El aislamiento y la citometría de flujo Caracterización de murino Small intestinal linfocitos

Resumen

Existe un creciente interés en la caracterización cuantitativa de los linfocitos intestinales debido al creciente reconocimiento de que estas células desempeñan un papel crítico en una variedad de enfermedades intestinales y sistémicas. En este protocolo, describimos cómo aislar poblaciones de células individuales de diferentes compartimentos del intestino delgado para su posterior caracterización por citometría de flujo.

Resumen

Los intestinos - que contienen el mayor número de células inmunes de cualquier órgano en el cuerpo - están constantemente expuestos a antígenos extraños, tanto microbiana y la dieta. Dada la comprensión creciente de que estos antígenos luminales ayudan a dar forma a la respuesta inmune y que la educación de las células inmunes en el intestino es crítica para un número de enfermedades sistémicas, se ha aumentado el interés en la caracterización del sistema inmunitario intestinal. Sin embargo, muchos protocolos publicados son arduo y que consume tiempo. Presentamos aquí un protocolo simplificado para el aislamiento de linfocitos de la propria del intestino delgado lámina, capa intraepitelial, y las placas de Peyer que es rápido, reproducible, y no requiere gradientes de Percoll laboriosas. Aunque el protocolo se centra en el intestino delgado, también es adecuado para el análisis de los dos puntos. Por otra parte, se destacan algunos aspectos que pueden necesitar una optimización adicional en función del ques científica específicación. Este enfoque da como resultado el aislamiento de un gran número de linfocitos viables que posteriormente se pueden utilizar para el análisis de citometría de flujo o medios alternativos de caracterización.

Introducción

La tarea principal del intestino delgado es a menudo considerada como la digestión y absorción de nutrientes ^1. Si bien esta función metabólica es claramente esencial, el intestino delgado tiene un papel igualmente importante en la protección del huésped de la descarga continua de antígenos ambientales que se encuentran dentro de la luz ^2. El tracto intestinal separa el mundo exterior (por ejemplo., Antígenos luminales) de el ambiente interno del huésped con una capa epitelial que es sólo una única capa de células de espesor. Como tal, el sistema inmunitario del intestino delgado tiene el formidable tarea de equilibrar su umbral para la reactividad, lo que permite antígenos extraños de la dieta y comensales microbios para entrar en la mucosa con un mínimo, en su caso, la respuesta inmune mientras que el montaje de una respuesta sólida contra la invasión de patógenos y otros antígenos "perjudiciales". Las respuestas inmunitarias excesivas o inapropiadas a estos antígenos pueden conducir a la enfermedad patológica (por ejemplo., Inflammaenfermedad toria del intestino, diabetes tipo I, esclerosis múltiple) y debe evitarse ^3-6.

En general, se considera que el tracto gastrointestinal para representar el órgano más grande inmune en el cuerpo, que contiene más de 70% de todas las células ⁷ que secretan anticuerpo. El sistema inmunitario del intestino delgado se compone de 3 compartimentos principales - la lámina propia (LP), la capa intraepitelial, y parches de Peyer (PP) - que cada uno contiene un grupo distintivo de linfocitos ^2. Los linfocitos LP (LPLS) son principalmente ^las células T TCRαβ con células ~ 20% de B; linfocitos intraepiteliales (IEL) contienen muy pocas células B con más ^células T que TCRγδ ⁺ células T TCRαβ; y PP, que son los órganos linfoides secundarios incrustados en la pared del intestino delgado, contienen células B ~ 80%. Aunque cada una de estas regiones anatómicas tiene funciones ligeramente distintas y bases ontológicas, que funcionará de ahmoda armonized para proteger al huésped de insultos patógenos.

Por otra parte, existe un creciente reconocimiento de que la microbiota es un determinante crítico para el desarrollo del sistema inmune intestinal, con un creciente reconocimiento de la relación entre los microbios específicos afines y la ontogenia de determinados linajes celulares ^8,9. Además, dado que la educación del sistema inmunitario intestinal afecta a las respuestas inmunes en sitios anatómicamente distantes (por ejemplo., La artritis, la esclerosis múltiple, neumonía), se ha hecho evidente que el desarrollo del sistema inmunitario intestinal es relevante para más procesos de la enfermedad de reconocido previamente ^{10 -12.} Como tal, el interés en evaluar cuantitativamente el sistema inmune intestinal ha extendido más allá de las interacciones huésped-patógeno para incluir ahora la interacción huésped-comensal y la patogénesis de muchas enfermedades sistémicas así.

Dada la variabilidad de los métodos actuales de laaislamiento de los linfocitos intestinales, un método que se ha optimizado para el rendimiento, la viabilidad, y la consistencia y equilibrar el tiempo requerido es cada vez más crítica. Protocolos que involucran gradientes de Percoll son el tiempo y mano de obra intensiva y potencialmente más propenso a un error humano, dando lugar a un rendimiento variable de ¹³ y viabilidad. En este documento, se proporciona un protocolo optimizado para el aislamiento y caracterización de linfocitos de los 3 compartimentos inmunes del intestino delgado. Además, dado el aumento de interés en alteraciones de microbios inducida en el sistema inmune de la mucosa, que incluye pasos que se pueden utilizar para permitir la transmisión horizontal de microorganismos entre los ratones para evaluar cómo estos cambios afectan cuantitativamente el sistema inmunitario intestinal.

Protocolo

Se llevaron a cabo todos los estudios que se examina y las directrices estrictas de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Facultad de Medicina de Harvard, que cumple con los estándares veterinarios establecidos por la American Association for Laboratory Animal Science (AALAS).

1. Horizontal transmisión de bacterias a través de co-vivienda (Opcional)

1. Para minimizar la contaminación exógena (sobre todo si el uso de ratones gnotobióticos), practicar una técnica aséptica durante el montaje de las jaulas estériles desechables, el uso de alimentos y agua que ambos se han tratado en autoclave.
2. Use punzones para los oídos o etiquetas para marcar de forma individual 6 semanas de edad C57BL / 6 ratones que albergan diferentes microbiotas y alojarlos en la misma jaula. Dado que los ratones son coprofagia y comen bolitas fecales desde el suelo de la jaula, microbios, naturalmente, serán transmitidos horizontalmente entre los ratones.
3. los ratones co-Casa en ≥1 semana para dar tiempo a que la transferencia microbiana y el cambio inmunológica antes del análisis.

2. Preparación de una suspensión de células individuales de la capa intraepitelial Small-intestinal y la lámina propia

1. Preparación de las soluciones
   1. Preparar los medios de extracción (por intestino delgado): 30 ml de RPMI + 93 l 5% ditiotreitol (DTT) (v / w) + 60 l de EDTA 0,5 M + 500 l de suero bovino fetal (FBS). Añadir la TDT inmediatamente antes de su uso.
   2. Preparar los medios de digestión (por el intestino delgado): 25 ml de RPMI + 12,5 mg dispasa + 37,5 mg colagenasa II + 300 l de FBS. Añadir la colagenasa y dispasa inmediatamente antes de su uso.
   3. Para todas las incubaciones se realizan a 37 ° C, soluciones Precaliente a 37 ° C.
2. La eutanasia a los ratones por asfixia de CO ₂ seguido por dislocación cervical.
3. Coloque el lado dorsal del ratón y rociar el abdomen con un 70% de etanol. Use las tijeras para realizar una laparotomía cortando secuencialmente la piel y la fascia peritoneal a continuación a lo largo de la línea media ventral lado a otrom la sínfisis púbica a la apófisis xifoides, exponiendo así a la cavidad peritoneal.
4. Con unas tijeras para separar el intestino delgado desde el estómago por transección del esfínter pilórico. Retire con cuidado el intestino delgado del peritoneo, las burlas lejos la grasa mesentérica.
   1. Para eliminar completamente el intestino delgado, hacer un segundo corte en la unión íleo-cecal. Coloque el intestino delgado aislado en frío (es decir., 4 ° C) RPMI que contiene 10% de FBS para maximizar la viabilidad celular.
5. Retire con cuidado las grandes trozos de grasa utilizando pinzas curvas. Tenga cuidado para evitar que se rompa el propio tejido intestinal al intentar quitar la grasa.
6. Para eliminar el contenido intestinal, los intestinos suavemente a ras con 15 - 20 ml de PBS frío usando una aguja de alimentación 18 G colocada en una jeringa.
7. Use las tijeras para extirpar PP, y colocarlos en RPMI frío que contenía FBS al 5%. EPA se encuentra en el lado antimesentérico del intestino delgado y aparecen como un blanco multi-lobuladamasa. Dependiendo de la cepa específica, un ratón normalmente tiene 8 - 12 PP.
8. Cortar el intestino delgado hasta 3 - 4 pulgadas segmentos.
9. Eliminar la grasa residual enrollando cada segmento del intestino delgado en una toalla de papel humedecida con RPMI, utilizando un bisturí aburrida para provocar la grasa lejos del tejido.
10. Girar el tejido dentro por canulación de los segmentos intestinales con pinzas curvas y agarrar el extremo distal del tejido. A continuación, utilice un par de pinzas rectas para eliminar suavemente el segmento de tejido de las pinzas curvas (comenzando en el extremo proximal), lo que resulta en el tejido que se está invertida.
11. Coloque los segmentos de tejido en un vaso que contiene 30 ml de medio de extracción y una barra de agitación. Asegure la tapa en el recipiente, y se agita a 500 rpm durante 15 minutos a 37 ° C; agitación debe ser vigorosa pero no turbulento.
12. Después de la incubación, utilizar un filtro de acero para separar piezas de tejido a partir del sobrenadante que contiene epitelio, que debe aparecer turbia. Este sobrenadante contiene ilinfocitos ntraepithelial que se pueden analizar aún más, si se desea, proceder a la filtración de la muestra en los pasos 2.18 - 2.23.
13. agitar manualmente las piezas de tejido en RPMI para lavar medios de extracción residuales.
14. Coloque el tejido en una toalla de papel seca y se tapa de punta a punta varias veces para facilitar la eliminación de moco residuales que no fue liberado por el medio de extracción.
15. Coloque los fragmentos de tejido en un tubo de 1,5 ml con 600 l de medio de digestión.
16. Use las tijeras para picar el tejido hasta que las piezas ya no se adhieren a las tijeras y la solución parece homogénea. Este paso es crítico para asegurar la digestión enzimática completa del tejido.
17. Añadir el intestino delgado picada a una taza que contiene 25 ml de medio de digestión. Se agita a 500 rpm durante 30 min a 37 ° C. A mitad de camino a través de la digestión (es decir., A los 15 min), pipetear arriba y abajo con una pipeta serológica para ayudar a romper cualquier grandes trozos de tejido.
18. tejido digerido Filter (o epithELIAL capa de la etapa 2.12 si va a componer de procesamiento) a través de un filtro de células de 100 micras en un tubo de 50 ml. Enjuague el filtro con 20 ml de RPMI que contenía 10% de FBS.
19. Centrifugar la solución filtrada a 500 xg durante 10 min a 4 ° C.
20. decantar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml de RPMI que contenía 10% de FBS.
21. Filtro de células se resuspendió a través de un filtro de 40 micras de células en un tubo de 50 ml. Enjuague filtro con 20 ml de RPMI que contenía 10% de FBS.
22. Centrifugar la solución se filtró a 500 xg durante 10 min a 4 ° C.
23. decantar cuidadosamente el sobrenadante y pellet se resuspende en 1 ml de RPMI que contenía 2% de FBS.

3. Preparación de una suspensión de células individuales de las placas de Peyer

1. Transferencia extirpó PP a una taza con 25 ml de medio de fermentación y una barra de agitación. Asegure la tapa y centrifugado a 500 rpm durante 10 minutos a 37 ° C.
2. Filtrar digerido PP a través de un filtro de 40 micras de células en un tubo de 50 ml. Si cualquier grupo remaen, ellos presione a través del filtro usando el extremo plano del émbolo de una jeringa de 1 ml.
3. Enjuague filtro con 10 ml de RPMI que contenía 10% de FBS.
4. Centrifugar la solución se filtró a 500 xg durante 10 min a 4 ° C.
5. decantar cuidadosamente el sobrenadante y pellet se resuspende en 1 ml de RPMI que contenía 2% de FBS.

4. La tinción de pavimentación de Citometría de Flujo

1. Alícuota volumen apropiado de células (por ejemplo., 200 l de LPL) en una placa de fondo redondo de 96 pocillos.
2. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante por inversión de la placa.
3. Resuspender las células en 90 l de RPMI que contiene FBS al 2% y una dilución 1: 100 de anti-CD16 / 32 (bloque Fc). Incubar durante 10 minutos a 4 ° C.
4. Añadir 10 l de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante por inversión de la placa.
5. Resuspender las células en 250 l de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante porinvirtiendo la placa.
6. (Opcional) las células se tiñen con tinte de viabilidad, si se desea, siguiendo el protocolo del fabricante.
7. Resuspender las células en 100 l 1% de formalina para fijar las células. Incubar durante 1 hora en la oscuridad a 4 ° C.
8. Añadir 200 l de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante por inversión de la placa.
9. Resuspender las células en 250 l de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante por inversión de la placa.
10. Resuspender las células en 200 l de PBS. Analizar las células utilizando un citómetro de flujo.

Resultados

Análisis citométrico de flujo suspensiones de células individuales de linfocitos pequeños intestinal debe producir una discreta población de células que tienen similares dispersión frontal y lateral características como esplenocitos (Figuras 1A y 1B). Los linfocitos pueden comenzar a morir si el tejido no se mantiene a 4 ° C durante las etapas iniciales del aislamiento, lo que resulta en la población de linfocitos que tiene una dispersión frontal inferior y ser más difíc...

Discusión

Se presenta un protocolo para el aislamiento y caracterización de citometría de los linfocitos del intestino delgado, incluyendo la LPL va a componer, y linfocitos en el PP de flujo. Para los interesados ​​en la evaluación de cómo los cambios en la microbiota afectan el sistema inmunológico del intestino delgado, se detallan los pasos sencillos que intervienen en la transmisión horizontal de organismos entre los ratones que albergan diferentes microorganismos involucrados. Aunque este protocolo se centra en el intestino...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Guantes estériles	Kimberly-Clark	555092
jaula estéril para ratones	Innovive	MS2-AD	contiene tapa, fondo de jaula y ropa de cama alpha-dri
Alimentador metálico	Innovive	M-FEED
Botella de agua	Innovive	M-WB-300
Tarjetero	Innovive	CRD-HLD-H
Roedor esterilizable en autoclave chow (NIH-31M)	Zeigler	4131207530
RPMI medio 1640	Gibco	11875-119
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D5545-5G
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Ambion	AM9262
Suero fetal bovino (FBS)	GemBio	100-510
Dispasa II	Invitrogen	17105-041	la concentración en el protocolo se basa en un nivel de actividad de 1,878 U/mg
de colagenasa, tipo II	Invitrogen	17101-015	la concentración en el protocolo se basa en un nivel de actividad de 245 U/mg
Tijeras de disección	Roboz	RS-5882
Aguja de alimentación (18 G, 2" de longitud)	Roboz	FN-7905
Jeringa de 10 ml	BD	305482
PBS	Gibco	14190-250
Bisturí Desechable (15 hojas)	Miltex	4-415
Pinza curva	Roboz	RS-5211
Pinza recta	Roboz	RS-5132
Vasos multiusos, 120 ml	VWR	89009-662
Barra agitadora	VWR	58949-062
Plato agitador multiposición, 9 posiciones	VWR	12621-048
Cónico de acero inoxidable colador, 3 pulgadas	RSVP
1.5 ml Tubo	Eppendorf	0030 125.150
100 μ m Filtro de celdas	Falcon	08-771-19
40 μ m Filtro de células	Falcon	08-771-1
50 ml Tubo cónico	Falcon	352098
1 ml Jeringa	BD	309659
96 pocillos, fondo redondo	Corning	3799
Anti-ratón CD16/32 (bloque Fc)	Biolegend	101320
(Opcional) Colorante de viabilidad fijable eFluor 780	eBiosciences	65-0865-18
10% de formalina, tamponado neutro	Thermo Scientific	5725