Este protocolo actual emplea reporteros fluorescentes, marcaje in vivo y técnicas de imagen intravital para permitir el monitoreo del proceso dinámico de cebado de neutrófilos en animales vivos.
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Artículo de método
Imaging intravital de neutrófilos Cebado El uso de IL-1 promotor impulsado reportero ratones DsRed
En este artículo
Resumen
Resumen
Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en la circulación de la sangre humana y son reclutados rápidamente a los sitios inflamatorios. El cebado es un evento crítico que mejora la funcionalidad fagocítica de los neutrófilos. A pesar de extensos estudios han revelado la existencia y la importancia de cebado de neutrófilos durante la infección y las lesiones, los medios de visualización de este proceso in vivo no han estado disponibles. El protocolo proporcionado permite la monitorización del proceso dinámico de neutrófilos cebado en animales vivos mediante la combinación de tres metodologías: 1) la señal del informador DsRed - se utiliza como una medida de cebado 2) etiquetado de neutrófilos in vivo - logrado por la inyección de antígeno anti-linfocitos fluorescencia conjugado 6G (Ly6G) anticuerpo monoclonal (mAb) y 3) la imagen confocal intravital. Varios pasos críticos están involucrados en este protocolo: la inflamación inducida por oxazolona piel de oreja de ratón, la sedación adecuada de los animales, las inyecciones repetidas de anticuerpos anti-Ly6G mAb, y prevención de la deriva de enfoque durante la exploración. Aunque se han observado algunas limitaciones, tales como el límite de tiempo de imagen continua (~ 8 horas) en un ratón y la fuga de isotiocianato-dextrano de los vasos sanguíneos en el estado inflamatorio de fluoresceína, este protocolo ofrece un marco fundamental para intravital de imágenes de comportamiento imprimada de neutrófilos y la función, que puede ser fácilmente ampliado para examen de otras células inmunes en modelos de inflamación de ratón.
Introducción
Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes y de corta duración en la circulación. Ellos son reclutados rápidamente a los sitios de infección o lesión, donde sirven como fagocitos profesionales a través de la liberación de oxígeno y nitrógeno intermedios reactivos, junto con gránulos que contienen péptidos antimicrobianos y proteasas 1. Durante su reclutamiento, los neutrófilos están "preparados" por varios agentes, incluidos los productos microbianos, factores quimiotácticos y citoquinas inflamatorias, lo que resulta en la funcionalidad de los fagocitos marcadamente mejorada al llegar a un sitio de la inflamación 2. Los mecanismos de ceba....
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Protocolo
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Toledo.
1. Fenotipificación de pIL1-DsRed ratones
NOTA: Offspring son generadas por la cría de los ratones heterocigotos pIL1-DsRed con los ratones de tipo salvaje (WT) C57BL6. Tres a cuatro semanas de edad cachorros se consideran listo para el fenotipado. Sangrado submandibular de ratones sigue un protocolo establecido, con modificaciones menores 23.
- El aislamiento de los glóbulos blancos de l....
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Resultados
Proyección de ratones pIL1-DsRed se realiza basándose en la señal de fluorescencia fenotípica DsRed producido por sus leucocitos de sangre periférica mediante citometría de flujo. La estimulación con LPS se sabe que inducen la producción de IL-1β en las células mieloides, incluyendo neutrófilos, monocitos y células dendríticas 26-28. Por lo tanto, los leucocitos aislados se incubaron con LPS durante 4 horas antes de la citometría de flujo análisis. A continuación, gating se es.......
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Discusión
El objetivo de este estudio es desarrollar una tecnología para el seguimiento del proceso de cebado de neutrófilos en los animales vivos, que aún no ha sido cumplido por las técnicas disponibles en la actualidad. Para lograr este objetivo, se realizan tres metodologías establecidas: 1) la inducción de la inflamación de la piel en ratones reportero DsRed promotor impulsado por IL-1 como una medida de cebado, 2) etiquetado in vivo de los neutrófilos con dosis bajas de fluorescencia de conjugado anti-Ly6G mAb, y 3.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses financieros.
Agradecimientos
Los autores no tienen agradecimientos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Heparina sódica | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-540-31 | |
| ACK tampón de lisado | Lonza | 10-548E | |
| Suero fetal bovino | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Lipopolisacáridos | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Clorhidrato de ketamina | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xilacina | LLOYD Laboratory | NADA #139-236 | |
| Acepromazine | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| Crema depilatoria | Church & Dwight | ||
| Acetona | Fisher Scientific | A16P4 | |
| Oxazolona | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 anticuerpo anti-ratón Ly6G | BioLegend | 127610 | |
| U-100 jeringa de insulina con aguja de 28 G | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran, 150 kDa | Sigma-Aldrich | 74817 | |
| Set de infusión de mariposa (aguja de 27 G) | BD | 387312 | |
| FACSCitómetro de alibur | BD | ||
| CellQuest Pro software | |||
| FV1000 | |||
| Metamorph Software | Universal Imaging |
Referencias
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).
- Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. Neutrophils in the innate immune response. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).
- Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E.....
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Reimpresiones y permisos
