Secuenciación de captura de ADN de unión a metil-para tejidos del paciente

Regulación epigenética de genes a través de la metilación del ADN es uno de los mecanismos esenciales requeridos para determinar el destino de la célula por la diferenciación estable de diferentes tipos de tejidos en el cuerpo ^1. La desregulación de este proceso ha sido conocido por causar varias enfermedades incluyendo el cáncer ^2.

Este proceso implica principalmente la adición de grupos metilo en el residuo de citosina en los dinucleótidos CpG de ADN ^3. Hay algunas técnicas diferentes que actualmente se utilizan para investigar este mecanismo, cada uno con sus propias ventajas tal como se describe en muchos estudios ^2-8. Aquí vamos a discutir una de estas técnicas llamadas Metil-Binding secuenciación de ADN de captura (MBDCap-ss), donde utilizamos una técnica de enriquecimiento de afinidad para identificar regiones del ADN metilado. Esta técnica se basa en la capacidad de unión metil-de la proteína MBD2 para enriquecer los fragmentos de ADN genómicos que contienen sitios CpG metilados. Utilizamos un kit de enriquecimiento de ADN metilado comercialpara el aislamiento de estas regiones metiladas. Nuestro laboratorio ha proyectado cientos de muestras de pacientes utilizando esta técnica y aquí proporcionar un protocolo optimizado integral, que se puede utilizar para investigar grandes cohortes de pacientes.

Como es evidente con cualquier tecnología de secuenciación de nueva generación, MBDCap-seq también requiere un enfoque de la bioinformática específicos con el fin de cuantificar con precisión los niveles de metilación a través de las muestras. Ha habido muchos estudios recientes, en un esfuerzo para optimizar el proceso de normalización y el análisis de los datos de secuenciación de ^{9, 10.} En este protocolo, se demuestra uno de estos métodos de aplicación de un enfoque de recuperación de lectura única - LONUT - seguido de la normalización lineal de cada muestra con el fin de permitir las comparaciones imparciales través de gran número de muestras de pacientes.

Todos los tejidos se obtienen después de la aprobación del Comité de Revisión Institucional y cuando todos los participantes dieron su consentimiento para ambos análisis moleculares y estudios de seguimiento. Los protocolos son aprobados por el Comité de Estudios Humanos de la Universidad de Texas Health Science Center en San Antonio.

1. unión Metil-de captura de ADN (MBDCap)

1. Recogida de muestras y el aislamiento de ADN
   1. Recoger tumor mayor o muestras de tejido normal a partir de muestras de tejido embebidas en parafina de pacientes.
   2. Utilice un kit comercial de mini ADN para aislar el ADN genómico de las muestras de tejido embebidas en parafina de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   3. Utilice un kit de enriquecimiento de ADN metilado con el procedimiento descrito aquí de acuerdo con el protocolo del fabricante.
2. Lavado del grano inicial
   Nota: Las perlas se utilizan para acoplar con proteínas MBD-biotina, que detecta la metilación del ADN en el genoma. Las cuentas se suspenden generalmenteen una solución de reserva. Utilice estos pasos para lavar este líquido.
   1. Volver a suspender las acciones de perlas de estreptavidina (Ver Tabla de Materiales) pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para obtener una suspensión homogénea. No mezclar los granos con el vórtex.
   2. Por un g de ADN de entrada, ADD10 l de perlas a un tubo con 90 l de 1x bind / tampón de lavado. Rotar durante 1 min. No mezclar mediante agitación.
   3. Se coloca el tubo (s) sobre una rejilla magnética durante 1 min.
   4. Retire el líquido con una pipeta y descartar el líquido.
   5. Añadir 250 l de 1x bind / tampón de lavado hasta el talón y girar durante 1 min.
   6. Repita los pasos 1.2.3 - 1.2.5 dos veces.
3. El acoplamiento de la proteína MBD-biotina a las perlas
   1. Para 1,2 g de ADN de entrada, añadir 7 l (3,5 g) de la proteína MBD-biotina a cada tubo.
   2. Añadir 93 l de 1x bind / tampón de lavado a la proteína para hacer un volumen final de 100 mL.
   3. Mezclar el grano-proteínamezcla en un mezclador giratorio a temperatura ambiente durante 1 h.
4. La fragmentación de ADN (de entrada)
   1. Someter a ultrasonidos ADN mediante la adición de 1,2 g de ADN genómico total en 96 l de tampón TE y 24 l de 5x tampón / lavado de enlace para hacer una solución de 120 mL. Utilice 30 s de potencia ON y OFF 30 s de energía durante la sonicación, 20 - 25 veces.
   2. Ejecutar 1 l de solución de ADN se sometió a ultrasonidos utilizando un sistema Bioanalyzer con un kit de ADN de alta sensibilidad comercial para comprobar el tamaño de los fragmentos a estar en el rango de 150 a 350 pb de acuerdo con el protocolo del fabricante.
5. Se lavan las MBD-cuentas
   1. Se coloca el tubo que contiene MBD-cuentas sobre una rejilla magnética durante 1 min.
   2. Retire y deseche el líquido con una pipeta sin tocar las bolas.
   3. Volver a suspender las perlas con 250 l de 1x bind / tampón de lavado.
   4. Mezclar las perlas en un mezclador giratorio a temperatura ambiente durante 5 min.
   5. Repita los pasos 1.5.1 - 1.5.4 dos veces.
   6. La reacción de captura de ADN fragmentado (1 g de ADN de entrada)
      1. Transferir la mezcla de ADN / Buffer al tubo que contiene los MBD-perlas.
      2. Mezclar los MBD-perlas con el ADN en un mezclador giratorio durante 1 h a TA. Alternativamente, la mezcla de O / N a 4 ^° C.
   7. Extracción de ADN no capturado de las perlas
      1. Después de mezclar el ADN y MBD-perlas, colocar el tubo en la gradilla magnética durante 1 minuto para concentran todas las perlas en la pared interior del tubo.
      2. Eliminar el líquido sobrenadante con una pipeta y guardarlo en un tubo de microcentrífuga libre de DNasa limpio como el ADN no metilado. Guarde esta muestra en hielo.
      3. Añadir 200 l de 1x bind / tampón de lavado a las perlas para lavar los granos.
      4. Mezclar las perlas en un mezclador giratorio para 3 min.
      5. Se coloca el tubo en la gradilla magnética durante 1 min.
      6. Retire el líquido con una pipeta y guardarlo en un tubo de microcentrífuga.
      7. para la tapatura reacciones de ≤1 g de ADN de entrada, repita los pasos 1.7.3 - 1.7.6 para 2 más fracciones de lavado en total.
   8. Elución sola fracción
      1. Mezclar tampón bajo en sal con tampón de alta salinidad (1: 1) para obtener tampón de elución (NaCl 1,000 mM).
      2. Resuspender las perlas en 200 l de tampón de elución (NaCl 1,000 mM).
      3. Se incuban las cuentas de un mezclador rotativo durante 3 min.
      4. Se coloca el tubo en la gradilla magnética durante 1 min.
      5. Con el tubo en su lugar en la rejilla magnética, eliminar el líquido con una pipeta sin tocar las bolas con la punta de la pipeta, y guardarlo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml libre de DNasa limpia. Guarde esta muestra en hielo.
      6. Repetir los pasos 1.8.1 - 1.8.4 una vez, la recogida de la segunda muestra en el mismo tubo (volumen total será de 400 l). Almacenar la muestra agrupada en hielo.
   9. Precipitación con etanol (limpieza ADN)
      1. Para cada uno, de lavado y elución fr fracción noncapturedom los pasos anteriores, añadir 1 l de glucógeno (20 mg / l, incluido en el kit), el volumen de un décimo de la muestra de acetato de sodio 3M, pH 5,2 (por ejemplo, 40 l por 400 l de muestra) y 2 volúmenes de muestra de 100% etanol (por ejemplo, 800 l por 400 l de muestra). El volumen total es de 1.241 l.
      2. Mezclar bien e incubar a -80 ^° C durante al menos 2 h.
      3. Centrifugar el tubo durante 15 min a 11.363 xg a 4 ^° C.
      4. deseche con cuidado el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
      5. Añadir 500 l de etanol frío al 70%.
      6. Centrifugar el tubo durante 5 minutos a 11.363 xga 4 ^° C
      7. deseche con cuidado el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
      8. Repita los pasos 1.9.6 - 1.9.7 vez y eliminar cualquier sobrenadante residual que queda.
      9. El aire seco de la pastilla de ~ 5 min. No seque completamente el sedimento.
      10. Resuspender el sedimento de ADN en 37,5 l de agua libre de ADNasa u otrovolumen apropiado de tampón.
      11. Coloque el ADN en hielo o almacenar el ADN a -20 ^° C o por debajo hasta su uso posterior.
      12. Compruebe que la cantidad total de ADN es más de 20 ng, (por ejemplo, utilizar el sistema de cuantificación fluorométrica, ver Tabla de Materiales).

   2. Secuenciación

   1. Usa los fragmentos de ADN recuperados del procedimiento MBDCap para la secuenciación. Para cada muestra que se secuenció, una cantidad total de 20 - Se requiere 40 ng de ADN para la preparación de la biblioteca.
   2. Para la preparación de la biblioteca de ADN-seq utilizar un sistema de construcción de la biblioteca totalmente automatizado (Ver Tabla de Materiales) y seguir el protocolo estándar suministrado por el fabricante. Seleccione fragmentos de ADN de tamaño 200 a 400 pb para la preparación de la biblioteca. El sistema de preparación de la biblioteca de automatización permite estandarizar el procedimiento de preparación de la biblioteca y minimizar la variación entre las muestras debido a la preparación manual.
   3. primer uso del adaptadorRS y diluir a la concentración de 100x. Por ello, utilice 10 l para cada muestra.
   4. Después de la etapa 2.2, llevará a cabo la reacción, y cuantificar la biblioteca de ADN-ss usando un sistema de cuantificación fluorométrico (Ver Tabla de Materiales).
      1. Establecer procedimiento de amplificación por PCR. La elección de la mezcla de PCR principal es mejorar la eficiencia de la PCR de GC enriquecido región del genoma. En un tubo de PCR, añadir 15 l de la biblioteca de ADN-ss, 25 l de PCR Master Mix (Ver Tabla de Materiales), 2 l de PCR mezcla de cebadores (Ver Tabla de Materiales), y 8 l _{de H2O}
   5. Seguir las recomendaciones PCR del fabricante de la mezcla maestra de PCR, la alteración de los tiempos de ciclo y temperaturas para diferentes materiales de partida: 98 ^° C durante 45 s, los ciclos X de 98 ^° C durante 15 s, 65 ^° C durante 30 s, 72 ^° C durante 30 s, y luego 72 ^° C durante 1 min. Mantener a 4 ^° C
      1. perfORM suficientes ciclos para terminar con un 2 - 10 nM de ADN de la librería (8 - 10 ciclos).
   6. Limpiar reacción de PCR con 1: relación de perlas de purificación de PCR de acuerdo con el protocolo del fabricante 1 (Ver Tabla de Materiales).
   7. Eluir con 20 - tampón de elución 30 l.
   8. Código de barras de cada muestra y piscina 4 muestras juntas en un carril de una celda de flujo. Utilizar el protocolo estándar de 50 pb lectura única para la secuenciación (Ver Tabla de Materiales).

   3. Análisis de Bioinformática

   Nota: Además de procesar los archivos FASTQ primas obtenidas de la secuenciación para llevar a cabo el control de calidad y el mapeo de las secuencias cortas de ADN (lee) en el genoma.

   1. El uso de Bowtie alineador de lectura corta, herramienta de mapeo del genoma en un archivo de muestra FASTQ para mapear las lecturas al genoma de referencia. Muchas herramientas de mapeo de lectura están disponibles para llevar a cabo este paso y se pueden utilizar en base a las preferencias individuales.
      1. Permitir hasta 2 desajustes en el whole lee, mientras que la cartografía al genoma de referencia. Reportar hasta 20 mejores alineaciones para cada lectura. Por ejemplo, utilizar pajarita -v -k 2 --el 20 --chunkmbs 200 <EBWT> <fastqFile> <alignFile>.
   2. Utilice LONUT ⁹ para recuperar el mapeado multiplican lee para mejorar la detección de las regiones enriquecidas. Para cada lectura, a lo sumo una alineación se recuperaría cuando está lo suficientemente cerca de cualquiera de los anteriormente llamados picos. Por ejemplo, utilice: Perl lonut.pl -g hg19 -w -p 250 99 <alignFile> <OutputPath>. LONUT llevará a cabo los siguientes pasos.
      1. alineaciones divididos en un asignan únicamente lee y se multiplican asignan lee. Pico de llamada asignada de forma única en la persona que llama se lee usando pico CORREA ^11. La opción -w -p 250 y 99 en el comando de ejemplo son para el cinturón.
      2. Combinar asignada de forma única lee con el recuperado lee obtenido de LONUT, y el combinado lee, en formato BED, se utilizará en el análisis adicional. Calcular el número de Combined lee para la futura normalización.
   3. Bin la lee. Extracto lee en la región de interés mediante secuencias de comandos Perl: Perl methyPipeline.pl <sampleInfoFile> <refGeneFile> -up <longitud que se extiende aguas arriba> dn <longitud que se extiende aguas abajo>. Para cada archivo que aparece en la cama sampleInfoFile, el script de perl realiza las tareas siguientes.
      Nota: Consulte el archivo de codificación complementaria para el script Perl.
      1. Bin lee en el tamaño de ubicación fija, por ejemplo, de 100 pb, de 24 cromosomas.
      2. Para cada gen se especifica en refGeneFile, extraer los contenedores alrededor del sitio de inicio de transcripción (TSS), hasta la longitud que se extiende especificado por la opción -up y -dn. Por ejemplo, extraer los datos de la región que está arriba y aguas abajo de 4 kb de TSS. En bin tamaño de 100 pb, este extrajeron los datos tienen 81 contenedores, y el cubo central corresponde a la SAT.
      3. Para el gen de la cadena antisentido, voltear la región extraída de izquierda a derecha de manera que los contenedores de aguas arriba son siempre placed a la izquierda con el script de perl.
      4. Además dividir la región de ± 4 kb TSS en tres subregiones: A la izquierda, aguas arriba a aguas arriba de 4 kb 2 kb; Medio, aguas arriba y abajo de 2 kb; Derecha, aguas abajo de 2 kb a 4 kb.
      5. Para cada muestra, se divide el recuento de lecturas en cada intervalo por el número total de lecturas combinadas asignada calculada en 3.3.3. La normalización eliminará la muestra específica leer las diferencias y permite comparar la lee a través de diferentes muestras.
   4. Ejecutar el script bash (como se indica en el archivo de script) para realizar la prueba estadística de la normalizado lecturas obtenida de la región a la izquierda, para detectar la metilación diferencial entre el grupo normal y ocurre en las regiones descritas como en la región del flanco.
      Nota: Consulte el archivo de codificación adicional para la escritura del golpe. Sobre la base de las regiones que están metilados diferencialmente, hay siete combinaciones:
      Toda la región: la metilación diferencial en toda la región de ± 4 kb TSS
      middlmetilación diferencial tanto en la región centro y la izquierda: eLeft
      metilación diferencial tanto en la región central y derecho: MiddleRight
      metilación diferencial tanto en la región a la izquierda y la derecha: el flanco
      A la izquierda: la metilación diferencial en la región izquierda solamente
      metilación diferencial en la región de la derecha solamente: Derecho
      metilación diferencial en la región media solamente: Medio
   5. Utilice la misma escritura del golpe para visualizar la metilación diferencial en una parcela tornado. Representar gráficamente los hiper e hipo genes metilados en un panel separado, y ordenarlos en el orden de la combinación de regiones como se describe en el apartado 3.4, respectivamente.

Hemos utilizado MBDCap-seq para estudiar alteraciones de metilación del ADN en un gran número de pacientes de diversos tipos de cáncer incluyendo cáncer de mama 12, endometrial 13, de la próstata 14, y los cánceres de hígado, entre otros. Aquí se demuestra alguna información del cáncer de mama estudio publicado recientemente 12. En este caso, se utilizó todo el enfoque de secuenciación del genoma para identificar las islas CpG que están metilados diferencialmente en el tumor con respecto a la normalidad a través de diferentes regiones genómicas. La investigación reveló que de un total investigó las islas CpG localizadas en los promotores de genes (n = 13.081), el 19,5% mostró metilación diferencial en los tumores en comparación a la normalidad. Del mismo modo, de 6.959 islas CpG intragenic, el 55,2% mostró metilación diferencial. Promotores intergénicas mostraron un 28,1% de los 4.847 y los promotores de genes sin islas CpG, el 1,8% de 5.454 regiones investigadas mostró metilación del ADN diferencial (Figura 1A). Una representación visual(Figura 1B) muestra ejemplos representativos de las regiones descritas anteriormente. El mapa de calor muestra claramente las regiones metiladas en 77 tumores de mama, 10 tejidos normales de mama, y ​​líneas celulares de cáncer de mama 38. La cuantificación de la metilación como se discute en el protocolo de la bioinformática se detalla en este manuscrito, nos permite realizar diversas pruebas estadísticas a través de estas muestras de pacientes para identificar diferencias significativas en la metilación del conjunto de la población o de una subpoblación. Este enfoque de análisis nos proporciona objetivos comprobables para investigar más a fondo los mecanismos epigenéticos en estas muestras de pacientes. Una vez que se identifican estos objetivos, los niveles de metilación se pueden cuantificar más y validaron utilizando la pirosecuenciación. El MBDCap-ss proporciona una resolución genómico de aproximadamente 100 - 200 pb de los objetivos. Para obtener además la resolución, las ubicaciones de CpG individuales dentro de estas regiones se pueden seleccionar para pirosecuenciación cuantificación. Utilizamos este enfoque en Quantificar y validar las diferencias de metilación observadas en los datos MBDCap-Seq a una mayor resolución y para la comparación entre los grupos de pacientes individuales. La figura 2 muestra la cuantificación de la metilación en 2 cáncer endometrial subgrupos no recurrente (NR) en comparación con recurrentes (R). La figura representa el nivel de metilación del ADN para cada paciente en los 2 grupos en diferentes sitios CpG en el promotor isla CpG de la SFRP1 gen diana identificado.

Figura 1:. Hipermetilación del ADN en muestras de cáncer de mama en relación con el tejido mamario normal en promotor y no promotor islas CpG captura de metilo secuenciación (MBD-seq) se utilizó para generar los perfiles de metilación del ADN de los genomas de los tumores de mama (n = 77) y tejido mamario normal (n = 10). (A) Pigráficos e demuestran la metilación diferencial de promotor, intragenic, y intergénica CGIs así como regiones promotoras no CGI. (B) Ejemplo loci que muestra promotor CGI, intragenic, intergénicas, y regiones promotoras no CGI. Trazos cuadrados resaltan las regiones correspondientes a la hipermetilación del cáncer de mama. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: La cuantificación de la metilación del ADN mediante pirosecuenciación de sitios CpG en un gen diana identificados metilación del ADN de 5 SFRP región promotora en recurrentes y no recurrentes pacientes con carcinoma de endometrio detectados por pirosecuenciación.. Cada sitio representa un sitio CpG (R: Recurrente, n = 21 y NR: no periódicas, n = 71). Los gráficos muestranlas barras de error muestran la media y el error estándar de la media o SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Este protocolo se desarrolló en los laboratorios del Dr. Tim Huang y el Dr. Victor Jin de la Universidad de Texas Health Science Center en San Antonio.