El aislamiento y la citometría de flujo Caracterización de murino Small intestinal linfocitos

Summary

Existe un creciente interés en la caracterización cuantitativa de los linfocitos intestinales debido al creciente reconocimiento de que estas células desempeñan un papel crítico en una variedad de enfermedades intestinales y sistémicas. En este protocolo, describimos cómo aislar poblaciones de células individuales de diferentes compartimentos del intestino delgado para su posterior caracterización por citometría de flujo.

Abstract

Los intestinos - que contienen el mayor número de células inmunes de cualquier órgano en el cuerpo - están constantemente expuestos a antígenos extraños, tanto microbiana y la dieta. Dada la comprensión creciente de que estos antígenos luminales ayudan a dar forma a la respuesta inmune y que la educación de las células inmunes en el intestino es crítica para un número de enfermedades sistémicas, se ha aumentado el interés en la caracterización del sistema inmunitario intestinal. Sin embargo, muchos protocolos publicados son arduo y que consume tiempo. Presentamos aquí un protocolo simplificado para el aislamiento de linfocitos de la propria del intestino delgado lámina, capa intraepitelial, y las placas de Peyer que es rápido, reproducible, y no requiere gradientes de Percoll laboriosas. Aunque el protocolo se centra en el intestino delgado, también es adecuado para el análisis de los dos puntos. Por otra parte, se destacan algunos aspectos que pueden necesitar una optimización adicional en función del ques científica específicación. Este enfoque da como resultado el aislamiento de un gran número de linfocitos viables que posteriormente se pueden utilizar para el análisis de citometría de flujo o medios alternativos de caracterización.

Introduction

La tarea principal del intestino delgado es a menudo considerada como la digestión y absorción de nutrientes ^1. Si bien esta función metabólica es claramente esencial, el intestino delgado tiene un papel igualmente importante en la protección del huésped de la descarga continua de antígenos ambientales que se encuentran dentro de la luz ^2. El tracto intestinal separa el mundo exterior (por ejemplo., Antígenos luminales) de el ambiente interno del huésped con una capa epitelial que es sólo una única capa de células de espesor. Como tal, el sistema inmunitario del intestino delgado tiene el formidable tarea de equilibrar su umbral para la....

Protocol

Se llevaron a cabo todos los estudios que se examina y las directrices estrictas de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Facultad de Medicina de Harvard, que cumple con los estándares veterinarios establecidos por la American Association for Laboratory Animal Science (AALAS).

1. Horizontal transmisión de bacterias a través de co-vivienda (Opcional)

1. Para minimizar la contaminación exógena (sobre todo si el uso de ratones gnotobióticos), practicar una técnica aséptica durante el montaje de las jaulas estériles desechables, el uso de alimentos y agua que ambos se han tratado en autoclave.
2. Use p....

Results

Análisis citométrico de flujo suspensiones de células individuales de linfocitos pequeños intestinal debe producir una discreta población de células que tienen similares dispersión frontal y lateral características como esplenocitos (Figuras 1A y 1B). Los linfocitos pueden comenzar a morir si el tejido no se mantiene a 4 ° C durante las etapas iniciales del aislamiento, lo que resulta en la población de linfocitos que tiene una dispersión frontal inferior y ser más difíc.......

Discussion

Se presenta un protocolo para el aislamiento y caracterización de citometría de los linfocitos del intestino delgado, incluyendo la LPL va a componer, y linfocitos en el PP de flujo. Para los interesados ​​en la evaluación de cómo los cambios en la microbiota afectan el sistema inmunológico del intestino delgado, se detallan los pasos sencillos que intervienen en la transmisión horizontal de organismos entre los ratones que albergan diferentes microorganismos involucrados. Aunque este protocolo se centra en el intestino.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Guantes estériles	Kimberly-Clark	555092
jaula estéril para ratones	Innovive	MS2-AD	contiene tapa, fondo de jaula y ropa de cama alpha-dri
Alimentador metálico	Innovive	M-FEED
Botella de agua	Innovive	M-WB-300
Tarjetero	Innovive	CRD-HLD-H
Roedor esterilizable en autoclave chow (NIH-31M)	Zeigler	4131207530
RPMI medio 1640	Gibco	11875-119
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D5545-5G
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Ambion	AM9262
Suero fetal bovino (FBS)	GemBio	100-510
Dispasa II	Invitrogen	17105-041	la concentración en el protocolo se basa en un nivel de actividad de 1,878 U/mg
de colagenasa, tipo II	Invitrogen	17101-015	la concentración en el protocolo se basa en un nivel de actividad de 245 U/mg
Tijeras de disección	Roboz	RS-5882
Aguja de alimentación (18 G, 2" de longitud)	Roboz	FN-7905
Jeringa de 10 ml	BD	305482
PBS	Gibco	14190-250
Bisturí Desechable (15 hojas)	Miltex	4-415
Pinza curva	Roboz	RS-5211
Pinza recta	Roboz	RS-5132
Vasos multiusos, 120 ml	VWR	89009-662
Barra agitadora	VWR	58949-062
Plato agitador multiposición, 9 posiciones	VWR	12621-048
Cónico de acero inoxidable colador, 3 pulgadas	RSVP
1.5 ml Tubo	Eppendorf	0030 125.150
100 μ m Filtro de celdas	Falcon	08-771-19
40 μ m Filtro de células	Falcon	08-771-1
50 ml Tubo cónico	Falcon	352098
1 ml Jeringa	BD	309659
96 pocillos, fondo redondo	Corning	3799
Anti-ratón CD16/32 (bloque Fc)	Biolegend	101320
(Opcional) Colorante de viabilidad fijable eFluor 780	eBiosciences	65-0865-18
10% de formalina, tamponado neutro	Thermo Scientific	5725