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Raya de ensayo para estudiar la actividad de atracción o repulsión de un sustrato de proteína usando las neuronas del hipocampo disociadas

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DOI:

10.3791/54096

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19 de junio de 2016

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1Anatomy and Neuroscience, Hamamatsu University School of Medicine, 2Cell and Neurobiology, Zoological Institute, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

En este artículo

Resumen

Las moléculas de guía de axones regulan la migración neuronal y la navegación dirigida del cono de crecimiento. Presentamos un potente método, el ensayo de rayas, para evaluar la capacidad de las moléculas guía para atraer o repeler neuronas. En este protocolo, demostramos el ensayo de rayas mostrando la capacidad de FLRT2 para repeler neuronas del hipocampo cultivadas.

Resumen

Los axones en crecimiento desarrollan una estructura altamente móvil en su punta, denominada cono de crecimiento. El cono de crecimiento entra en contacto con señales ambientales extracelulares para navegar por el crecimiento axonal. La netrina, la hendidura, el semáfora y las efrinas son moléculas guía conocidas que pueden atraer o repeler axones al unirse a receptores y correceptores en el axón. Los receptores activados inician varias moléculas de señalización en el cono de crecimiento que alteran la estructura y el movimiento de la neurona. Aquí, describimos el protocolo detallado para un ensayo de rayas para evaluar la capacidad de una molécula guía para atraer o repeler neuronas. En este método, las neuronas del hipocampo disociadas de ratones E15.5 se cultivan en placas recubiertas de laminina procesadas con franjas alternas de ectodominio de fibronectina y proteína transmembrana 2 rica en leucina (FLRT2) y proteína de la región cristalizable (Fc) del fragmento de inmunoglobulina G (IgG) de control. Tanto los axones como los cuerpos celulares fueron fuertemente repelidos de las regiones de rayas recubiertas de FLRT2 después de 24 h de cultivo. La inmunotinción con tau1 mostró que ~90% de las neuronas se distribuyeron en las franjas recubiertas de Fc en comparación con las franjas recubiertas de FLRT2-Fc (~10%). Este resultado indica que FLRT2 tiene un fuerte efecto repulsivo sobre estas neuronas. Este poderoso método es aplicable no solo para las neuronas primarias cultivadas, sino también para una variedad de otras células, como los neuroblastos.

Introducción

Guía de axones es el proceso mediante el cual las neuronas recién formadas envían axones a su objetivo durante el desarrollo del sistema nervioso 1,2. axones en desarrollo tienen una estructura muy móviles en la punta denominado el cono de crecimiento. El cono de crecimiento detecta señales extracelulares para navegar el camino del axón. Moléculas de guía, como hendidura, semaforina, y efrinas, pueden atraer o repeler los axones en función de su interacción con los receptores adecuados y co-receptores en el axón 1,3,4. Los receptores activados transferir señales al cono de crecimiento que afectan a su organización del citoesqueleto de los movimientos de los axones y el crecimiento de cono.

Varios métodos han sido desarrollados para evaluar la acción de las moléculas de atrayentes y repelentes. Quimio-atrayentes y repelentes se pueden administrar en el medio de crecimiento / cultivo con una concentración de gradiente (por ejemplo., La cámara de Dunn o Mu diapositivas) 5,6, en un lugar muy concentrada por micro-pipette (por ejemplo., ensayo de torneado) 7 o a una concentración homogénea mediante la aplicación de baño (por ejemplo., el ensayo de colapso del cono de crecimiento) 8,9.

Otros métodos incluyen un ensayo de raya o impresión por microcontacto (μCP), en la que se recubre una quimio-atrayente o repelente en la superficie de una placa como sustrato 10-12. Thestripe ensayo fue desarrollado originalmente por Bonhoeffer y sus colegas en 1987 para analizar la cartografía topográfica en el sistema retino-chick tectal 13. El método original requiere un sistema de vacío para proteínas de la cubierta en las membranas de policarbonato Nucleopore utilizando matrices de rayas y malladas. En versiones posteriores, las proteínas recombinantes fueron impresos directamente sobre la superficie de una placa de cultivo en un patrón de rayas utilizando matrices de silicio estrecha rendija 14,15. Recientemente, varios grupos de investigación han aplicado con éxito este ensayo de franja en el análisis de las actividades de moléculas de orientación axón 16-21.

A continuación, presentamos el protocolo detallado para un ensayo que mide la raya de la atracción o repulsión de moléculas de orientación axón de las neuronas del hipocampo disociadas. Cabe destacar que este método se puede aplicar en el laboratorio mínimamente equipadas. Para este ensayo, se alternan franjas de un sustrato marcado con fluorescencia y una proteína de control se generan en un plato de plástico utilizando una matriz de silicio con rendijas 90-M y recubiertas con laminina. En nuestra demostración, disociados de neuronas del hipocampo de ratones E15.5 se cultivaron en rayas de ectodominio recombinante de fibronectina y rica en leucina proteína transmembrana-2 (FLRT2) y controlar proteína Fc 21 alterna. Después de 24 h de cultivo, tanto los axones y cuerpos celulares de las neuronas estaban fuertemente repelidos de las rayas FLRT2. La tinción con un anticuerpo anti-TAU1 reveló que ~ 90% de las neuronas se distribuyeron en las regiones Fc recubierto, en comparación con ~ 10% en el FLRT2-Fc, lo que indica que FLRT2 tiene una fuerte repulsiónfunción de las neuronas del hipocampo 21.

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Protocolo

Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de la Facultad de Medicina de la Universidad de Hamamatsu.

1. Preparación de Matrices

  1. Hervir 4-8 matrices de silicona en el microondas o en una placa caliente durante 5 minutos y dejar que se sequen por completo durante 1 hora bajo flujo laminar (lado rayado).
    Nota: Los siguientes procedimientos deben realizarse bajo flujo laminar.
  2. Golpe de aire comprimido o utilizar cinta adhesiva transparente para eliminar el polvo de la parte rayada de las matrices. Mantenga el lado rayado limpia para que pueda adherirse firmemente a la superficie de la placa.
  3. Con cuidado, coloque las matrices en placas de plástico de 6 cm presionando con un dedo (una matriz por plato, con el lado de la raya hacia abajo). Evite que las burbujas de aire entre la matriz y el plato. Marque la ubicación de las rayas en el lado inferior de la placa de cultivo.
  4. Si la matriz no se acopla, repita desde el paso 1.2.

2. Generación de la raya y laminina Revestimiento de Neurona Cultura

  1. Preparar proteína recombinante marcada con fluorescencia (25 l cada uno por inyección [etapa 2.2] o 100 l cada uno para el método de colocación [etapa 2.2.1]) mediante la mezcla de la proteína Fc de etiquetado (10 a 50 mg / ml) y una de tinte fluorescente anticuerpo conjugado anti-Fc humano (1-3 ratio: 30-150 mg / ml) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). A continuación, se incuba la mezcla durante 30 min a TA.
  2. Usando una jeringa de 22-G, inyectar 25 l de la proteína recombinante preparado en la etapa anterior (2,1) a través del pequeño orificio en el lado de la matriz (las flechas en la Figura 1A, 1C y 1E).
    1. Alternativamente, colocar 100 l de la proteína recombinante en la ranura superior de la matriz y el aspirado aproximadamente la mitad de la solución desde el pequeño agujero (flechas en la Figura 1A, 1C y 1E), de modo que la proteína recombinante permanece en las regiones rayadas.
  3. Incubar la placa durante 30 millasn a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular.
  4. Coloque 300 l de PBS en la ranura superior (Figura 1B) y aspirado desde el pequeño orificio situado en el lado de la matriz (flechas en la Figura 1A, C y E) para eliminar las proteínas no unidas recombinantes. No aspirar el PBS por completo, debido a que las proteínas se secarán. Repita este paso dos veces. (3 veces en total)
  5. Retire cuidadosamente la matriz e inmediatamente colocar ~ 100 l de proteína de control (10 a 50 g / ml; Fc) para cubrir toda el área de rayas, la creación de un revestimiento alternativo. A continuación, se incuba la placa durante 30 min a 37 ° C en la incubadora de cultivo celular.
  6. Después de lavar la superficie del plato tres veces con PBS, capa con ~ 100 l de 20 mg / ml de laminina en PBS.
    Nota: La laminina se debe descongelar en hielo para evitar la solidificación.
  7. Incubar la placa durante 1 h a 37 ° C en la incubadora de cultivo celular.
  8. Lavar la superficie del plato tres veces con PBS y añadir la cultura medium. Coloque el plato cubierto con medio de cultivo en un incubador de CO2 al 5% a 37 ° C hasta su uso.

3. El cultivo de las neuronas del hipocampo E15.5 embriones de ratón

  1. La eutanasia madre a través de la dislocación cervical y aislar tres embriones E15.5.
  2. Cortar la piel y el cráneo sagital en la línea media de la cabeza con unas tijeras, y retirar el cerebro usando una cuchara pequeña. Transferir el cerebro cuidadosamente a una placa de Petri de 60 mm que contiene 3 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS).
  3. El uso de un bisturí, cortar los hemisferios incluyendo la corteza, el hipocampo y el cuerpo estriado (Figura 2A). Entonces, diseccionar la región del hipocampo eliminando cuidadosamente las meninges, y transferir los tejidos de hipocampo disecados a un tubo de centrífuga de 15 ml que contiene 2 ml de solución de HBSS, en el hielo (Figura 2B-C). Recoger 6 hipocampos a partir de 3 embriones en el tubo, que son suficientes para el cultivo de las neuronas en 8 platos.
  4. Reemplazar el Hsolución BSS con solución de tripsina / EDTA (2 ml) y se incuba el tubo a 37 ° C durante 15 min en un baño de agua.
    Nota: Aspirar HBSS sin centrifugación y no decantar la solución de HBSS por la inclinación del tubo.
  5. Neutralizar la actividad de la tripsina mediante la adición de 500 l de suero bovino fetal (FBS).
  6. Centrifugar la mezcla a 100 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y lavar el sedimento con 2 ml de medio de cultivo. Repita este paso una vez más.
  7. Pipetear los hipocampos arriba y hacia abajo 10 veces en medio de cultivo utilizando una punta de 1.000 l con un agujero grande (cut-punta) para disociar el tejido.
  8. Cambiar a una (sin cortar) de la punta de 1.000 l regular y pipetear el tejido disociado arriba y hacia abajo para obtener una suspensión de una sola célula.
  9. Se separan las células individuales pasándolos a través de un filtro de células de malla de 80 a 100-m.
  10. Centrifugar la suspensión de células individuales filtrada a 150 xg durante 5 min.
  11. Eliminar el sobrenadante por aspiración y resuspender el pellet (neuronas) en 2 ml de medio de cultivo.
  12. Contar las células usando un hemocitómetro con tinción con azul de tripano para determinar la densidad y viabilidad. A continuación, la placa de 10.000 neuronas en 150 ml de medio de cultivo para cada conjunto de suspensión stripes.The debe ser cuidadosamente colocada para cubrir toda la región de la raya.

4. Visualización de los cuerpos celulares y axones por la tinción de inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo anti-TAU1

  1. Después de 24 h de cultivo, aspirar el medio sin perturbar las células adherentes, y fijar las neuronas con pre-calentado paraformaldehído al 4% (PFA) / 4% de sacarosa / PBS a temperatura ambiente durante 15 min.
  2. Lavar la superficie de la placa 3 veces con PBS. Si lo desea, utilice un bolígrafo de repelente al agua para dibujar un círculo alrededor de la región rayada para disminuir la cantidad de anticuerpo necesaria.
  3. Permeabilizar las neuronas con 0,3% Triton X-100 / PBS durante 5 min.
  4. Incubar las neuronas con solución de bloqueo que contiene 3% de suero de burro y 0,1% de Triton X-100 para30 min seguido de incubación con un anticuerpo anti-TAU1 (1: 200) en suero de burro 1% / 0,1% de Triton X-100 / PBS O / N a 4 ° C.
  5. Lavar la superficie de la placa 3 veces con PBS. Incubar las neuronas con un anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con fluoróforo en 1% de albúmina de suero bovino (BSA) /0.1% Triton X-100 / PBS durante 30 min.
  6. Lavar la superficie de la placa 3 veces con PBS. Cubrir la región rayada con una cubierta de vidrio de 18 mm x 18 mm con 50 l de solución antifade. evitar las burbujas de aire, que interfieren con la formación de imágenes.
  7. Obtener imágenes fluorescentes con un microscopio de fluorescencia utilizando el sistema apropiado, por ejemplo, la lente objetivo x10, conjuntos de filtros para GFP y RFP, y tiempo de exposición de 1.000 mseg (Figura 3).

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Resultados

Las neuronas del hipocampo disociadas de ratones E15.5 se sembraron y cultivaron durante 24 h en rayas de la etiqueta fluorescente de control de Fc (Figura 3A-C) o FLRT2-Fc (Figura 3D-F) alternando con Fc no marcado control. En ambos casos, las neuronas eran agregados y extendieron sus axones como paquetes. En el mando a rayas Fc / Fc, las neuronas se distribuyeron de manera uniforme en las rayas marcados con fluorescencia y no marcados, y se extendieron...

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Discusión

Este protocolo describe un ensayo de banda que utiliza la proteína recombinante y neuronas disociadas del hipocampo de ratones E15.5. Este ensayo permite la observación eficiente de respuestas de repulsión, atractivo, o neutrales de las neuronas a una proteína recombinante de interés colocado en un patrón de rayas. Una ventaja principal de este protocolo es el método simple para la generación de las rayas, en la que la proteína se imprime directamente sobre la superficie de un plato de plástico, en comparación con el mé...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por Grants-in-Aid for Scientific Research de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (23700412, 25122707 y 26670090 a S.Y.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
tubo de centrífuga de 15 mlViolamo 1-3500-01
4% Paraformaldehído (PFA)Nacalai01954-85
Alexa Fluor 488 Anticuerpo IgG antihumano de cabraThermo ScientificA11013
Alexa Fluor 594 Donkey anticuerpo IgG anti-ratónThermo ScientificA-21203Dilución 1/500
Anticuerpo Anti-Tau1Dilución de MAB3420 Chemicon1/200
AntidecoloraciónThermo ScientificP7481Se pueden utilizar medios de montaje alternativos
Suplemento B27Thermo Scientific17504-044Dilución 1/50
Albúmina sérica bovinaSigma01-2030-2
Filtro de células 100 mmmBD Falcon352360
Máquina de centrifugaciónKubota2410
Cubierta de vidrio 18mmx18mmMatsunami18x18 mm Nº 1
Bolígrafo DAKODAKOS2002Se puede utilizar un bolígrafo repelente al agua alternativo
Bisturí desechableFeather2975#11
FBSThermo Scientific10437-028
Microscopio fluorecienteNikonE600
Pinzas Nº 5Fine Science Tools11254-20
GlutaMAXThermo Scientific35050-061Dilución 1/100
Jeringa HamiltonHamilton805Ncalibre 22, 50 uL
HBSSThermo Scientific14170-112
IgG humana, Fc FragmentJackson009-000-008
LamininaThermo Scientific23017-015
NeurobasalThermo Scientific21103-049
Suero de burro normalJackson017-000-121
PBSNacalai14249-24
Penicilina-estreptomicinaThermo Scientific15070-063Dilución 1/100
Plato de cultivo de plástico, 60 mm
Disponible y adquirible en Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)
Microscopio estereoscópicoOlympusSZ61
Punta, 1000 uLWatson125-1000S
Cinta adhesiva transparenteTesa57315Se puede utilizar cinta adhesiva alternativa
Triton X-100SigmaT8787
Azul tripano, 0.4%Bio-Rad145-0013
Tripsina/EDTAThermo Scientific25300-054
Medio de cultivoNeurobasal suplementado con B27, GlutaMAX y Penicilina-Estreptomicina.
Matrices de silicona Thermo Scientific 150288

Referencias

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