El diseño y desarrollo de un ensayo colorimétrico de nanopartículas aptámero-oro para la detección de moléculas pequeñas para aplicaciones en-el-campo se examinó. Además, una aplicación colorimétrico smart-dispositivo (app) fue validado y se estableció el almacenamiento a largo plazo del ensayo para uso en el campo.
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Artículo de método
Diseño y Desarrollo de aptámeros y oro nanopartículas basados en ensayos colorimétricos para aplicaciones en-el-campo
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Resumen
Resumen
El diseño y desarrollo de una nanopartícula de oro-aptámero (AuNP) ensayo colorimétrico para la detección de moléculas pequeñas para aplicaciones en-el-campo se examinó. Los ensayos de color basadas objetivo AUNP selectiva se han desarrollado en el laboratorio de prueba de concepto controladas. Sin embargo, estos sistemas no han sido ejercida a un punto de fallo para determinar su uso práctico más allá de la configuración de laboratorio. Este trabajo describe un enfoque genérico para diseñar, desarrollar y solucionar problemas de un ensayo colorimétrico aptámero-AuNP para las pequeñas moléculas y analitos utilizando el ensayo para los ajustes en-el-campo. El ensayo es una ventaja, ya aptámeros adsorbidos pasivar las superficies de las nanopartículas y proporcionan un medio para reducir y eliminar las respuestas positivas falsas a analitos no objetivo. La transición de este sistema para usos prácticos necesario definir no sólo el período de validez del ensayo aptámero-AuNP, pero el establecimiento de métodos y procedimientos para la ampliación de la capaci almacenamiento a largo plazodades. Además, una de las preocupaciones reconocidas con lectura colorimétrica es la carga que para los analistas identificar con precisión los cambios a menudo sutiles en el color. Para disminuir la responsabilidad de los analistas en el campo, un protocolo de análisis de color fue diseñado para realizar las tareas de identificación de color sin la necesidad de llevar a cabo esta tarea en el equipo de calidad de laboratorio. Se describe el método para crear y probar el protocolo de análisis de datos. Sin embargo, para entender e influir en el diseño de los ensayos de aptámeros adsorbidos, las interacciones asociadas con el aptámero, objetivo y AuNPs requieren más estudios. El conocimiento adquirido podría conducir a la adaptación de los aptámeros para una funcionalidad mejorada.
Introducción
Colorimetría es una de las técnicas más antiguos utilizados en química analítica. Para esta técnica, una determinación cualitativa o cuantitativa del analito se realiza basándose en la producción de un compuesto coloreado 1. Por lo general, los ensayos de color utilizan reactivos que experimentan un cambio de color en presencia de la especie de analito, lo que se traduce en un cambio de color observable o detectable en el espectro de luz visible. Colorimetría se ha utilizado en la detección de blancos que van de átomos, iones y moléculas pequeñas a moléculas biológicas complejas tales como ácidos desoxirribonucleico (ADN), péptidos y proteínas 2-4.
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Protocolo
1. Síntesis través de la reducción de Citrato de nanopartículas de oro (AuNP) y Caracterización
- Limpiar un matraz Erlenmeyer (500 ml) y una gran barra de agitación con 5 ml de ácido nítrico concentrado y 15 ml de ácido clorhídrico concentrado en una campana de seguridad química.
- Mojar toda la superficie del matraz con el lavado con ácido, enjuagar el matraz con agua libre de nucleasa, y dejar que el matraz se seque.
- Añadir 100 ml de cloruro de oro 1 mM (III); usar una hoja de papel de aluminio para cubrir la parte superior del ácido limpiado matraz Erlenmeyer y calor con agitación continua en una placa caliente hasta que hierva....
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Resultados
El objetivo principal de este trabajo fue desarrollar e investigar la estabilidad y robustez del aptámero AUNP ensayos colorimétricos basados para su uso en el campo. Como se ha destacado en una publicación anterior, dos estrategias distintas para crear el ensayo fueron investigados 7. Los ensayos se denominan el aptámero de ensayo libre y el ensayo de aptámeros adsorbido. El aptámero de ensayo adsorbida fue más atractivo para los fines de un ensayo de detección fielda.......
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Discusión
Durante la última década, ensayos colorimétricos basados en nanopartículas se han desarrollado para la detección de blancos incluyen pequeñas moléculas, ADN, proteínas y células de 2-4. Los ensayos que utilizan DNA aptámeros con nanopartículas han ido ganando interés. Típicamente, estos ensayos colorimétricos se llevan a cabo mezclando el ADN de aptámero con moléculas de analito seguido de la adición a AuNPs 9-10. Sin embargo, estos ensayos se han utilizado en las manifestaciones de prueba de con.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado parcialmente por la Oficina de Investigación Científica de la Fuerza Aérea y el Subsecretario de Defensa para Investigación e Ingeniería (Oficina de Biometría y Forense de Defensa). La participación en JES fue apoyada por una Beca de Asociación de Investigación del Consejo Nacional de Investigación en el Laboratorio de Investigación de la Fuerza Aérea.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cloruro de oro(III) hidratado | Sigma | 254169 | La pureza del 99,999% es importante y las soluciones se hicieron frescas cada vez |
| Dihidrato de citrato de sodio | Sigma | W302600-1KG-K | Hemos comprobado que el fabricante afecta mucho a los ensayos AuNP, y las soluciones se hicieron nuevas cada vez |
| Sinergia | Bio-TEK | HT | Cualquier espectrómetro de absorbancia funcionará, pero un lector de placas proporciona análisis de múltiples muestras |
| 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-ácido HEPES (HEPES) Buffer, 1 M esterilizado | Amresco | J848 | Cualquier marca esterilizada sirve |
| Corning, sistema de filtrado de 250 ml, 0,22 & micro; Acetato de celulosa de m | Pescador | 430767 | Se han encontrado otras membranas capaces de eliminar los AuNPs |
| Espectrofotómetro UV | Varian | Cary 300 | Cualquier espectrómetro de absorbancia funcionará |
| Cloruro de Magnesio Hexahidrato | Fluka | 63068 | ≥ 98% cualquier marca funciona |
| ADN | IDT | Costumbre | El ADN se purificaba con una columna de desalación, se pueden emplear técnicas de purificación superiores |
| Procaína clorhidrato | ACROS | AC20731-1000 | Se preparó un 99% de existencias de 1 mg/ml de metanol |
| Ácido clorhídrico | Pescador | A144S-500 | 36,5-38,0% con otras marcas funcionan |
| Cocaína clorhidrato | Lipomed | COC-156-HC-1LM | Hemos comprobado que el fabricante afecta mucho a los ensayos AuNP |
| Ácido nítrico | Pescador | A509-SK212 | 65% con otras marcas funcionará |
| Solución de cloruro de sodio, grado 5 M de biorreactivo | Sigma | S5150-1L | Las soluciones estériles hechas de sólido funcionan |
| Pirocarbonato dietiliano | Sigma | D5758-25 mL | ≥ 97% de cualquier marca funciona |
| Clorhidrato de ecgoninemetiléster | Lipomed | COC-205-HC-1LM | Obtuvimos el control EME del mismo fabricante que el objetivo de la cocaína |
| Tubos microcentrífuga, Axygen Scientific, no estériles, 1,7 Ml | VWR | 10011-722 | Hemos comprobado que el fabricante afecta mucho a los ensayos AuNP, y los tubos fueron autoclavados internamente |
| Agua libre de nucleasas | |||
| metanol |
Referencias
- Housecroft, C., Constable, E. Chemistry: an introduction to organic, inorganic, and physical chemistry. , Pearson Education. ISBN: 9780131275676 349-353 (2006).
- Bunka, D., Stockley, P. Aptamers come of age-at last. Nat. Rev. Microbiol. 4 (8), 588-596 (2006).
- Mayer, G.
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Reimpresiones y permisos
