Las moléculas de guía de axones regulan la migración neuronal y la navegación dirigida del cono de crecimiento. Presentamos un potente método, el ensayo de rayas, para evaluar la capacidad de las moléculas guía para atraer o repeler neuronas. En este protocolo, demostramos el ensayo de rayas mostrando la capacidad de FLRT2 para repeler neuronas del hipocampo cultivadas.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Raya de ensayo para estudiar la actividad de atracción o repulsión de un sustrato de proteína usando las neuronas del hipocampo disociadas
En este artículo
Resumen
Resumen
Los axones en crecimiento desarrollan una estructura altamente móvil en su punta, denominada cono de crecimiento. El cono de crecimiento entra en contacto con señales ambientales extracelulares para navegar por el crecimiento axonal. La netrina, la hendidura, el semáfora y las efrinas son moléculas guía conocidas que pueden atraer o repeler axones al unirse a receptores y correceptores en el axón. Los receptores activados inician varias moléculas de señalización en el cono de crecimiento que alteran la estructura y el movimiento de la neurona. Aquí, describimos el protocolo detallado para un ensayo de rayas para evaluar la capacidad de una molécula guía para atraer o repeler neuronas. En este método, las neuronas del hipocampo disociadas de ratones E15.5 se cultivan en placas recubiertas de laminina procesadas con franjas alternas de ectodominio de fibronectina y proteína transmembrana 2 rica en leucina (FLRT2) y proteína de la región cristalizable (Fc) del fragmento de inmunoglobulina G (IgG) de control. Tanto los axones como los cuerpos celulares fueron fuertemente repelidos de las regiones de rayas recubiertas de FLRT2 después de 24 h de cultivo. La inmunotinción con tau1 mostró que ~90% de las neuronas se distribuyeron en las franjas recubiertas de Fc en comparación con las franjas recubiertas de FLRT2-Fc (~10%). Este resultado indica que FLRT2 tiene un fuerte efecto repulsivo sobre estas neuronas. Este poderoso método es aplicable no solo para las neuronas primarias cultivadas, sino también para una variedad de otras células, como los neuroblastos.
Introducción
Guía de axones es el proceso mediante el cual las neuronas recién formadas envían axones a su objetivo durante el desarrollo del sistema nervioso 1,2. axones en desarrollo tienen una estructura muy móviles en la punta denominado el cono de crecimiento. El cono de crecimiento detecta señales extracelulares para navegar el camino del axón. Moléculas de guía, como hendidura, semaforina, y efrinas, pueden atraer o repeler los axones en función de su interacción con los receptores adecuados y co-receptores en el axón 1,3,4. Los receptores activados transferir señales al cono de crecimiento que afectan a su organización del citoesqueleto de los movimi....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de la Facultad de Medicina de la Universidad de Hamamatsu.
1. Preparación de Matrices
- Hervir 4-8 matrices de silicona en el microondas o en una placa caliente durante 5 minutos y dejar que se sequen por completo durante 1 hora bajo flujo laminar (lado rayado).
Nota: Los siguientes procedimientos deben realizarse bajo flujo laminar. - Golpe de aire comprimido o utilizar cinta adhesiva transparente para eliminar el polvo de la parte rayada de las matrices. Mantenga el lado rayado limpia para que pueda adherirse f....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Las neuronas del hipocampo disociadas de ratones E15.5 se sembraron y cultivaron durante 24 h en rayas de la etiqueta fluorescente de control de Fc (Figura 3A-C) o FLRT2-Fc (Figura 3D-F) alternando con Fc no marcado control. En ambos casos, las neuronas eran agregados y extendieron sus axones como paquetes. En el mando a rayas Fc / Fc, las neuronas se distribuyeron de manera uniforme en las rayas marcados con fluorescencia y no marcados, y se extendieron.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este protocolo describe un ensayo de banda que utiliza la proteína recombinante y neuronas disociadas del hipocampo de ratones E15.5. Este ensayo permite la observación eficiente de respuestas de repulsión, atractivo, o neutrales de las neuronas a una proteína recombinante de interés colocado en un patrón de rayas. Una ventaja principal de este protocolo es el método simple para la generación de las rayas, en la que la proteína se imprime directamente sobre la superficie de un plato de plástico, en comparación con el mé.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por Grants-in-Aid for Scientific Research de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (23700412, 25122707 y 26670090 a S.Y.).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| tubo de centrífuga de 15 ml | Violamo | 1-3500-01 | |
| 4% Paraformaldehído (PFA) | Nacalai | 01954-85 | |
| Alexa Fluor 488 Anticuerpo IgG antihumano de cabra | Thermo Scientific | A11013 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anticuerpo IgG anti-ratón | Thermo Scientific | A-21203 | Dilución 1/500 |
| Anticuerpo Anti-Tau1 | Dilución de MAB3420 Chemicon | 1/200 | |
| Antidecoloración | Thermo Scientific | P7481 | Se pueden utilizar medios de montaje alternativos |
| Suplemento B27 | Thermo Scientific | 17504-044 | Dilución 1/50 |
| Albúmina sérica bovina | Sigma | 01-2030-2 | |
| Filtro de células 100 mmm | BD Falcon | 352360 | |
| Máquina de centrifugación | Kubota | 2410 | |
| Cubierta de vidrio 18mmx18mm | Matsunami | 18x18 mm Nº 1 | |
| Bolígrafo DAKO | DAKO | S2002 | Se puede utilizar un bolígrafo repelente al agua alternativo |
| Bisturí desechable | Feather | 2975#11 | |
| FBS | Thermo Scientific | 10437-028 | |
| Microscopio fluoreciente | Nikon | E600 | |
| Pinzas Nº 5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050-061 | Dilución 1/100 |
| Jeringa Hamilton | Hamilton | 805N | calibre 22, 50 uL |
| HBSS | Thermo Scientific | 14170-112 | |
| IgG humana, Fc Fragment | Jackson | 009-000-008 | |
| Laminina | Thermo Scientific | 23017-015 | |
| Neurobasal | Thermo Scientific | 21103-049 | |
| Suero de burro normal | Jackson | 017-000-121 | |
| PBS | Nacalai | 14249-24 | |
| Penicilina-estreptomicina | Thermo Scientific | 15070-063 | Dilución 1/100 |
| Plato de cultivo de plástico, 60 mm | |||
| Disponible y adquirible en Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu) | |||
| Microscopio estereoscópico | Olympus | SZ61 | |
| Punta, 1000 uL | Watson | 125-1000S | |
| Cinta adhesiva transparente | Tesa | 57315 | Se puede utilizar cinta adhesiva alternativa |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Azul tripano, 0.4% | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Tripsina/EDTA | Thermo Scientific | 25300-054 | |
| Medio de cultivo | Neurobasal suplementado con B27, GlutaMAX y Penicilina-Estreptomicina. |
Referencias
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Bashaw, G. J., Klein, R. Signaling from axon guidance receptors. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941(2010).
- Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
