Un protocolo para la evaluación funcional de la Proteína Total-mutagénesis de saturación Bibliotecas La utilización de secuenciación de alto rendimiento

Michael Allen Stiffler; Subu K Subramanian; Victor H Salinas; Rama Ranganathan

doi:10.3791/54119

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Artículo de método

Un protocolo para la evaluación funcional de la Proteína Total-mutagénesis de saturación Bibliotecas La utilización de secuenciación de alto rendimiento

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DOI:

10.3791/54119

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3 de julio de 2016

Michael Allen Stiffler¹ , Subu K Subramanian¹ , Victor H Salinas¹ , Rama Ranganathan¹

¹Green Center for Systems Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

En este artículo

Resumen

Se presenta un protocolo para la evaluación funcional de amplias bibliotecas de saturación de un solo sitio de mutagénesis de proteínas utilizando secuenciación de alto rendimiento. Es importante destacar que este enfoque utiliza pares de cebadores para multiplexar ortogonales construcción de la biblioteca y secuenciación. Se proporcionan resultados representativos utilizando TEM-1 β-lactamasa seleccionado en una dosis clínicamente relevante de ampicilina.

Resumen

La mutagénesis dirigida al sitio se ha utilizado durante mucho tiempo como método para interrogar la estructura, función y evolución de las proteínas. Los avances recientes en la tecnología de secuenciación masiva paralela han abierto la posibilidad de evaluar los efectos funcionales o de aptitud de un gran número de mutaciones simultáneamente. Aquí, presentamos un protocolo para determinar experimentalmente los efectos de todas las posibles mutaciones de un solo aminoácido en una proteína de interés utilizando tecnología de secuenciación de alto rendimiento, utilizando como ejemplo la enzima de resistencia a antibióticos TEM-1 de 263 aminoácidos TEM-1 β-lactamasa. En este enfoque, se construye una biblioteca de mutagénesis de saturación de proteínas completas mediante PCR mutagénica dirigida al sitio, aleatorizando cada posición individualmente a todos los aminoácidos posibles. A continuación, la biblioteca se transforma en bacterias y se selecciona por su capacidad de conferir resistencia a los antibióticos β-lactámicos. El efecto de la aptitud de cada mutación se determina mediante una secuenciación profunda de la biblioteca antes y después de la selección. Es importante destacar que este protocolo introduce métodos que maximizan la profundidad de lectura de la secuenciación y permiten la selección simultánea de toda la biblioteca de mutaciones, mezclando posiciones adyacentes en grupos de longitud acomodados por la longitud de lectura de secuenciación de alto rendimiento y utilizando cebadores ortogonales para codificar cada grupo. Los resultados representativos utilizando este protocolo se proporcionan mediante la evaluación de los efectos de aptitud de todas las mutaciones de aminoácidos individuales en TEM-1 a una dosis clínicamente relevante de ampicilina. El método debe ser fácilmente extensible a otras proteínas para las que se haya realizado un ensayo de selección de alto rendimiento.

Introducción

Mutagénesis mucho tiempo se ha empleado en el laboratorio para estudiar las propiedades de los sistemas biológicos y su evolución, y para producir proteínas o organismos mutantes con funciones mejoradas o novedosas. Mientras que los primeros enfoques se basaban en métodos que producen mutaciones aleatorias en los organismos, el advenimiento de la tecnología del ADN recombinante permitió a los investigadores para introducir cambios en el ADN de selección de una manera específica de sitio, es decir., Mutagénesis dirigida ^1,2. Con las técnicas actuales, típicamente usando oligonucleótidos mutagénicos en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ....