Una plataforma microfluídica para el aislamiento de gran procesamiento de celda única y Cultura

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para aislar y cultivar células individuales con una plataforma microfluídica, que utiliza un nuevo concepto de diseño de micropozos para permitir el aislamiento de células individuales de alta eficiencia y el cultivo clonal a largo plazo.

Resumen

Estudiar la heterogeneidad de las células individuales es crucial para muchas cuestiones biológicas, pero es técnicamente difícil. Por lo tanto, existe la necesidad de un método simple, pero de alto rendimiento, para realizar experimentos de cultivo de una sola célula. Aquí, informamos sobre una estrategia basada en chips microfluídicos para el aislamiento de una sola célula de alta eficiencia (~77%) y demostramos su capacidad para realizar análisis de heterogeneidad celular y cultivo de una sola célula a largo plazo (hasta 7 d) mediante ensayos clonogénicos. Estas aplicaciones se demostraron con células madre neurales de ratón KT98 y células cancerosas humanas A549 y MDA-MB-435. La alta eficiencia de aislamiento de una sola célula y la capacidad de cultivo a largo plazo se logran mediante el uso de diferentes tamaños de micropocillos en la parte superior e inferior del canal microfluídico. La matriz de micropocillos pequeña está diseñada para aislar con precisión células individuales, y la matriz de micropocillos grande se utiliza para el cultivo clonal de células individuales en el chip microfluídico. Esta plataforma microfluídica constituye un enfoque atractivo para aplicaciones de cultivo unicelular, debido a su flexibilidad de espacios de cultivo celular ajustables para diferentes estrategias de cultivo, sin disminuir la eficiencia del aislamiento.

Introducción

Actualmente la colocación de las células individuales de forma individual en un espacio de cultivo se logra comúnmente mediante el uso de la dilución limitante o células activadas por fluorescencia (FACS). Para muchos laboratorios, dilución limitante es un método conveniente, ya que sólo requiere una pipeta y del tejido placas de cultivo, que son fácilmente disponibles. En este caso, una suspensión de células se diluye en serie a una densidad celular apropiada, y después se colocó en pocillos de cultivo mediante el uso de una pipeta manual. Estas células individuales compartimentados se utilizan entonces para el análisis de células, tales como la heterogeneidad genét....

Protocolo

Nota: Los diseños photomask para nuestra fabricación de dispositivos de microfluidos se elaboraron mediante el uso de un software de diseño asistido por ordenador (CAD). Los diseños fueron luego utilizados para la fabricación de máscaras de cromo utilizando un servicio comercial. Los dispositivos de PDMS se hicieron usando técnicas de litografía blanda. ¹¹

1. La fabricación de moldes por Maestro Litografía

1. Antes de que el proceso de fotolitografía ^12, utilizar las obleas de silicio de 4 pulgadas como sustrato y deshidratar las obleas en un horno convencional a 120 ° C durante 10 min.
2. Limpiar las ....

Resultados

La plataforma de microfluidos para el aislamiento y cultivo de células individuales comprende un microcanal (200 micras de altura) con dos conjuntos de matrices de micropocillos (Figura 2A). Los dos conjuntos de matrices de micropocillos se denominan como de captura de pocillos (25 m de diámetro y 27 m de profundidad) y la cultura pocillos (285 micras de diámetro y 300 m de profundidad) para el aislamiento de células individuales y la cultura, respectivamente, y cada cap.......

Discusión

Sistemas de dispositivos basados ​​en micropocillos ^6,14 se han utilizado para la manipulación de una sola célula y análisis, como única célula a gran escala atrapando ⁶ y la proliferación de células madre hematopoyéticas única ^15. Aunque el tamaño así, el número y forma se puede ajustar para aplicaciones específicas, la eficacia de aislamiento de una sola célula se ve comprometida siempre cuando se aumenta el tamaño del pozo. ^9,15

Para superar est.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Software AutoCAD	Autodesk AutoCAD	LT 2011	N.º de pieza 057C1-74A111-1001
Oblea de silicio	Corporación Eltech	SPE0039
Horno convencional	YEONG-SHIN empresa	OVP45
Limpiador de plasma	Nordson	AP-300	Sistema de tratamiento de plasma de sobremesa
SU-8 50 fotorresistencia negativa MicroChem		Y131269
SU-8 100 fotorresistencia negativa	MicroChem	Y131273
recubridor	Synrex Co., Ltd.	SC-HMI 2" ~ 6"
Placa calefactora	YOTEC empresa	YS-300S
Alineador Msak	Deya Optronic CO.	A1K-5-MDA
SU-8 desarrollador	Grand Chemical Companies	GP5002-000000-72GC	Acetato de éter de metílico monometílico de propilenglicol
Perfilómetro láser de barrido	KEYENCE	VK-X 100
Triclorosilano	Gelest, Inc	SIT8174.0	Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctilo. Peligroso. Corrosivo para las vías respiratorias, reacciona violentamente con el agua.
Desecador	Bel-Art Products	F42020-0000	Desecador de vacío con ahorro de espacio 190  mm base blanca
Kit de polidimetilsiloxano (PDMS)	Dow corning	Sylgard 184
Harris Punzonadora Uni-Core	Ted Pella Inc.	15072	de 0,75 mm de diámetro interior
	3M Company	Scotch Cinta removible 811
Microscopio estereoscópico	Leica Microsystems	Leica E24
Albúmina sérica bovina (BSA)	Bersing Technology	ALB001.500
DMEM medio basal	Gibco	12800-017
Suero fetal bovino	Thermo Hyclone	SH30071.03HI
Antibióticos	Biowest	L0014-100	Glutamina-Penicilina-Estreptomicina
Mezcla de enzimas recombinantes	Tecnología celular	innovadora AM-105	Accumax
DiIC12(3) Tinte de membrana celular	BD Biosciences	354218	Utilizado como rastreador de células
Bomba de jeringa	Harvard Aparato 703007
Plástico jeringa (1 ml)	BD Biosciences	309659
agujas romas de calibre 23	Ever Sharp Technology, Inc.	Tubo de
	Ever Sharp Technology, Inc.	Diámetro interior de TFT-23T	, 0,51   milímetro; diámetro exterior, 0,82 pulgadas; milímetro

giratorio con cinta removible politetrafluoroetileno (PTFE) TD21