El protocolo descrito aquí representa un método fácil y reproducible que emplea cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) para medir el metabolismo de las purinas en células de leucemia linfocítica crónica (LLC) cultivadas en diferentes condiciones.
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Artículo de método
Ensayo basado en HPLC para supervisar extracelular de nucleótidos / nucleósidos de metabolismo en las células de la leucemia crónica humana linfocítica
En este artículo
Resumen
Resumen
Este método describe un cromatografía sensible, específico, fiable y reproducible de fase inversa de alto rendimiento líquido (RP-HPLC) ensayo desarrollado y validado para la cuantificación de nucleótidos extracelulares de purina y nucleósidos producidos por la leucemia linfocítica crónica purificada (CLL) las células bajo diferentes condiciones de cultivo . La separación cromatográfica de la adenosina 5'-monofosfato (AMP), adenosina (ADO) e inosina (INO) se lleva a cabo a temperatura ambiente en una columna a base de sílice, de fase inversa que se utiliza para la retención de compuesto polar. El método incluye una fase móvil binaria, que consiste en acetato de amonio 7 mM y acetonitrilo con un caudal de 1,00 ml / min. Los eluatos se controlan mediante un detector de UV fotodiodo matriz de conjuntos a 260 nm. Una curva de calibración estándar se genera para calcular la ecuación para la cuantificación de análisis de cada compuesto purina. se llevan a cabo entonces el control del sistema, adquisición de datos y análisis. La aplicación de este protocolo, AMP, INO y ADO eluyen a los 7, 11 y 11,9 min, respectivamente, y el tiempo total de funcionamiento para cada muestra es de 20 min. Este protocolo se puede aplicar a diferentes tipos de células y líneas celulares (tanto de suspensión y adherentes), utilizando medios de cultivo como matriz. Las ventajas son fáciles y rápidos de preparación de muestras y la exigencia de una pequeña cantidad de sobrenadante para el análisis. Además, el uso de un medio libre de suero permite omitir el paso de la precipitación de proteínas con acetonitrilo que afecta a la concentración final de los compuestos de purina. Una de las limitaciones del método es el requisito de la columna de equilibrado ejecutar antes de cada muestra de ejecución única, haciendo que el tiempo total de funcionamiento del experimento más largo y la prevención de las aplicaciones de cribado de alto rendimiento.
Introducción
La adenosina (ADO) es un nucleósido de purina con una molécula de adenina unido a un resto de azúcar ribosa molécula a través de un enlace glucosídico. Cuando está presente en el medio extracelular, que protege las células del daño excesivo por la acción del sistema inmune. Este papel se ha puesto de relieve el uso de diferentes modelos de enfermedades, tales como la colitis 1, diabetes tipo 2, asma 3, 4 sepsis, lesión isquémica y 5. Una de las principales funciones de ADO es la inhibición de las respuestas inmunes en el microambiente tumoral, lo que contribuye a la evasión inmune tumor 6. Por esta raz....
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Protocolo
CLL muestras de sangre se obtienen de acuerdo con las directrices institucionales y Declaración de Helsinki.
1. Aislamiento de leucémica linfocitos de muestras de sangre de pacientes con LLC
- Tomar la muestra de sangre en tubo de heparina sódica (tapón verde) 17.
- Hacer una dilución 1: 3 de sangre entera con RT 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Purificar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de muestras de sangre mediante centrifugación en gradiente de densidad.
- Underlay 5 ml de medio de centrifugación de densidad (por ejemplo, Ficoll) en un tubo de centrífuga de 15 m....
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Resultados
Para evaluar el porcentaje (%) de las células leucémicas en PBMCs recién purificada a partir de un paciente con CLL representante, las células se marcaron con anticuerpos anti-CD5 anti-CD19 y. El panel izquierdo de la Figura 3 representa un gráfico de puntos cytofluorimetric con una puerta selectivo en células vivas. La figura 3 muestra un ejemplo de PBMC de un paciente antes de CLL (panel medio) y después de la purificación de células B (panel derecho)........
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Discusión
El protocolo descrito aquí permite evaluar la actividad de la CD39 / CD73 maquinaria adenosinérgico en medios de cultivo celular a partir de células leucémicas humanas purificadas. A través de este método HPLC podemos seguir y medir cuantitativamente la generación enzimática de ADO (CD73-dependiente) y su consiguiente degradación a INO (CD26 / ADA dependiente). El uso de inhibidores de la enzima permite controlar el protocolo y tener controles internos. Las ventajas y las novedades de este protocolo son que: i) se puede.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo es apoyado por Associazione Italiana Ricerca Cancro (IG # 12754).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sangre | |||
| Agua Milli-Q | Millipore | Agua doble desionizada | |
| Ficoll-Paque Plus | GE-Healthcare | 17-1440-03 | |
| purificado anti-CD3, -CD14, -CD16 | de fabricación propia | monoclonal de ratón | |
| con PE anti-CD19 | Miltenyi Biotec | 120-014-229 | |
| Marcado por la FITC anti-CD5 | Miltenyi Biotec | 130-096-574 | |
| Dynabeads ovejas anti-ratón IgG | Invitrogen | 11031 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Amresco | E404-200TABS comprimidos | |
| albúmina sérica bovina (BSA) | ID bio | 1000-70 | |
| tampón | PBS 0,1% BSA 2 mM EDTA, pH 7,4 | ||
| Suero AIM V medio libre | GIBCO | 12055-091 | líquido (grado de investigación) |
| adenosina 5'-difosfato (ADP) | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| adenosina 5'-monosfato (AMP) | Sigma-Aldrich | A1752 | |
| adenosina (ADO) | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| inosina (INO) | Sigma-Aldrich | I4125 | |
| & alfa;,β-metileno-ADP (APCP) | Sigma-Aldrich | M8386 | Inhibidor de CD73 |
| Clorhidrato de EHNA | Sigma-Aldrich | E114 | Inhibidor de la adenosina desaminasa |
| Desoxicoformicina (dCF) | Tocris | 2033 | Inhibidor de la adenosina desaminasa |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dipiridamol | Sigma-Aldrich | D9766 | inhibidor del transportador de nucleósidos |
| acetonitrilo (CHROMASOLV Plus) | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Acetato de amonio | Sigma-Aldrich | 9688 | 7 mM, pH 3.0 |
| ácido clorhídrico | Sigma-Aldrich | 30721-1L | mín. 37% |
| Nombre | Empresa | Catálogo Número< | fuerte>Comentarios |
| Equipo | |||
| Bü Contador de células RKER | VWR | 631-0920 | hemocitómetro |
| DynaMag-15 Imán | Invitrogen | 12301D | Separador de perlas magnético Dynal |
| microcentrífuga tubos de bloqueo seguro | Eppendorf | 030-120-0086 | 1,5 ml |
| Corning | 430053/430304 | 15 – 50 ml | |
| Filtros de jeringa Minisart RC4 | Sartorius Stedim Biotech | 17821 | membrana 0,2 y micro; m |
| viales de rosca corta | VWR | 548-0029 | 1,5 ml/ |
| microinsertos de | VWR | 548-0006 | 0,1 ml/tapones |
| rosca de | VWR | 548-0085 | 9 mm/PP azul |
| Atlantis dC18 Column | Waters | 186001344 | 5 µ m, 4,6 mm x 150 mm |
| Atlantis dC18 Columna de Guardia | Aguas 186001323 | 5 y micro; m, 4,6 mm x 20 mm | |
| Módulo de separaciones Waters Alliance 2965 | Waters | Módulo de separación por HPLC | |
| Waters 2998 Detector de matriz de fotodiodos (PDA) | Waters Detector | UV | |
| Software Empower2 | de Waters Waters |
Referencias
- Naganuma, M., Wiznerowicz, E. B., Lappas, C. M., Linden, J., Worthington, M. T., Ernst, P. B. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunology. 177 (5), 2765-2769 (2006).
- Nemeth, Z. H., et al.
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Reimpresiones y permisos
