Describimos un protocolo para la prevención de los efectos del estrés térmico en ratas mediante un pretratamiento oral con bacterias beneficiosas. Este protocolo puede ser modificado y utilizado para diversas vías de administración y para el análisis de diferentes compuestos.
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Artículo de método
Prevención de Estrés Térmico efectos adversos en ratas
En este artículo
Resumen
Resumen
Este estudio fue diseñado para evaluar el efecto protector de la cepa de Bacillus subtilis contra las complicaciones relacionadas con el estrés por calor. Treinta y dos ratas Sprague-Dawley se utilizaron en este estudio. Los animales se trataron por vía oral dos veces al día durante dos días con B. subtilis cepa BSB3 o PBS. El día siguiente después del último tratamiento, cada grupo se dividió y se colocaron dos grupos experimentales (uno tratado con PBS y uno tratado con B. subtilis) a 45 ° C durante 25 min. Dos grupos de control permanecieron durante 25 min a temperatura ambiente. Todas las ratas se sacrificaron y los diferentes parámetros se analizaron en todos los grupos. Los efectos adversos del estrés por calor son registrados por la disminución de la altura de las vellosidades y el grosor total de la mucosa en el epitelio intestinal; translocación de bacterias desde el lumen; aumento de la vesiculación de los eritrocitos y la elevación de los lipopolisacáridos (LPS) el nivel en la sangre. La eficacia protectora de tratamiento se evaluó por prevención de estos efectos secundarios. El protocolo se creó para el tratamiento oral de ratas con bacterias para la prevención de complicaciones de estrés térmico, pero este protocolo puede ser modificado y utilizado para otras vías de administración y para el análisis de diferentes compuestos.
Introducción
Diferentes factores estresantes afectan la salud humana y animal. La temperatura es uno de los factores más estresantes, causante de enfermedades crónicas, agudas e incluso letales1. En muchos casos se documentaron cambios en la morfología intestinal y una pérdida de la integridad de la barrera intestinal después del estrés térmico2,3. Esta barrera protectora es responsable de la defensa contra la translocación de las bacterias intestinales y sus toxinas, en particular los lipopolisacáridos (LPS), desde el lumen hasta la circulación interna4,5. La estabilidad de la microbiota intestinal influye significativamente en la función de la barrera intestinal, la respuesta inmunitaria del huésped y la tolerancia a las condiciones de estrés6. Por lo tanto, la modulación de la microbiota intestinal puede proporcionar un enfoque novedoso para la prevención de los efectos adversos relacionados con el estrés.
Las bacterias beneficiosas se han utilizado como una estrategia prometedora para modificar la microbiota intestinal para el manejo exitoso de diversas afecciones clínicas, como diarrea, enfermedad inflamatoria intestinal, dermatitis atópica, trastornos metabólicos7-10. Los efectos probióticos de las bacterias beneficiosas incluyen la producción de metabolitos esenciales para apoyar la salud intestinal, la estimulación del sistema inmunológico, la promoción de la tolerancia a la lactosa y la restauración de la disfunción epitelial. Los probióticos fueron efectivos en la prevención de las complicaciones relacionadas con el estrés in vitro y en modelos animales11,12.
Los investigadores han prestado más atención a las bacterias Bacillus como probióticos porque estas bacterias apoyan la homeostasis intestinal13 y tienen efectos beneficiosos sobre el huésped14. Nuestros datos previos demostraron una alta eficacia de los probióticos Bacillus frente a patógenos in vitro15,16 y en ensayos clínicos17,18. En este trabajo, nuestro objetivo es evaluar el efecto preventivo de la cepa BSB3 de B. subtilis frente a las complicaciones posteriores al estrés térmico.
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Protocolo
Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el IACUC de la Universidad de Auburn, Auburn, Alabama.
1. Preparación de medios de cultivo, platos y Cultura bacteriana
- Inocular 10 ml de caldo nutritivo en un matraz con una sola colonia de la cultura BSB3 Bacillus subtilis, que se cultiva durante la noche en una placa de agar nutriente.
- Hacer 500 ml de medio de esporulación 19 (por litro: Bacto Nutrient Broth, 8 g; 10% (w / v) de KCl, 10 ml; 1,2% (w / v) MgSO4 x 7H 2 O, 10 ml; agar, 15 g) y autoclave a 121 ° C durante 20 min. Dejar enfriar a 50 ° C y añadir las siguientes soluciones estériles: 1 M de Ca (NO3) 2, 1 ml; 0,01 M MnCl 2, 1 ml; 1 mM de FeSO 4, 1 ml.
- Medio preparado Enfriar a 40 ° C durante 20 min a temperatura ambiente y verter 25 ml en cada una de 20 placas de Petri estériles en el gabinete estéril. Deje que el medio solidifique durante la noche.
- Difundir 0,5 ml de cultivo de una noche de Bacillus subtilis BSB3 sobre la superficie del medio en las placas de Petri. Incubar cultivo a 37 ° C durante 5 días hasta el 90% de esporulación. Revelar esporas de fase brillante de alta resolución de la microscopía.
- bacterias de la cosecha mediante la adición de 1 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) a la placa y el raspado bacterias de una superficie usando un esparcidor de células estériles. Guarde la suspensión en el refrigerador hasta que sea necesario.
- Confirmar viabilidad de las bacterias en placas 0,1 ml de la dilución apropiada (10 -5-10 -6) de una suspensión bacteriana en placas de medio de esporulación seguido de incubación durante 18-24 horas a 37 ° C
- Recuento de las colonias bacterianas de las placas usando un contador de colonias y calcular el título de las bacterias en la suspensión de la prueba. Preparar suspensión bacteriana con la concentración final 1 x 10 8 UFC / ml en PBS.
2. Animales
- Utilice 32 ratas Sprague-Dawley macho (250 - 300 g,). Mantener los animales en condiciones libres de patógenos específicos con acceso libre a pienso estándar de pellets y agua. Establecer una temperatura media (21 ± 1 ° C), humedad (50 ± 5%) y un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas.
3. Diseño Experimental
- Iniciar el tratamiento de los animales por sonda oral 11, después de 2 días de aclimatación. Usar la jeringa con la aguja de gavage oral. El tratamiento de las ratas con 16 B. suspensión subtilis BSB3 (1 ml por rata) dos veces al día durante dos días (B. subtilis grupo). Tratar a 16 ratas con PBS (1 ml por rata) dos veces al día durante dos días (grupo PBS) (Figura 1).
- Después del tratamiento, una subdivisión de cada grupo (8 ratas por grupo): Grupo 1- control (PBS / sin estrés), Grupo 2- B. subtilis (B. subtilis / sin estrés), Grupo 3- estrés (PBS / estrés por calor) y el Grupo B. 4- subtilis + estrés (B. subtilis estrés / calor).
- Medir la temperatura rectal de cada rata usando un electronic termómetro digital. Mantener las ratas de los grupos 1 y 2 a temperatura ambiente durante 25 min. Coloque los animales de los grupos 3 y 4 en una cámara climática a 45 ° C y una humedad relativa del 55% durante 25 min.
- Después, medir la temperatura rectal de cada rata en todos los grupos utilizando un termómetro digital electrónico. Coloque todos los animales a temperatura ambiente durante 4 h.
- Anestesiar las ratas con isoflurano (2-4%) en un frasco de anestesia sellable y observar hasta que las ratas se anestesiaron profundamente (ausencia de respuesta a pizca dedo del pie). La eutanasia a las ratas por decapitación rápida con una guillotina.
- Recoger la sangre del tronco de cada rata 20 (15 - 16 ml) con las pipetas apirógenas en tubos apirógenas para obtener suero e inmediatamente tomar muestras de sangre (7 l de cada rata) con una pipeta para el examen microscópico.
- Poner los tubos con la sangre en un refrigerador durante al menos 30 minutos para permitir la coagulación. Tubos de centrifugación a 20 ° C, 7.000 xg durante 10 minutos y rápidamenteeliminar el suero con una pipeta. Suero alícuota obtenida de cada rata en 50 volúmenes l y se almacena a -20 ° C hasta el ensayo.
4. Procedimiento Quirúrgico
- Cortar / recorte toda la piel del abdomen y el tórax de la parte inferior de la carcasa con unas tijeras eléctricas. Coloque la carcasa en un gabinete estéril y tratar la superficie afeitada de la carcasa con alcohol 70%.
- Utilice un bisturí estéril para crear una incisión en la línea media del abdomen. Eliminar hígado, ganglios linfáticos mesentéricos, el bazo y el intestino delgado de cada rata utilizando pinzas estériles.
5. Análisis de la translocación bacteriana
- Colocar cada muestra de hígado, ganglios linfáticos mesentéricos y el bazo en tubos estériles tarados y pesar. Calcular el peso de la muestra como una diferencia entre el peso de un tubo con una muestra y el peso de un tubo vacío.
- Añadir PBS estéril al tubo para obtener una dilución 1:10 (w / v) de la muestra y homogeNiza cada muestra con un homogeneizador de tejidos de vidrio estéril para obtener una suspensión homogénea 21.
- Hacer diluciones seriadas (10 -1 a 10 -4) de cada muestra en PBS estéril. Plate 0,1 ml de todas las diluciones de cada tejido sobre la superficie de MacConkey y agar de sangre 5% y agar sangre Brucella con hemina (0,005 g / L) y vitamina K1 (0,01 g / L) placas.
- Incubar MacConkey y de placas de agar sangre 5% aeróbicamente y placas de agar sangre Brucella en condiciones anaeróbicas a 37 ° C 22.
- Recuento de las colonias de bacterias aerobias después de 24 hr, y las colonias de bacterias anaerobias después de 48 horas de incubación usando un contador de colonias. Expresar los resultados como el número de unidades formadoras de colonias (UFC) en un gramo de tejido.
6. Análisis histológico
- Retire pequeñas muestras de intestino de cada rata por el procedimiento quirúrgico (pasos 4.1 a 4.2). Fijar las muestras en fijador de Bouin, incrustar en parafina,preparar 6 micras secciones y secciones de tinción con hematoxilina y eosina usando procedimientos estándar 23.
- Utilice un sistema de microscopio de alta resolución para medir la altura de las vellosidades intestinales y espesor total de la mucosa en cada muestra (aumento de 100X) 24. Analizar 4 muestras de cada rata y hacer por lo menos veinte mediciones en cada muestra. Expresar los resultados en micrómetros.
7. Ensayo de citoquinas
- Utilice kits comerciales de ELISA para rata IL-1β; IL-6; TNF-α; INF-γ, y IL-10 para medir los niveles de citoquinas en el suero de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Generar curvas estándar para cada conjunto de muestras ensayadas usando estándares para el kit relevante. Definir el nivel de citocinas en cada muestra por comparación de los datos experimentales con la curva estándar apropiado.
8. Ensayo de lipopolisacárido
- Analizar el nivel de LPS en el suero usando una rata kit de ELISA de acuerdo con LPSprotocolo del fabricante. Estimar la concentración de LPS en muestras por comparación de los valores obtenidos con los valores de la curva estándar.
9. Alta Resolución Microscopía de Sangre
- Utilizar el sistema de microscopio descrito previamente 25,26. Utilice una plataforma de aislamiento de vibración como una base para el sistema de microscopio y cámara de vídeo y el ordenador 25 para grabar las imágenes en vivo. Calibrar las imágenes de prueba utilizando una diapositiva Richardson como se ha descrito previamente 27.
- Coloque 7 l de sangre recién extraída de cada rata en un portaobjetos de vidrio, cubreobjetos, fotografiar y grabar diez cuadros de imagen de 72 x 53,3 m 2 en cada muestra (ampliación 1,700X).
- Medir la concentración de vesículas utilizando software que proporciona una alta resolución de visión directa imágenes ópticas en tiempo real. Examinar un mínimo de 20 cuadros de imagen para cada condición experimental 28.
10. Statistics
- Expresar todos los valores como media y desviación estándar. Realizar el análisis estadístico y el trazado gráfico. Analizar los resultados con la prueba t de dos muestras, ajustar el nivel de significación de 0,05 para definir la significación estadística.
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Resultados
La temperatura corporal media de los animales antes e inmediatamente después del estrés por calor fue de 36,7 ± 0,07 ° C y 40,3 ± 0,17 ° C, respectivamente (P <0,05). La exposición de ratas al calor (grupo 3) resultó en una inhibición significativa de la altura de las vellosidades y el grosor de la mucosa total de (Figuras 2, 3). La administración oral de la cepa BSB3 antes protegida estrés intestino de los efectos nocivos de calor.
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Discusión
La exposición a altas temperaturas en condiciones graves de salud 29. La prevención y la detección precoz de complicaciones relacionadas con el estrés por calor son de vital importancia 30. El protocolo presentado se puede utilizar para evaluar la eficacia de los diversos enfoques para la prevención del estrés por calor efectos adversos.
Los pasos críticos dentro de este protocolo son: el procedimiento de tratamiento térmico (45 ° C, 25 min...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el fondo de la Universidad de Auburn FOP 101002-139294-2050.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P4417 | |
| Alcohol etílico | Productos Pharmco Inc. Brookfield, CT, EE. UU. | 64-17-5 | |
| Agar | VWR | 97064-334 | |
| Placas de agar MacConkey | VWR | 470180-742 | |
| Placas de agar sangre al 5% VWR | 89405-024 | ||
| Placa de agar sangre Brucella con hemin y vitamina K | VWR | 89405-032 | |
| Bouin' s Fijador | de Ciencias de Microscopía Electrónica, Hatfield, PA, EE. UU. | 15990 | |
| IL-10 Kit ELISA para Ratas | Invitrogen, Camarillo, CA, EE. UU | KRC0101 | |
| IL-1beta Kit ELISA para Ratas | Invitrogen, Camarillo, CA, EE. UU. | KRC0011 | |
| IL-6 Kit ELISA para Ratas | Invitrogen, Camarillo, CA, EE. UU | KRC0061 | |
| INF-gamma Kit ELISA para Ratas Invitrogen | , Camarillo, CA, EE. UU. | ||
| Kit ELISA para ratas TNF-alfa | Invitrogen, Camarillo, CA, EE. UU | Kit | |
| NeoBioLab, MA, EE. UU | RL0275 | ||
| 6020-1 | Caron, Marietta, OH, EE. UU | 6020-1 | |
| Beckman Coulter, Indianápolis, IN, EE. UU. | |||
| Sistema | |||
| lector | Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, EE. UU. | ELx 808 | |
| Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, EE. UU. | ELx50 | ||
| Gilson | , Pipetman, Francia | P100, P200, P1000 | |
| Incubadora C24 Agitador | Brunswick Scientific, Enfield, CT, EE. UU | Classic C24 | |
| Balanceador | Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, EE. UU | . 55 | |
| placas de Petri | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU. | 875713 100 mm x 15 mm | |
| SterilGard III Advance | The Baker Company, Sanford, ME, EE. UU | SG403 | |
| Matraces de cultivo | Corning Incorporated, Corning, NY, EE. UU. | 4995 | Frascos PYREX 250 ml Erlenmeyer |
| Espectrómetro óptico Genesys 20 | Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU. | 4001 | |
| Sony DXC-33 Cámara de video | Sony | ||
| Richardson diapositiva de prueba | Ciencia de la microscopía electrónica, Hatfield, PA, EE. UU. | 80303 | |
| Sistema de purificación de agua Millipore | Software Millipore | Direct-Q | |
| Image-Pro Plus | Media Cybernetics, MD, EE. UU | ||
| Balanza de triple haz | OHAUS Corporation, Parsippany, NJ, EE. UU. | ||
| Homogeneizador de tejidos, Dounce | VWR | 71000-518 |
Referencias
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