Secuenciación de captura de ADN de unión a metil-para tejidos del paciente

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para investigar la metilación del ADN del genoma de ancho en estudios de cribado de pacientes clínicos a gran escala utilizando la secuenciación Metil-unión de captura de ADN (SEC-MBDCap o MBD-ss) la tecnología y el análisis de tuberías bioinformática posteriores.

Resumen

La metilación es una de las modificaciones epigenéticas esenciales en el ADN, que es responsable de la regulación precisa de los genes necesarios para el desarrollo estable y la diferenciación de diferentes tipos de tejidos. La desregulación de este proceso es a menudo el sello de diversas enfermedades como el cáncer. Aquí, se describe una de las técnicas de secuenciación recientes, Metil-Binding secuenciación de captura de ADN (MBDCap-seq), que se utiliza para cuantificar la metilación en diversos tejidos normales y de enfermedad para grandes cohortes de pacientes. Se describe un protocolo detallado de este enfoque enriquecimiento por afinidad junto con una tubería de bioinformática para lograr la cuantificación óptima. Esta técnica se ha utilizado para secuenciar cientos de pacientes a través de diversos tipos de cáncer como parte de la metiloma proyecto 1000 (Sistema de metiloma Cáncer).

Introducción

Regulación epigenética de genes a través de la metilación del ADN es uno de los mecanismos esenciales requeridos para determinar el destino de la célula por la diferenciación estable de diferentes tipos de tejidos en el cuerpo ^1. La desregulación de este proceso ha sido conocido por causar varias enfermedades incluyendo el cáncer ^2.

Este proceso implica principalmente la adición de grupos metilo en el residuo de citosina en los dinucleótidos CpG de ADN ^3. Hay algunas técnicas diferentes que actualmente se utilizan para investigar este mecanismo, cada uno con sus propias ventajas tal como se describe en muchos estudios ^2-8. Aquí vamos a ....

Protocolo

Todos los tejidos se obtienen después de la aprobación del Comité de Revisión Institucional y cuando todos los participantes dieron su consentimiento para ambos análisis moleculares y estudios de seguimiento. Los protocolos son aprobados por el Comité de Estudios Humanos de la Universidad de Texas Health Science Center en San Antonio.

1. unión Metil-de captura de ADN (MBDCap)

1. Recogida de muestras y el aislamiento de ADN
   1. Recoger tumor mayor o muestras de tejido normal a partir de muestras de tejido embebidas en parafina de pacientes.
   2. Utilice un kit comercial de mini ADN para aislar el ADN genómico de las muestras ....

Resultados

Hemos utilizado MBDCap-seq para estudiar alteraciones de metilación del ADN en un gran número de pacientes de diversos tipos de cáncer incluyendo cáncer de mama ^12, endometrial ^13, de la próstata ^14, y los cánceres de hígado, entre otros. Aquí se demuestra alguna información del cáncer de mama estudio publicado recientemente ^12. En este caso, se utilizó todo el enfoque de secuenciación del genoma para identificar las islas CpG que están metilados diferencialmente en el tumor con respecto a la norm.......

Discusión

La técnica MBDCap-seq es un enfoque de enriquecimiento de afinidad ^3, considerado como una alternativa rentable al investigar cohortes con un gran número de pacientes ^15. El oleoducto que aquí se presenta describe un enfoque integral, desde la adquisición de la muestra para el análisis y la interpretación de los datos. Uno de los pasos más importantes es la creación de un procedimiento de amplificación por PCR para mejorar la eficiencia de la PCR de las regiones GC enriquecido en el genoma ya que es donde se produce la.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de enriquecimiento de ADN Methylminer	Invitrogen ME10025
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	112-05D
Bioruptor Plus Dispositivo de sonicación	diagenode	B01020001
3 M acetato de sodio, pH 5.2	Sigma	S7899	100 mL
SPRIworks Fragment Library System I	Beckman Coulter	A50100	Sistema de construcción de bibliotecas totalmente automatizado
Adaptador Primers	Bioo Scientific	514104	PCR mezcla de cebadores
Qubit	Invitrogen	Q32854	Sistema de cuantificación fluorométrica
Mezcla maestra de PCR	KAPA scientific	KK2621	Mezcla maestra de PCR
AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	PCR Perlas de purificación
EB Buffer	Qiagen	19086
Sistema de secuenciación HiSeq 2000	Illumina