Una plataforma microfluídica para el aislamiento de gran procesamiento de celda única y Cultura

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para aislar y cultivar células individuales con una plataforma microfluídica, que utiliza un nuevo concepto de diseño de micropozos para permitir el aislamiento de células individuales de alta eficiencia y el cultivo clonal a largo plazo.

Abstract

Estudiar la heterogeneidad de las células individuales es crucial para muchas cuestiones biológicas, pero es técnicamente difícil. Por lo tanto, existe la necesidad de un método simple, pero de alto rendimiento, para realizar experimentos de cultivo de una sola célula. Aquí, informamos sobre una estrategia basada en chips microfluídicos para el aislamiento de una sola célula de alta eficiencia (~77%) y demostramos su capacidad para realizar análisis de heterogeneidad celular y cultivo de una sola célula a largo plazo (hasta 7 d) mediante ensayos clonogénicos. Estas aplicaciones se demostraron con células madre neurales de ratón KT98 y células cancerosas humanas A549 y MDA-MB-435. La alta eficiencia de aislamiento de una sola célula y la capacidad de cultivo a largo plazo se logran mediante el uso de diferentes tamaños de micropocillos en la parte superior e inferior del canal microfluídico. La matriz de micropocillos pequeña está diseñada para aislar con precisión células individuales, y la matriz de micropocillos grande se utiliza para el cultivo clonal de células individuales en el chip microfluídico. Esta plataforma microfluídica constituye un enfoque atractivo para aplicaciones de cultivo unicelular, debido a su flexibilidad de espacios de cultivo celular ajustables para diferentes estrategias de cultivo, sin disminuir la eficiencia del aislamiento.

Introduction

Actualmente la colocación de las células individuales de forma individual en un espacio de cultivo se logra comúnmente mediante el uso de la dilución limitante o células activadas por fluorescencia (FACS). Para muchos laboratorios, dilución limitante es un método conveniente, ya que sólo requiere una pipeta y del tejido placas de cultivo, que son fácilmente disponibles. En este caso, una suspensión de células se diluye en serie a una densidad celular apropiada, y después se colocó en pocillos de cultivo mediante el uso de una pipeta manual. Estas células individuales compartimentados se utilizan entonces para el análisis de células, tales como la heterogeneidad genética de detección ¹ y ² Formación de Colonias. Sin embargo, este método es de bajo rendimiento y de trabajo intensivo, sin utilizar un brazo robótico para la asistencia, ya que la naturaleza distribución de Poisson del método de dilución limitante restringe eventos de una sola célula a una probabilidad máxima de 37% ^3. máquinas de FACS con un brazo robótico integrado que pueden superar la limitación de la distribución de Poisson con precisión por placing una sola célula en un pocillo de cultivo a la vez ^4. Sin embargo, el alto esfuerzo de cizalla mecánica (por lo tanto, disminuye la viabilidad celular) ⁵ y la compra de la máquina y los costes operativos han limitado su uso en muchos laboratorios.

Para superar las limitaciones anteriores, los dispositivos a microescala se han desarrollado para altamente eficiente cargar células individuales en micropocillos ^6. Sin embargo, los micropocillos no proporcionan un espacio adecuado para las células cargadas proliferen, debido a la necesidad de hacer que el tamaño de cada pocillo, próxima a la de una sola célula para maximizar la probabilidad de carga de una sola célula. Como se requieren ensayos de cultivo en muchas aplicaciones basadas en células (por ejemplo, ensayo clonogénico ^7), micropocillos de mayor tamaño (90 a 650 micras de diámetro o de longitud lateral) también se han utilizado para permitir cultivos celulares prolongados. Sin embargo, como el método de dilución limitante, también poseen bajas eficiencias individuales de carga de células, que van desde 10 -. 30% ⁸, 9

Anteriormente, hemos desarrollado una plataforma de microfluidos de alto rendimiento para aislar células individuales en micropocillos individuales y demostrar su aplicación en ensayo clonogénico de las células aisladas. ¹⁰ El dispositivo se hizo con poli-dimetilsiloxano (PDMS), y comprende dos conjuntos de matrices de micropocillos con diferentes tamaños de micropocillos, que pueden mejorar en gran medida la eficiencia en la carga de una sola célula en un micropocillo cuyo tamaño es significativamente más grande que la célula. Cabe destacar que este concepto de "doble bien" permite que el tamaño de la zona de cultivo para ajustarse de manera flexible sin afectar a la eficiencia de la captura de una sola célula, por lo que es fácil de ajustar el diseño del dispositivo para adaptarse a diferentes tipos de células y aplicaciones. Este método de alta eficiencia debería ser útil para experimentos de cultivo celular a largo plazo para los estudios de heterogeneidad celular y el establecimiento línea celular monoclonal.

Protocol

Nota: Los diseños photomask para nuestra fabricación de dispositivos de microfluidos se elaboraron mediante el uso de un software de diseño asistido por ordenador (CAD). Los diseños fueron luego utilizados para la fabricación de máscaras de cromo utilizando un servicio comercial. Los dispositivos de PDMS se hicieron usando técnicas de litografía blanda. ¹¹

1. La fabricación de moldes por Maestro Litografía

1. Antes de que el proceso de fotolitografía ^12, utilizar las obleas de silicio de 4 pulgadas como sustrato y deshidratar las obleas en un horno convencional a 120 ° C durante 10 min.
2. Limpiar las obleas de silicio deshidratados mediante el uso de tratamiento con plasma de oxígeno a 100 vatios durante 30 segundos en un limpiador de plasma.
3. Precalentar dos placas de cocción a 65 ° C y 95 ° C, respectivamente, para el siguiente proceso de cocción.
4. Escudo 5 g de resina fotosensible negativo (PR) sobre las obleas de silicio limpiados por una recubridora de rotación; centrifugado a 1200 rpm (SU-8 50) durante 30 segundos para producir la capa de microcanal.
5. Coloque el PRrecubierto de la oblea en una placa caliente precalentado a 65 ° C durante 12 min y la transfiere a otra placa de cocción precalentado a 95 ° C durante 33 min (para 100 micras patrones de espesor) para llevar a cabo un proceso de horneado suave.
6. Después de la cocción, colocar la oblea de silicio recubierto de PR en el titular de un alineador de máscara semiautomático y alinearla a una fotomáscara transparencia 25.400 dpi de resolución.
7. Exponer el revestido PR oblea de silicio a la luz UV (365 nm) a una dosis de 500 mJ / cm ² para crear el patrón de PR en la oblea de silicio.
8. Retire la oblea del alineador y colocarlo sobre una placa caliente para la post-cocción a 95 ° C durante 12 minutos.
9. Remojar las obleas en SU-8 desarrollador de soluciones (acetato de éter monometílico de propilenglicol, PGMEA) para lavar PR no reticulado para 12 min y secar suavemente con gas nitrógeno para exponer las marcas de alineación.
10. Una vez más, la capa 5 g de resina fotosensible negativo en las obleas por una recubridora de rotación; centrifugado a 700 rpm (SU-8 100) durante 30 seg y 1.200 rpm (SU-8 10) durante 30 seg para 300 y# 181; m patrón de espesor y 27 micras de espesor, respectivamente patrón para hacer la capa de microplaca.
11. Colocar la oblea PR recubierta por una placa caliente a 65 ° C durante 4 min y a 95 ° C durante 8 minutos (de 27 micras capa de captura-pozo profundo); y a 65 ° C durante 40 min ya 95 ° C durante 110 minutos (para 300 micras capa de cultivo de pozo profundo).
12. Después de enfriar, colocar la oblea de silicio recubierto de PR en el alineador de máscara equipada con luz UV.
13. Exponer la oblea de silicio recubierto de PR a la luz UV (365 nm) a una dosis de 250 mJ / cm ² (para 27 micras patrón de espesor) y 700 mJ / cm ² (para 300 micras patrón de espesor).
14. Hornear las obleas a 95 ° C durante 5 min (27 m patrón de espesor) y 30 min (300 m patrón de espesor), respectivamente.
15. Lavar el PR no reticulado por el PGMEA durante 6 minutos (27 micras patrón de espesor) y 25 min (300 m patrón de espesor), respectivamente, y luego secarlos con gas nitrógeno.
16. Medir la altura del modelo ofrece enla oblea con un perfilómetro láser de barrido mediante la colocación de la oblea en el xy etapa de un perfilómetro láser de barrido.
    1. Ajustar el plano focal para mostrar claramente el modelo ofrece en la oblea mediante el uso de la "vista de la cámara" modo de observación bajo un lente objetivo de 20X.
    2. Cambiar el modo de observación a partir de "vista de la cámara" a "vista de láser", y establecer las posiciones superior e inferior de las características.
    3. Ajuste el modo de medición, área, calidad, y z-terreno de juego hasta transparente (arriba), 1 línea (1.024 x 1), de alta precisión y 0,5 micras, respectivamente, y luego presione la parte inferior de inicio para comenzar la medición.

2. Preparación de dispositivos PDMS para el aislamiento de células individual

1. Antes de PDMS de colada, se silaniza los moldes maestros con triclorosilano para crear una superficie hidrófoba, que hace que sea más fácil de pelar las réplicas de PDMS de los moldes maestros.
   1. Colocar los moldes maestros y un bote que contiene ponderación200 l de triclorosilano en un desecador, y aplicar vacío (-85 kPa) durante 15 min.
   2. Detener el vacío y luego dejar los moldes maestros en el desecador hasta silaniza los moldes maestros a temperatura ambiente durante al menos 1 hora.
   3. Retirar los moldes maestros del desecador y coloque cada molde maestro en una placa de Petri de 10 cm.
2. Mezcle una cantidad total de 17,6 g de polímero PDMS kit que contiene una base y un agente endurecedor en una proporción de 10: 1, y luego verter el PDMS en el molde maestro en la placa de Petri.
3. Coloque la placa de Petri en un desecador y aplicar vacío (-85 kPa) durante 1 hora para eliminar las burbujas de aire en el PDMS.
4. Retire la placa de Petri del desecador y colocarlo en un horno convencional a 65 ° C por 3 - 6 horas para curar el PDMS.
5. Retire las réplicas de PDMS curado de los moldes maestros y perforar dos agujeros como una entrada y una salida en los dos extremos del microcanal en la matriz PDMS réplica de captura-bien por un golpeador con diámetro interno de 0.75 mm para el canal fluídico (Figura 2A).
6. Use cinta para limpiar la superficie de las réplicas de PDMS y, a continuación, colocar las réplicas de PDMS en un limpiador de plasma para el tratamiento con plasma de oxígeno breve (100 vatios para 14 seg).
7. Retire las réplicas de PDMS de la máquina de plasma de oxígeno.
8. Alinear una parte superior (que contiene los pocillos de captura) y un fondo (PDMS que contienen los pocillos de cultivo) réplica de la mano bajo un microscopio estereoscópico y ponerlos en contacto.
9. Colocar las réplicas de PDMS alineados en un horno a 65 ° C durante 24 horas para conseguir una unión permanente entre las réplicas de PDMS para formar el dispositivo final.
10. Remojar el dispositivo de PDMS en una desionizada (DI) contenedor lleno -agua y colocar el recipiente en un desecador a vacío (-85 kPa) durante 15 minutos para eliminar el aire del microcanal del dispositivo de PDMS.
11. Coloque el dispositivo de PDMS lleno de agua DI en una campana de cultivo de tejidos y el uso de la luz ultravioleta (longitud de onda de la luz: 254 nm) para esterilizar del dispositivo de 30 minorte.
12. Reemplazar el agua DI en el dispositivo de PDMS con una albúmina de suero bovino 5% (BSA) en solución 1x PBS y se incuba a 37 ° C durante 30 min para evitar que las células se adhieran a la superficie de PDMS.
    Nota: El revestimiento BSA es crítica para mejorar la eficacia de la transferencia de células aisladas de captura-bien a la cultura pocillos.
13. Reemplazar la solución de BSA 5% en el dispositivo de PDMS con solución de 1x PBS esterilizado.

3. Preparación de la suspensión de células individual

1. Cultura Neural vástago KT98 celular, y A549 de células de carcinoma humano y MDA-MB-435 que en placa de Petri en una incubadora de cultivo celular convencional (37 ° C, 5% de CO _2, y 95% de humedad) para preparar células para el experimento de células dispositivo PDMS .
2. Retirar y desechar el medio de cultivo gastado (medio basal DMEM suministrado con 10% de suero bovino fetal y 1% de antibióticos) de la placa de cultivo con las células cultivadas a 70 - 80% de confluencia.
3. Lave suavemente las células con PBS tres veces esterilizados.
4. Retirar y desechar el PBS y añadir 2 ml de una mezcla de enzimas proteolíticas, con recombinante, y las actividades de DNasa colagenolıticas (consulte la Lista de materiales para la información detallada).
5. Incubar la placa de cultivo a temperatura ambiente durante 5 minutos, y luego pulse en la placa de cultivo para facilitar el desprendimiento de células.
6. Añadir 4 ml de PBS esterilizada para dispersar las células, y luego transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml.
7. Centrifugar el tubo a 300 xg durante 3 min y separar el sobrenadante.
8. Resuspender el sedimento celular en 1 ml de PBS esterilizados y contar el número de células vivas mediante el método de exclusión con azul de tripano estándar de ^13.
   Nota: Este paso de resuspensión es crítica para la preparación de la suspensión de una sola célula así disociado-para mejorar la eficacia de aislamiento de una sola célula.

4. Aislamiento de celda única y Cultura clonal

1. Carga de 50 l de suspensión de células a una concentración de 2.2 a 2.5 x10 ^{6 células / ml en el microcanal del dispositivo de PDMS a través de orificio de salida del dispositivo con una pipeta de mano.
   Nota: La carga de la pipeta suspensión celular tiene que ser detenido y se mantiene en la primera posición de tope para evitar la introducción de burbujas de aire en el microcanal.}
2. Cargar otros 50 l de suspensión celular a través del orificio de entrada para llenar de manera uniforme por todo el microcanal con las células.
3. Sellar el orificio de salida con un tapón (a, diámetro de la línea de pesca corte nylon 1 mm 3 mm de largo) para evitar el flujo inducido por la presión hidrostática de las gotitas en orificios de entrada y de salida.
   Nota: Los tapones eran UV esterilizado dentro de una campana de cultivo de tejido antes de su uso.
4. Llenar una jeringa estéril de 1 ml con medio de cultivo, expulsar las burbujas de aire, y lo puso en una bomba de jeringa.
5. Conectar la jeringa cargada medio para el orificio de entrada del dispositivo de PDMS a través de un G aguja roma 23 y un tubo de poli-tetrafluoroethene (PTFE).
6. Retire el enchufe del orificio de salida y todosow un intervalo de tiempo de 2 minutos para permitir que las células se asiente sobre la captura de una sola célula de pozos por la fuerza gravitatoria.
7. Lavar las células no capturadas con 300 l de medio de cultivo a una velocidad de flujo de 600 l / min impulsado por la bomba de jeringa.
8. Espere 2 min para estabilizar el dispositivo, y sellar los orificios de entrada y de salida con tapones para formar un sistema de cultivo cerrado.
9. Da la vuelta al dispositivo de mano para transferir las células únicas capturadas a los pocillos de cultivo.
10. Coloque el dispositivo de PDMS en una placa de cultivo tisular de 100 mm, y añadir 10 ml de PBS esterilizado alrededor del dispositivo para evitar la evaporación cultura medio del microcanal.
11. Mover la placa de cultivo a una incubadora convencional de cultivo de células (37 ° C, 5% de CO _2, y 95% de humedad) para el cultivo clonal de las células individuales.

5. Medio de cultivo Reposición

1. Después de 1 d de la cultura, sustituir el medio de cultivo en el dispositivo de PDMS con un nuevo medio para mejorar la pr celularoliferation.
2. Colocar dos gotas de medio de cultivo en la parte superior del dispositivo de PDMS cerca de las zonas orificios de entrada y de salida para evitar la introducción de burbujas de aire en el microcanal en el desempeño de la siguiente etapa.
3. Haga dos agujeros de la parte superior del dispositivo de PDMS cerca de los dos extremos de la microcanal como una entrada y una salida para el microcanal.
   Nota: No perforar a través enteras las dos capas del dispositivo de PDMS; En su lugar, simplemente perforar a través de la capa superior del PDMS.
4. Conectar una jeringa de plástico que contenía 1 ml de medio fresco a la entrada a través de una aguja de punta roma G 23 y el tubo de PTFE.
5. El flujo medio de 120 l fresco en el dispositivo durante 5 minutos para reemplazar el medio de edad.
6. Inserte dos tapones para sellar la entrada y salida agujeros, y devolver el dispositivo a la incubadora de cultivo celular.
7. Refrescar el medio de cultivo cada 2 d durante el período de la cultura mediante la eliminación de los tapones de sellado, seguido de la repetición de los apartados 5.4 a 5,5.

Results

La plataforma de microfluidos para el aislamiento y cultivo de células individuales comprende un microcanal (200 micras de altura) con dos conjuntos de matrices de micropocillos (Figura 2A). Los dos conjuntos de matrices de micropocillos se denominan como de captura de pocillos (25 m de diámetro y 27 m de profundidad) y la cultura pocillos (285 micras de diámetro y 300 m de profundidad) para el aislamiento de células individuales y la cultura, respectivamente, y cada cap...

Discussion

Sistemas de dispositivos basados ​​en micropocillos ^6,14 se han utilizado para la manipulación de una sola célula y análisis, como única célula a gran escala atrapando ⁶ y la proliferación de células madre hematopoyéticas única ^15. Aunque el tamaño así, el número y forma se puede ajustar para aplicaciones específicas, la eficacia de aislamiento de una sola célula se ve comprometida siempre cuando se aumenta el tamaño del pozo. ^9,15

Para superar est...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software AutoCAD	Autodesk AutoCAD	LT 2011	N.º de pieza 057C1-74A111-1001
Oblea de silicio	Corporación Eltech	SPE0039
Horno convencional	YEONG-SHIN empresa	OVP45
Limpiador de plasma	Nordson	AP-300	Sistema de tratamiento de plasma de sobremesa
SU-8 50 fotorresistencia negativa MicroChem		Y131269
SU-8 100 fotorresistencia negativa	MicroChem	Y131273
recubridor	Synrex Co., Ltd.	SC-HMI 2" ~ 6"
Placa calefactora	YOTEC empresa	YS-300S
Alineador Msak	Deya Optronic CO.	A1K-5-MDA
SU-8 desarrollador	Grand Chemical Companies	GP5002-000000-72GC	Acetato de éter de metílico monometílico de propilenglicol
Perfilómetro láser de barrido	KEYENCE	VK-X 100
Triclorosilano	Gelest, Inc	SIT8174.0	Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctilo. Peligroso. Corrosivo para las vías respiratorias, reacciona violentamente con el agua.
Desecador	Bel-Art Products	F42020-0000	Desecador de vacío con ahorro de espacio 190  mm base blanca
Kit de polidimetilsiloxano (PDMS)	Dow corning	Sylgard 184
Harris Punzonadora Uni-Core	Ted Pella Inc.	15072	de 0,75 mm de diámetro interior
	3M Company	Scotch Cinta removible 811
Microscopio estereoscópico	Leica Microsystems	Leica E24
Albúmina sérica bovina (BSA)	Bersing Technology	ALB001.500
DMEM medio basal	Gibco	12800-017
Suero fetal bovino	Thermo Hyclone	SH30071.03HI
Antibióticos	Biowest	L0014-100	Glutamina-Penicilina-Estreptomicina
Mezcla de enzimas recombinantes	Tecnología celular	innovadora AM-105	Accumax
DiIC12(3) Tinte de membrana celular	BD Biosciences	354218	Utilizado como rastreador de células
Bomba de jeringa	Harvard Aparato 703007
Plástico jeringa (1 ml)	BD Biosciences	309659
agujas romas de calibre 23	Ever Sharp Technology, Inc.	Tubo de
	Ever Sharp Technology, Inc.	Diámetro interior de TFT-23T	, 0,51   milímetro; diámetro exterior, 0,82 pulgadas; milímetro