y G). (A) antes de añadir agua, los embriones fertilizados tienen una apariencia uniforme, con gotitas de aceite flotando cerca de la parte superior de la yema. (B) Después de añadir agua, se hincha el corion, revelando un blastómero que sobresale de la yema de huevo y es visible en el perfil. (C) de rotación del embrión para que la aguja entra perpendicularmente a la corion y de blastómeros. (C ') Vista lateral de una aguja que ha pinchado el corion con la punta en el citoplasma. (D) La inyección en los resultados de citoplasma en una mancha roja con bordes difusos que se desvanecen con el tiempo. (E) La inyección en la yema subyacente a los resultados de citoplasma en una mancha roja con bordes definidos. (F) La inyección en la yema de huevo frente a los resultados de citoplasma en un cambio de color pH inducida de rojo a amarillo. (G) LateralHabida cuenta de los resultados de inyección, con más de Xs lugares de inyección sub-ideales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    1. Utilice los controles micromanipulador para retraer la aguja, utilizando la punta de la pipeta 10 l para sujetar el embrión si se pega a la aguja.
    2. Después de retirar la aguja, deslice la placa de vidrio para alinear la siguiente embrión con la aguja.
    3. Después de inyectar todos los embriones, utilizar la pipeta de transferencia para añadir agua a los embriones, y luego recogerlas en la pipeta de transferencia y colocar en el plato 150 mm de Petri llena de agua pez espinoso.
    4. Seque la placa de vidrio con una toalla de papel para evitar la acumulación de un exceso de agua.
    5. Distribuir embriones frescos en la sierra y repita los pasos 4.4 a 4.10.
    6. Mantenga ~ 10% de los embriones no inyectados como controles para asegurar que los embriones no inyectados desarrollan con normalidad y que se utiliza como controles de tipo salvaje para tensayos moleculares que se describe a continuación.

    5. Cuidado después de la inyección

    1. Incubar los embriones en platos de Petri a 18 ° C después de la inyección hasta la eclosión 10. Tras la eclosión, las larvas en acuarios trasera 10 como se ha descrito.
    2. verter suavemente el agua un día después de la inyección del espinoso y reemplazar con agua fresca espinoso. Reemplazar con agua fresca stickleback al menos cada dos días después de eso.
    3. Compruebe si hay embriones muertos o con malformaciones diaria. Eliminar esos embriones para prevenir la caries contaminen el agua.

    6. Análisis de los resultados de inyección

    1. Para la inyección de reporteros fluorescentes, controlar embriones a diario en una habitación a oscuras con un microscopio de disección fluorescente con una GFP o RFP filtro (dependiendo del transgén fluorescente). patrones anatómicos récord de la expresión génica con fotografías digitales y / o descripciones escritas y tabulación de la cantidad de peces con diferentes expresdominios Sion (Figuras 4 y 5).
      Nota: Los espinosos tienen autofluorescent, las células estrelladas de pigmentos que son visibles debajo de los filtros GFP a partir de los 4 días después de la fertilización (DPF).
      1. Para generar líneas estables, guardar los embriones con fluorescencia detectable y hacer crecer a la edad adulta, como se describe 10.
      2. Outcross inyecta peces adultos de tipo salvaje de pescado mediante el procedimiento de fertilización in vitro descrito en la sección 2.2 y la descendencia de pantalla para la fluorescencia como se describe en el paso 6.1 para buscar descendencia fluorescente, lo que indica la transmisión del transgén éxito.
      3. Para visualizar la fluorescencia en las larvas eclosionadas, que nadan libremente, añadir 500 l 0,8% Tricaína a la placa de Petri de 150 mm para anestesiar a los peces y esperar hasta peces dejan de moverse a la imagen. Inmediatamente enjuague varias veces con agua fresca stickleback siguientes observación y obtención de imágenes.
      4. Opcionalmente, para preservar la fluorescencia para su posterior proyección de imagen, la eutanasia larvas en0,025% (250 mg / L) tricaína tamponada con bicarbonato de sodio 0,1% y fijar durante 4 horas en 4% de paraformaldehído en 1x Tampón fosfato salino (PBS) a 4 ° C. Almacenar en 1x PBS durante hasta dos semanas.
        Nota: fondo autofluorescencia aumenta con el tiempo.
    2. Diagnóstico PCR / Genotipado de digestión para la mutación de inducción con CRISPRs o Talens - Mejor aplicarse a los 2 días después de la fecundación.
      1. Usar una pipeta de transferencia para colocar 10 embriones inyectados (2 dpf, aún en chorions) en los primeros 10 pocillos de una pocillos 12 tubo de tira de PCR. Coloque el pescado de control no inyectado en las últimas dos pozos.
      2. Eliminar el exceso de agua del espinoso.
      3. Añadir 50 l de tampón de lisis (Tris 10 mM pH 8,3, KCl 50 mM, 1,5 mM MgCl 2, 0,3% de Tween-20, y 0,3% NP-40) a cada pocillo.
      4. Coloque los tapones en los tubos y se incuban a 95 ° C durante 20 min en un termociclador.
        Nota: La yema se convertirá en blanco y correoso después de la etapa de ebullición.
      5. Retire las tapas y utilizar un CLE diferenteuna punta de pipeta de 1.000 l para macerar el embrión en cada tubo.
        Nota: los desechos Blanco recogerá en la parte inferior del tubo.
      6. Añadir 2,5 l de 10 mg / ml de proteinasa K a cada pocillo.
      7. Colocar las tapas y se incuba a 55 ° C durante 1 hora para digerir las proteínas, seguido de 95 ° C durante 20 minutos para inactivar la proteinasa K. Se debe almacenar a -20 ° C para evitar el crecimiento de moho.
      8. Realizar PCR utilizando una polimerasa de alta fidelidad, siguiendo las instrucciones del fabricante. Utilice el lisado de embrión como plantilla de ADN.
        Nota: Tenga cuidado para eliminar el líquido de la parte superior del tubo para la plantilla de ADN, evitando cualquier corion o escombros visibles yema en la parte inferior del tubo.
      9. Mezclar el producto de PCR en un volumen igual de una mezcla maestra de enzimas de restricción que contiene tampón específico de la enzima 1x y 0,25 l de enzima por muestra. Siempre guarde medio del producto de PCR sin cortar para el ensayo en un gel para confirmar los productos de PCR son del tamaño predicho. Se incuba la mezcla con PCR enzima en las condiciones apropiadas parala enzima de restricción.
        Nota: Algunos enzimas pueden requerir otras relaciones de tampón de enzima al producto PCR; ajustar la concentración de tampón, si los controles no inyectados no muestran la digestión completa.
      10. Después de la digestión, los productos en un gel de agarosa al 1% junto a una escalera de tamaño de ADN para confirmar los tamaños producto esperado.
        Nota: Las bandas sin cortar en embriones inyectados indican la presencia de lesiones moleculares (Figura 6) y controles no inyectados deben estar completamente digeridos para interpretar los resultados.
      11. Para confirmar las lesiones, cortar bandas sin cortar a partir de geles de agarosa y purificar el ADN con un kit de extracción de gel. Utilizar la secuenciación de Sanger, idealmente usando un cebador de secuenciación interna para los cebadores de PCR, para confirmar lesiones. En F 0 inyecta embriones, una mezcla de las lesiones es probable que estar presente, haciendo que la calidad de la Sanger leer para degradar cerca del sitio de destino.
      12. Para producir una línea estable, guardar todos los embriones inyectados de garras que dan positivo para las lesiones moleculares. GRAMOremar hasta peces, polinización cruzada, y luego filtrar un subconjunto de F 1 embriones de lesiones moleculares como se describe en los pasos 6.2.1 a través 6.2.11. Si se identifican los portadores heterocigotos, crecer el F restante 1 embriones hasta la edad adulta e identificar a los individuos heterocigóticos utilizando ADN extraído de un clip de la aleta caudal.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Para transgenes de genes informadores que tienen potenciador de la actividad, la inyección con éxito dará lugar a la expresión específica, celular del transgén (Figura 4A, 4C). Peces inyectados pueden ser outcrossed para producir líneas estables (ejemplo de una línea estable de BAC se muestra en la Figura 4B). La inyección de ADN en embriones de espinosos típicamente resulta en la letalidad mucho mayor que el ARN solo. Es típico ver hast...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    La inyección de embriones de espinosos de una sola célula para la transgénesis o la edición genoma presenta tres retos principales. En primer lugar, en relación con embriones de pez cebra, el pez espinoso embrionaria corion es difícil y, a menudo romper las agujas. Este problema puede superarse parcialmente mediante el uso de micropipetas de vidrio más gruesas y más fuertes y la inyección perpendicular al corion (véase el Protocolo, la Figura 2). Asegurar que tan poco agua como sea posible se añade a lo...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Los autores no tienen nada que revelar.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Este trabajo fue financiado en parte por el NIH R01 # DE021475 (CTM), una subvención del NIH predoctoral de Formación 5T32GM007127 (PAE), y una beca de investigación de Graduados de la NSF (NAE). Damos las gracias a Kevin Schwalbach para realizar recombinería y las inyecciones de BAC, Nick Donde para la generación de datos de secuenciación de Sanger CRISPR, y Katherine Lipari de información útil sobre el protocolo de inyección.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Microscopio estereoscópico con transiluminaciónLeicaS6e/ KL300 LED
    Micromanipulador manual InstrumentaciónCientífica AplicadaMM33Micromanipulador Marzhauser M33
    Sistema de inyección de presiónInstrumentación Científica AplicadaMPPI-3
    Unidad de contrapresiónInstrumentación Científica AplicadaBPU
    Kit de soporte de micropipetaInstrumentación científica aplicadaMPIP
    Soporte de base magnéticaInstrumentación científica aplicadaBase magnética
    Interruptor de pieInstrumentación científica aplicadaFSW
    Placa de hierro (base magnética)NarishigeIP
    Flameado/Marrón Extractor de micropipetasInstrumentoSutterP-97
    Pipetas de transferencia desechablesFisher13-711-7M
    0,5% rojo fenol en DPBSSigma P0290trazador de inyección
    #5 pinzas, biologie dumoxel Fine Science Tools11252-30para romper agujas
    Tarro de almacenamiento de micropipetasWorld Precision InstrumentsE210sostiene agujas de
    6", 6 dientes por pulgada sierra de yeso para paneles de yesoLenox20571 (S636RP)sostiene huevos para inyección
    13 cm x 13 cm placa de vidriocualquier ferretería-Capilaresde
    vidrio de borosilicato, 1,0 mm OD/0,58 mm ID World Precision Instruments1B100-F4* vidrio más duro que el pez cebra capilares de inyección
    150 x 15 mm Placa de PetriFisherFB0875714criar embriones espinosos
    35 mm x 10 mm Placa de PetriFisher08-757-100Aalmacenar huevos preinyección
    Instant Ocean SaltInstant OceanSS15-10
    Bicarbonato de sodioSigmaS5761-500G
    Metanosulfonato de tricaína/MS-222Western Chemical IncMS222anestesia/eutanasia
    para peces Kit de transcripción Sp6AmbionAM1340Para la transcripción de TALENs y ARNm transposasa
    RNeasy kit de limpiezaQiagen74104purificar transposasa o ARN TALEN
    QiaQuick PCR kit de limpiezaQiagen28104limpiar plásmidos para inyección
    Proteinasa K 20 mg/mlAmbionAM2546para la preparación de ADN
    Nucleobond BAC 100 kitClontech740579para la preparación de ADN BAC
    NotINEBR0189L
    Phusion polimerasaFisherF-530L
    Qiagen PlasmidPlus Midi kitQiagen12943contiene tampón de enjuague de endotoxinas
    QIAQuick Extracción de gelQiagen28704 para secuenciar mutaciones inducidas
    Fenol:cloroformo:Alcohol isoamílicoSigmaP2069-100ML
    Acetato de sodioSigmaS2889-250G
    Etanol (grado de biología molecular)SigmaE7023-500ML
    AgarosaSigmaA9539
    50x Tampón de Tris-acetato-EDTAThermoFisherB49
    0.5-10 Kb Escalerade ARNThermoFisher15623-200
    Nanodrop  EspectrofotómetroThermo ScientificNanodrop 2000
    ParaformaldehídoSigma158127-500G
    10x PBSThermoFisher70011-044
    1 kb Plus Escalera de ADNThermoFisher10787-018
    Cloruro de potasioSigmaP9541-500G
    Cloruro de magnesioSigmaM8266-100G
    NP-40ThermoFisher28324
    Tween 20SigmaP1379-500ML
    Tris pH 8.3TeknovaT1083
    Tubo de PCR de 12 tirasThermo ScientificAB-1113

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Bell, M. A., Foster, S. A. The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback. , Oxford University Press. (1994).
    2. Jones, F. C., et al. The genomic basis of adaptive evolution in threespine sticklebacks. Nature. 484 (7392), 55-61 (2012).
    3. Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing. G3. 5 (7), 1463-1472 (2015).
    4. Miller, C. T., et al. Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait Loci. Genetics. 197 (1), 405-420 (2014).
    5. Shapiro, M. D., et al. Genetic and developmental basis of evolutionary pelvic reduction in threespine sticklebacks. Nature. 428 (6984), 717-723 (2004).
    6. Colosimo, P. F., et al. Widespread parallel evolution in sticklebacks by repeated fixation of Ectodysplasin alleles. Science. 307 (5717), 1928-1933 (2005).
    7. Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
    8. O'Brown, N. M., Summers, B. R., Jones, F. C., Brady, S. D., Kingsley, D. M. A recurrent regulatory change underlying altered expression and Wnt response of the stickleback armor plates gene EDA. eLife. , e05290(2015).
    9. Cleves, P. A., et al. Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).
    10. Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 281 (1788), 20140822(2014).
    11. Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution. EvoDevo. 5 (1), (2014).
    12. Ellis, N. A., et al. Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks. Development. 142, 2442-2451 (2015).
    13. Hohenlohe, P. A., Bassham, S., Currey, M., Cresko, W. A. Extensive linkage disequilibrium and parallel adaptive divergence across threespine stickleback genomes. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 367 (1587), 395-408 (2012).
    14. Hohenlohe, P. A., et al. Population genomics of parallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags. PLoS Genet. 6 (2), e1000862(2010).
    15. McKinnon, J. S., Rundle, H. D. Speciation in nature: the threespine stickleback model systems. Trends Ecol. Evol. 17 (10), 480-488 (2002).
    16. Shao, Y. T., et al. Androgen feedback effects on LH and FSH, and photoperiodic control of reproduction in male three-spined sticklebacks, Gasterosteus aculeatus. Gen. Comp. Endocrinol. 182, 16-23 (2013).
    17. Katsiadaki, I., et al. Three-spined stickleback: an emerging model in environmental endocrine disruption. Environ. Sci. Int. J. Environ. Physiol. Toxicol. 14 (5), 263-283 (2007).
    18. Lenz, T. L., Eizaguirre, C., Rotter, B., Kalbe, M., Milinski, M. Exploring local immunological adaptation of two stickleback ecotypes by experimental infection and transcriptome-wide digital gene expression analysis. Mol. Ecol. 22 (3), 774-786 (2013).
    19. Barber, I. Sticklebacks as model hosts in ecological and evolutionary parasitology. Trends Parasitol. 29 (11), 556-566 (2013).
    20. Erickson, P. A., et al. A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression. Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).
    21. Hosemann, K. E., Colosimo, P. F., Summers, B. R., Kingsley, D. M. A simple and efficient microinjection protocol for making transgenic sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1345-1355 (2004).
    22. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech. Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
    23. Carroll, S. B. Evo-Devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134 (1), 25-36 (2008).
    24. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
    25. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
    26. Fisher, S., et al. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 1 (3), 1297-1305 (2006).
    27. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11403-11408 (2000).
    28. Kikuta, H., Kawakami, K. Transient and stable transgenesis using Tol2 transposon vectors. Methods in Moleculario Biology: Zebrafish. , 69-84 (2009).
    29. Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Dev. Camb. Engl. 127 (9), 1953-1960 (2000).
    30. Kingsley, D. M., et al. New genomic tools for molecular studies of evolutionary change in threespine sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1331-1344 (2004).
    31. Mortlock, D. P., Guenther, C., Kingsley, D. M. A general approach for identifying distant regulatory elements applied to the Gdf6 gene. Genome Res. 13 (9), 2069-2081 (2003).
    32. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
    33. Suster, M. L., Sumiyama, K., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish and mice. BMC Genomics. 10 (1), 477(2009).
    34. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
    35. Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).
    36. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
    37. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
    38. Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).
    39. Kawakami, K., et al. A Transposon-Mediated Gene Trap Approach Identifies Developmentally Regulated Genes in Zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
    40. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
    41. Villefranc, J. A., Amigo, J., Lawson, N. D. Gateway compatible vectors for analysis of gene function in the zebrafish. Dev. Dyn. 236 (11), 3077-3087 (2007).
    42. Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40 (W1), W117-W122 (2012).
    43. Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), e115(2012).
    44. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio) . , 5th Edition, University of Oregon. Press: Eugene, OR. (2007).
    45. Dale, R. M., Topczewski, J. Identification of an evolutionarily conserved regulatory element of the zebrafish col2a1a. Dev. Biol. 357 (2), 518-531 (2011).
    46. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
    47. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of Gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Tags

    Stickleback EmbryosMicroinjection TechniqueTransgenesis ApplicationsGenome EditingTol2 TransposaseTALEN CRISPRBlastomere InjectionChorion PenetrationTransgene ExpressionStable Lines

    Related Articles