La detección de funcional no codificante-variantes genéticas Uso de movilidad electroforética Shift ensayo (EMSA) y el ADN afinidad Precipitación Ensayo (DAPA)

Summary

Presentamos un plan estratégico y un protocolo para identificar variantes genéticas no codificantes que afectan la unión al ADN del factor de transcripción (TF). Se proporciona un protocolo experimental detallado para el análisis del ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) y el ensayo de precipitación de afinidad del ADN (DAPA) de la unión al ADN TF dependiente del genotipo.

Abstract

Los estudios genéticos basados en la población y la familia suelen dar lugar a la identificación de variantes genéticas que se asocian estadísticamente con una enfermedad clínica o fenotipo. Para muchas enfermedades y rasgos, la mayoría de las variantes no son codificantes y, por lo tanto, es probable que actúen afectando mecanismos sutiles y comparativamente difíciles de predecir que controlan la expresión génica. Aquí, describimos un enfoque estratégico general para priorizar las variantes no codificantes y seleccionarlas para determinar su función. Este enfoque implica la priorización computacional utilizando bases de datos genómicas funcionales, seguida de un análisis experimental de la unión diferencial de factores de transcripción (TF) a alelos de riesgo y no riesgo. Tanto para el análisis de variantes genéticas como para el análisis de variantes genéticas tanto en el ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) como en el ensayo de precipitación de afinidad del ADN (DAPA), se utiliza un oligonucleótido de ADN sintético (oligo) para identificar factores en el lisado nuclear de la enfermedad o células relevantes para el fenotipo. Para EMSA, los oligonucleótidos con o sin factores nucleares unidos (a menudo TF) se analizan mediante electroforesis no desnaturalizante en un gel de poliacrilamida de tris-borato-EDTA (TBE). Para DAPA, los oligonucleótidos se unen a una columna magnética y los factores nucleares que se unen específicamente a la secuencia de ADN se eluyen y analizan mediante espectrometría de masas o con una electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio reductor (SDS-PAGE) seguida de un análisis de Western blot. Este enfoque general puede ser ampliamente utilizado para estudiar la función de las variantes genéticas no codificantes asociadas con cualquier enfermedad, rasgo o fenotipo.

Introduction

Secuenciación y genotipado basado en estudios, incluyendo estudios de genoma completo (GWAS Association), estudios candidato locus, y profundo de secuenciación de los estudios, han identificado muchas variantes genéticas que están estadísticamente asociados con una enfermedad, rasgo o fenotipo. Contrariamente a las predicciones iniciales, la mayoría de estas variantes (85-93%) se localizan en regiones no codificantes y no cambian la secuencia de aminoácidos de las proteínas de ^1,2. Interpretación de la función de estas variantes no codificantes y la determinación de los mecanismos biológicos que los conectan a la enfermedad asociada, rasgo, o fenotipo ha d....

Protocol

1. Preparación de soluciones y reactivos

1. Ordenar sondas de oligonucleótidos de ADN personalizados para su uso en la EMSA y la DAPA.
   1. Para reducir la proteína de unión no específica, diseñar oligos cortos (entre 35-45 pares de bases (pb) de longitud) ^30, y colocar la variante de interés directamente en el centro, flanqueado por su secuencia genómica endógena 17 pb. Para oligos EMSA, añadir un 'fluoróforo 5. Para oligos DAPA, añadir una etiqueta 5 'con biotina.
   2. Ordenar tanto la cadena sentido y su cadena de complemento inverso. Alternativamente, dúplex fin (pre-recocido) oligos. Al asignar nombres a los oligos, basar la n....

Results

En esta sección, los resultados representativos de lo que cabe esperar se proporcionan al realizar una EMSA o DAPA, y la variabilidad en cuanto a se caracteriza la calidad de lisado. Por ejemplo, se ha sugerido que la congelación y descongelación muestras de proteínas varias veces puede dar lugar a la desnaturalización. Con el fin de explorar la reproducibilidad del análisis EMSA en el contexto de estos ciclos de "congelación-descongelación", dos 35 oligos pb que difieren en una variante.......

Discussion

A pesar de los avances en las tecnologías de secuenciación y genotipado han mejorado enormemente nuestra capacidad para identificar variantes genéticas asociadas con la enfermedad, nuestra capacidad para comprender los mecanismos funcionales afectadas por estas variantes se está quedando. Una fuente importante del problema es que muchas variantes asociados a la enfermedad se encuentran en n en la codificación de las regiones del genoma, lo que probablemente afectará más difícil de predecir mecanismos que controlan.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucleótidos de ADN personalizados	Tecnologías de ADN integradas		http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
cloruro de potasio	Fisher Scientific	BP366-500	KCl, para tampón CE
HEPES (1 M)	Fisher Scientific	15630-080	para tampón CE y NE
EDTA (0,5 M), pH 8.0	Life Technologies	R1021	para tampón CE, NE y recocido
Cloruro de sodio	Fisher Scientific	BP358-1	NaCl, para tampón NE
Tris-HCl (1M), pH 8.0	Invitrogen	BP1756-100	Para tampón de recocido
Solución salina tamponada con fosfato (1x)	Fisher Scientific	MT21040CM	PBS, para lavado celular
Solución de DL-Ditiothreitol (1 M)	Sigma	646563	Agente reductor
Inhibidor de la proteasa Cóctel	Thermo Scientific	87786	Previene el catabolismo del
cóctel inhibidor de la fosfatasa TF	Thermo Scientific	78420	Previene la desfosforilación de TFs
Nonidet P-40 Sustituto	IBI Scientific	IB01140	NP-40, para extracción nuclear
Kit de ensayo de proteínas BCA	Thermo Scientific	23225	Para medir la concentración de proteínas
Odyssey EMSA Buffer Kit	Licor	829-07910	Contiene todos los tampones EMSA necesarios
Geles TBE, 6%, 12 pocillos	Invitrogen	EC6265BOX	para tampón EMSA
TBE (10x)	Thermo Scientific	B52	para EMSA
FactorFinder Kit de inicio	Miltenyi Biotec	130-092-318	Contiene todos los tampones DAPA necesarios
Licor Odyssey CLx	Licor Escáner		recomendado para DAPA/EMSA
Antibiótico-Antimicótico	Gibco	15240-062	Contiene 10.000 unidades/ml de penicilina, 10.000 µ g/ml de estreptomicina, y 25 µ g/ml de Fungizone® Suero fetal bovino antimicótico
	Gibco	26140-079	FBS, para medio de cultivo
RPMI 1640 Medio	Gibco	22400-071	Contiene L-glutamina y 25 mM HEPES