Diseño y Desarrollo de aptámeros y oro nanopartículas basados ​​en ensayos colorimétricos para aplicaciones en-el-campo

Resumen

El diseño y desarrollo de un ensayo colorimétrico de nanopartículas aptámero-oro para la detección de moléculas pequeñas para aplicaciones en-el-campo se examinó. Además, una aplicación colorimétrico smart-dispositivo (app) fue validado y se estableció el almacenamiento a largo plazo del ensayo para uso en el campo.

Resumen

El diseño y desarrollo de una nanopartícula de oro-aptámero (AuNP) ensayo colorimétrico para la detección de moléculas pequeñas para aplicaciones en-el-campo se examinó. Los ensayos de color basadas objetivo AUNP selectiva se han desarrollado en el laboratorio de prueba de concepto controladas. Sin embargo, estos sistemas no han sido ejercida a un punto de fallo para determinar su uso práctico más allá de la configuración de laboratorio. Este trabajo describe un enfoque genérico para diseñar, desarrollar y solucionar problemas de un ensayo colorimétrico aptámero-AuNP para las pequeñas moléculas y analitos utilizando el ensayo para los ajustes en-el-campo. El ensayo es una ventaja, ya aptámeros adsorbidos pasivar las superficies de las nanopartículas y proporcionan un medio para reducir y eliminar las respuestas positivas falsas a analitos no objetivo. La transición de este sistema para usos prácticos necesario definir no sólo el período de validez del ensayo aptámero-AuNP, pero el establecimiento de métodos y procedimientos para la ampliación de la capaci almacenamiento a largo plazodades. Además, una de las preocupaciones reconocidas con lectura colorimétrica es la carga que para los analistas identificar con precisión los cambios a menudo sutiles en el color. Para disminuir la responsabilidad de los analistas en el campo, un protocolo de análisis de color fue diseñado para realizar las tareas de identificación de color sin la necesidad de llevar a cabo esta tarea en el equipo de calidad de laboratorio. Se describe el método para crear y probar el protocolo de análisis de datos. Sin embargo, para entender e influir en el diseño de los ensayos de aptámeros adsorbidos, las interacciones asociadas con el aptámero, objetivo y AuNPs requieren más estudios. El conocimiento adquirido podría conducir a la adaptación de los aptámeros para una funcionalidad mejorada.

Introducción

Colorimetría es una de las técnicas más antiguos utilizados en química analítica. Para esta técnica, una determinación cualitativa o cuantitativa del analito se realiza basándose en la producción de un compuesto coloreado ^1. Por lo general, los ensayos de color utilizan reactivos que experimentan un cambio de color en presencia de la especie de analito, lo que se traduce en un cambio de color observable o detectable en el espectro de luz visible. Colorimetría se ha utilizado en la detección de blancos que van de átomos, iones y moléculas pequeñas a moléculas biológicas complejas tales como ácidos desoxirribonucleico (ADN), péptidos y proteínas ^2-4. Para las últimas dos décadas, los nanomateriales han revolucionado el campo de los ensayos de detección, en particular con los ensayos basados ​​en color ^5-6. La combinación de las propiedades químicas y físicas únicas de los nanomateriales con un elemento de reconocimiento selectivo de destino, tales como los anticuerpos, aptámeros de oligonucleótidos o aptámeros de péptidos, ha llevado al resurgimiento in el diseño y desarrollo de ensayos de detección colorimétricos ^7.

Las nanopartículas metálicas tienen un demostrado la propiedad de cambio de color dependiente del tamaño, que ha sido explotado en el diseño de numerosos ensayos colorimétricos. Las nanopartículas de oro (AuNPs) son de particular interés debido a un cambio de color de rojo a azul característico, cuando se induce la solución dispersada de partículas de agregar ^8, típicamente a través de la adición precisa de sal. La capacidad de controlar la transición de los dispersos (rojo) a los estados (azul) agregados ha llevado a la creación de sensores colorimétricos para iónico, pequeña molecular, péptido, proteína, y objetivos celulares ^2-4,9. Muchos de estos sensores emplean aptámeros como el motivo de reconocimiento de diana.

Los aptámeros son moléculas de ADN o ácido ribonucleico (ARN) seleccionado de un grupo aleatorio de 10 ¹² -10 ¹⁵ secuencias diferentes ^10-11. El proceso de selección de destino identifica reelementos de la cognición con afinidades de unión en el régimen de baja nanomolar, y la evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) es el proceso más comúnmente conocida ^12-13. Ventajas de aptámeros base de oligonucleótidos para aplicaciones de detección incluyen la facilidad de síntesis, modificación química controlable, y la estabilidad química ^14-15.

Un enfoque para la creación de un ensayo colorimétrico combina los nanomateriales con elementos de reconocimiento, consiste en la combinación de estas dos especies a través de la adsorción física de moléculas de ADN-aptámero a superficies AUNP. A través de unión a la diana-aptámero, el aptámero experimenta un cambio estructural ^{16 a 18,} que altera la interacción del aptámero con la superficie AuNP, lo que conduce a una respuesta de color de rojo a azul inducible ¹⁹ con la adición de sal. Esta característica sorprendente de AuNPs proporciona un mecanismo de respuesta colorimétrica observable para dispositivos basados ​​en aptámeros que se pueden utilizar a Defirmar ensayos colorimétricos para diferentes analitos.

Los ensayos de color diseñados utilizando no covalentes, aptámeros de ADN físicamente adsorbidos sobre superficies AUNP tienen el estigma de ser una plataforma de sensores débil debido a problemas con la solidez, una propensión a la insuficiencia fuera de los entornos controlados de laboratorio, y la falta de información disponible para el uso en la práctica ajustes. Sin embargo, el ensayo colorimétrico basado aptámero-AuNP era de interés debido a la simplicidad de operación y respuesta de color observable. El objetivo de este trabajo es proporcionar un protocolo para el diseño, desarrollo, operación, reducción de la superficie de respuesta relacionada con falso positivo, y el almacenamiento a largo plazo de ADN-AUNP ensayos colorimétricos basados ​​utilizando cocaína como representante del analito. Por otra parte, hemos propuesto este adsorbido aptámero enfoque de ensayo (Figura 1) de representar una ventaja debido a la simplicidad y facilidad de uso que resultó en menos pasos que el enfoque convencional para estos aptámero-AuNP culoays. Para este ensayo, el aptámero se añadió primero a las AuNPs, que se les permitió a adsorberse a la superficie por un período prolongado de tiempo. Una ventaja adicional de este enfoque fue la reducción de la respuesta a moléculas de analito no objetivo relacionados con las interacciones de superficie AUNP. Sin embargo, la reducción en la respuesta falso positivo era a expensas de la sensibilidad del ensayo. Por lo tanto es necesario un equilibrio entre la protección de la superficie y la accesibilidad analito para mantener la función del análisis. Por otra parte, uno de los principales defectos de analizar los ensayos de color a través de medios distintos de la instrumentación es que los resultados son a menudo subjetiva y abierta a la interpretación del analista a analista, sobre todo cuando se trata de diferenciar diferencias sutiles en el color. Por el contrario, hay una serie de problemas con la fabricación de instrumentación de laboratorio basado utilizable fuera del laboratorio, tales como la disponibilidad de potencia, funcionalidad y portabilidad, etc. En este trabajo, un protocolo de análisis de color fue desarrollado para more portabilidad y para eliminar algunas de las conjeturas comúnmente asociada con la interpretación de ensayo basado en el color ^20-21. En comparación con los enfoques anteriores, este esfuerzo se esforzó para empujar estos ensayos a sus límites para aplicaciones más allá de los ambientes de laboratorio.

Protocolo

1. Síntesis través de la reducción de Citrato de nanopartículas de oro (AuNP) y Caracterización

1. Limpiar un matraz Erlenmeyer (500 ml) y una gran barra de agitación con 5 ml de ácido nítrico concentrado y 15 ml de ácido clorhídrico concentrado en una campana de seguridad química.
   1. Mojar toda la superficie del matraz con el lavado con ácido, enjuagar el matraz con agua libre de nucleasa, y dejar que el matraz se seque.
2. Añadir 100 ml de cloruro de oro 1 mM (III); usar una hoja de papel de aluminio para cubrir la parte superior del ácido limpiado matraz Erlenmeyer y calor con agitación continua en una placa caliente hasta que hierva.
3. Añadir 10 ml de citrato de sodio 38,8 mM. El color cambia de claro / gris, de color rojo oscuro azul / negro, y finalmente oscuro durante varios minutos. Continuar agitando con el calor fuera de 10 min.
4. Dejar que la suspensión AuNP se enfríe a temperatura ambiente y añadir 110 l de pirocarbonato de dietilo (DEPC) con agitación continua.
5. Cubrir todo el matraz conpapel de aluminio y deje que el tratamiento con DEPC a incubar durante la noche. Almacenar todos los AuNPs en la oscuridad, en recipientes de almacenamiento ámbar o cubierto con papel de aluminio.
6. Autoclave la suspensión AuNP, enfriar a temperatura ambiente y se filtra a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,22 micras de poro. Almacenar el, autoclave solución madre AuNP filtrada en la oscuridad a 4 ° C.
   NOTA: El tratamiento con DEPC, la esterilización mediante autoclave, y el almacenamiento a 4 ° C mejorará el tiempo de conservación del ensayo de aptámero-AuNP. Almacenamiento de esta manera permitirá que para el ensayo a permanecer en funcionamiento durante más de 2 meses.
7. Calcular la concentración AuNP mediante la obtención de absorción ultravioleta-visible a 520 nm, y utilizar el coeficiente de extinción (Ɛ) 2,4 x 10 ⁸ l mol ^-1 cm ^-1 con la Ley de Beer mediante el cálculo de la concentración (c). La concentración se determinó que era de 10 nm con un tamaño de 15 nm determinado por dispersión de luz dinámica.
   NOTA: Las concentraciones varían from lote a lote. Diluir las poblaciones AUNP con agua libre de nucleasa como sea necesario para mantener la suspensión de 10 nM AuNP deseado.

2.-DNA aptámero, Buffer, Solución, Y PREPARACIÓN

1. Comprar o sintetizar secuencias de aptámeros utilizando la química estándar de la fosforamidita ²² de unión a la cocaína lo siguiente:
   MN4 ^19: 5'-GGC GAC AAG GAA AAT TCA CCT ACG AAG TGG GTC GCC-3 '
   MN6 ^19: 5'-GAC AAG GAA AAT CCT TCA ATG AAG TGG GTC-3 '
2. Purificar los aptámeros mediante desalado estándar ^23. Reconstituir oligonucleótidos en agua libre de nucleasa a cualquiera de 100 micras o soluciones madre 1 mM. Alícuota y almacenar a -20 ° C durante varios meses.
3. Compra o preparar stocks de pH estéril 1 M 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) 7,4, 100 mM de cloruro de magnesio (MgCl _2), y cloruro de sodio 1 M (NaCl).
4. Preparar 50 ml de tampón de wi agua libre de nucleasath concentraciones de HEPES 20 mM, MgCl2 ₂ mM, pH 7,4 y almacenar a temperatura ambiente durante meses.
5. Incubar el ADN con la solución madre AuNP (10 nM) durante 3-4 horas a temperatura ambiente y protegido de la luz. Variar el volumen de AuNPs como se desee para proporcionar suficiente muestra para las pruebas a realizar (2,5-7,5 ml).
   1. En este caso, utilizar las densidades de carga de 90, 120, 150, y 180 moléculas de ADN / AuNP en este trabajo. Variar el volumen y la concentración de ADN en consecuencia. Sintonizar la cobertura de ADN para reducir la superficie relacionada respuestas de color AUNP no deseadas de analitos no objetivo.
      NOTA: El aumento de la cobertura de ADN reducirá la sensibilidad del ensayo. Las densidades de carga se calculan a partir de conocer la concentración de la población de AuNP, y calcular el número total de AuNPs presentes en el volumen deseado para su uso en experimentos. Si se desean las densidades reales de cobertura, existen protocolos para obtener esos valores ^7. La cobertura de ADN se determinó mediante el uso de un 50 kDa mcolumna de corte giro peso MOLECULAR para separar el ADN AuNP unida de la ADN libre. Las AuNPs son demasiado grandes para pasar a través de la columna de centrifugación, mientras que el ADN libre pasará a través fácilmente. El siguiente paso es cuantificar el ADN libre recolectados a través de medidas de absorbancia o un solo colorante fluorescente de ADN de cadena.
6. Añadir un volumen igual de HEPES 20 mM, 2 mM MgCl _2, pH 7,4 tampón y colocar la muestra a 4 ° C en la oscuridad durante la noche. El ensayo de aptámero-AuNP estaba en una HEPES 10 mM, 1 mM MgCl _2, pH 7,4 (tampón de ensayo).

3. La sal de titulación y preparación de las pruebas

1. Determinar la concentración inicial de sal necesaria para inducir la respuesta de color de ensayo mediante titulación de sal con el blanco de ensayo. Añadir 20 l de metanol (en blanco) a 180 ml de alícuotas de ensayo de aptámero-AuNP en una placa de 96 pocillos. Valorar las muestras con el aumento de los volúmenes de existencias de solución de NaCl (1 M o 2 M) y determinar el punto de equivalencia (Figura 2 NOTA: El ensayo se puede escalar a volúmenes más pequeños, manteniendo la relación de metanol en blanco (o analito disuelto) para ensayo de aptámero-AuNP la misma.
   1. Aquí, determinar el volumen de NaCl necesaria para causar el cambio de color más mínimo por la observación visual. La concentración de partida para el ensayo fue de 75 mM y 130 mM para MN4 y MN6, respectivamente, a un / AuNP densidad cobertura 60 molécula de ADN.
      NOTA: Para una determinación cuantitativa de la concentración inicial de sal, el punto medio de la curva de valoración sirve como un buen punto de partida. Además, las concentraciones utilizadas varían en función de la aptámero, las densidades de cobertura de ADN, desde el rendimiento del día a día, y el lote a lote.
2. Optimización de la respuesta del ensayo, se añaden 20 l de moléculas de analito diluidas en metanol a 180 ml de alícuotas de ensayo de aptámero-AuNP en una placa de 96 pocillos a temperatura ambiente. Inmediatamente añadir la concentración de NaCl determinado en la etapa anterior para iniciar la respuesta de color del ensayo.
   NOTE: Utilizar una pipeta multicanal para realizar múltiples experimentos de forma simultánea.
3. Obtengan el mayor cambio de color posible aumentando o disminuyendo la concentración de NaCl, y la comparación de la respuesta objetivo a la respuesta en blanco. Usar la concentración de NaCl que proporciona la mayor diferencia de la respuesta.
4. Observar o medir la respuesta del ensayo seg 150 después de la adición de NaCl. Analizar la absorbancia a 650 nm y 530 nm utilizando un espectrómetro u obtener una foto de cámara digital de la respuesta del ensayo (véase la sección 4 para el protocolo de análisis de la foto).
   NOTA: Se utilizó un lector de microplacas para la obtención de las mediciones para este trabajo.
5. Representar gráficamente los resultados como la relación de la absorbancia obtenida a 650 nm y 530 nm (E ₆₅₀ / E ₅₃₀₎ como una función de la concentración de analito. Normalizar la respuesta del ensayo a la señal en blanco como se hizo en este trabajo.

4. Fotográfico y Digital Image Protocolo de Análisis Análisis del color

1. Prepare las muestras de ensayo como se describe (secciones 3.2-3.3). Coloque la placa de 96 pocillos en un transiluminador.
   NOTA: Una transiluminador estándar de laboratorio suele ser demasiado brillante para obtener imágenes digitales se pueden utilizar para este análisis. Estos transiluminadores causan regularmente espaciadas "líneas oscuras" para aparecer en la imagen digital debido a la intensidad de la fuente luminosa. Hacer un transiluminador de un diodo emisor de luz (LED) de la caja ligera con base y un trozo de plástico opaco funciona bien.
2. Obtener fotos de la placa de 96 pocillos a 150 seg después de la adición de NaCl, importar las imágenes en el software de análisis de imagen, y calcular los valores de rojo, verde y azul promedio (RGB), utilizando una técnica de promediado incrementales, tal como se muestra en la ecuación 1 ^24:
   (1)
3. Convertir los valores RGB de (sRGB) espacio de color RGB estándar para el espacio de color diagrama de cromaticidad (CIExyY), utilizando las siguientes ecuaciones ^24:
   (2)
   (3)
   (4)
4. Convertir los valores RGB exponenciales a valores RGB lineales usando la ecuación 2. La matriz especificado en la ecuación 3 se utiliza para calcular la X, Y y Z de los valores de espacio de color CIE ^24.
5. Calcular los valores de x e y de cromaticidad usando la ecuación 4 que representa el color promedio de los pixeles en las zonas seleccionadas para el análisis ^24.
6. Realizar el análisis de cada bien y representar gráficamente los valores de cromaticidad para generar una curva de calibración (Figura 4). Obtener el error estándar al analizar el color de las diferentes áreas de la misma también.

5. Congelación de aptámeros-AuNP Ensayo para el almacenamiento a largo plazo

1. Preparar los componentes del ensayo aptamer AuNP como se describe en las secciones 2.4 y 2.5. Hacer soluciones separadas que contienen 1 g / ml de trehalosa y 1 g / ml de sacarosa en agua libre de nucleasa para hacer la solución Cryogen.
   NOTA: Las altas concentraciones de trehalosa y sacarosa se utiliza para reducir el factor de dilución cuando se prepara el ensayo para la congelación. Calentar las soluciones de azúcar en una placa caliente en un vaso de precipitados de agua para disolver completamente los azúcares antes de su uso.
2. Hacer una solución que contiene 19,2 mg / ml de trehalosa y 4,8 mg / ml de sacarosa con el ensayo 60 MN4-DNA / AuNP en un volumen final de 200 l en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Las concentraciones finales de la solución de criógeno variarán con la cobertura de ADN.
   Nota: Las muestras que han de congelarse no debe superar los 300 l. Los volúmenes más grandes no pueden congelarse adecuadamente.
3. Flash congelar las muestras usando un congelador C -146 ° o en nitrógeno líquido. Almacenar las muestras congeladas hasta su uso. El almacenamiento puede ser en un -80 ° C o -20 ° C una vez que parpadeará congelación es completa.
4. Para este trabajo, dejar las muestras en el congelador a -146 ° másnoche y luego se transfieren a un congelador C -20 ° para el almacenamiento a largo plazo.
   NOTA: la congelación de Flash puede hacer que el aptámero-AuNPs a agregarse. Prueba de la integridad del proceso de congelación mediante la supervisión del perfil de absorbancia y comparándolo con una muestra no congelada. Si se observa la agregación, aumentar la cantidad de solución de criógeno para compensar este problema.
5. Descongelar las muestras a temperatura ambiente y utilizar sólo suficientes muestras como sea necesario para la experimentación. Obtener espectros de absorbancia de las muestras descongeladas y compare con los espectros de línea de base de una muestra tratada solución no congelada criogénico. Medir la absorbancia de 400 nm a 700 nm.
6. Realizar la valoración de sal (sección 3.1), probar el ensayo (sección 3.2), y trazar los resultados (secciones 3.3 y 3.4) como se ha descrito anteriormente.

Resultados

El objetivo principal de este trabajo fue desarrollar e investigar la estabilidad y robustez del aptámero AUNP ensayos colorimétricos basados ​​para su uso en el campo. Como se ha destacado en una publicación anterior, dos estrategias distintas para crear el ensayo fueron investigados ^7. Los ensayos se denominan el aptámero de ensayo libre y el ensayo de aptámeros adsorbido. El aptámero de ensayo adsorbida fue más atractivo para los fines de un ensayo de detección fieldable

Discusión

Durante la última década, ensayos colorimétricos basados ​​en nanopartículas se han desarrollado para la detección de blancos incluyen pequeñas moléculas, ADN, proteínas y células ^{de 2-4.} Los ensayos que utilizan DNA aptámeros con nanopartículas han ido ganando interés. Típicamente, estos ensayos colorimétricos se llevan a cabo mezclando el ADN de aptámero con moléculas de analito seguido de la adición a AuNPs ^9-10. Sin embargo, estos ensayos se han utilizado en las manifestaciones de prueba de con...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cloruro de oro(III) hidratado	Sigma	254169	La pureza del 99,999% es importante y las soluciones se hicieron frescas cada vez
Dihidrato de citrato de sodio	Sigma	W302600-1KG-K	Hemos comprobado que el fabricante afecta mucho a los ensayos AuNP, y las soluciones se hicieron nuevas cada vez
Sinergia	Bio-TEK	HT	Cualquier espectrómetro de absorbancia funcionará, pero un lector de placas proporciona análisis de múltiples muestras
4-(2-hidroxietil)piperazina-1-ácido HEPES (HEPES) Buffer, 1  M esterilizado	Amresco	J848	Cualquier marca esterilizada sirve
Corning, sistema de filtrado de 250 ml, 0,22  & micro; Acetato de celulosa de m	Pescador	430767	Se han encontrado otras membranas capaces de eliminar los AuNPs
Espectrofotómetro UV	Varian	Cary 300	Cualquier espectrómetro de absorbancia funcionará
Cloruro de Magnesio Hexahidrato	Fluka	63068	≥ 98% cualquier marca funciona
ADN	IDT	Costumbre	El ADN se purificaba con una columna de desalación, se pueden emplear técnicas de purificación superiores
Procaína clorhidrato	ACROS	AC20731-1000	Se preparó un 99% de existencias de 1 mg/ml de metanol
Ácido clorhídrico	Pescador	A144S-500	36,5-38,0% con otras marcas funcionan
Cocaína clorhidrato	Lipomed	COC-156-HC-1LM	Hemos comprobado que el fabricante afecta mucho a los ensayos AuNP
Ácido nítrico	Pescador	A509-SK212	65% con otras marcas funcionará
Solución de cloruro de sodio, grado 5 M de biorreactivo	Sigma	S5150-1L	Las soluciones estériles hechas de sólido funcionan
Pirocarbonato dietiliano	Sigma	D5758-25 mL	≥ 97% de cualquier marca funciona
Clorhidrato de ecgoninemetiléster	Lipomed	COC-205-HC-1LM	Obtuvimos el control EME del mismo fabricante que el objetivo de la cocaína
Tubos microcentrífuga, Axygen Scientific, no estériles, 1,7  Ml	VWR	10011-722	Hemos comprobado que el fabricante afecta mucho a los ensayos AuNP, y los tubos fueron autoclavados internamente
Agua libre de nucleasas
metanol