Método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular Drosophila Los fotorreceptores y interneuronas a la luz Estímulos En Vivo

Resumen

Los microelectrodos afilados permiten una caracterización electrofisiológica precisa de la salida de fotorreceptores e interneuronas visuales en Drosophila viva. Aquí mostramos cómo usar este método para registrar respuestas de voltaje de alta calidad de células individuales a la estimulación de luz controlada. Este método es ideal para estudiar el procesamiento de la información neuronal en ojos compuestos de insectos.

Resumen

Las respuestas de voltaje de los fotorreceptores de insectos y las interneuronas visuales se pueden registrar con precisión con microelectrodos afilados convencionales. El método descrito aquí permite al investigador medir respuestas intracelulares duraderas (de minutos a horas) de alta calidad de fotorreceptores R1-R6 de Drosophila individuales y células monopolares grandes (LMC) a estímulos luminosos. Debido a que el sistema de grabación tiene poco ruido, se puede utilizar para estudiar la variabilidad entre las células individuales en el ojo de la mosca y cómo sus salidas reflejan las propiedades físicas del entorno visual. Describimos todos los pasos clave para realizar esta técnica. Se describen los pasos básicos para construir una configuración electrofisiológica adecuada para el registro, como el diseño y la selección del equipo experimental. También explicamos cómo prepararse para la grabación mediante la creación de electrodos de registro (nítidos) y de referencia (romos) adecuados. Se dan detalles sobre cómo fijar una mosca intacta en un soporte para moscas hecho a medida, preparar una pequeña ventana en su ojo e insertar un electrodo de registro a través de este orificio con un daño mínimo. Explicamos cómo localizar el centro del campo receptivo de una célula, adaptar la oscuridad o la luz a la célula estudiada y registrar sus respuestas de voltaje a los estímulos dinámicos de luz. Finalmente, describimos los criterios para registros normales estables, mostramos las respuestas de voltaje características de alta calidad de las células individuales a diferentes estímulos luminosos y definimos brevemente cómo cuantificar su rendimiento de señalización. Muchos aspectos del método son técnicamente desafiantes y requieren práctica y paciencia para dominarlos. Pero una vez aprendido y optimizado para los objetivos experimentales del investigador, otorga excelentes datos neurofisiológicos in vivo.

Introducción

La mosca de la fruta del ojo (Drosophila melanogaster) compuesto es un buen sistema modelo para investigar la organización funcional de los fotorreceptores y las interneuronas matrices para el muestreo y procesamiento de imagen neuronal, y para la visión de los animales. El sistema cuenta con el diagrama de cableado más completa ^1,2 y es amigable para las manipulaciones genéticas y supervisión de la actividad neuronal precisa (de alta relación señal-ruido y el tiempo de resolución) ^3-10.

El ojo de Drosophila es modular, que contiene ~ 750 estructuras de lentes con tapón aparentemente regulares llamados ommatidia, que en conjunto proporcionan un campo de visión de la panorámica que cubre casi todas las direcciones alrededor de su cabeza volar. Información primaria del ojo unidades de muestreo son sus fotorreceptores rhabdomeric ^7,8,11. Cada ommatidium contiene ocho células fotorreceptoras (R1-R8), que comparten la misma lente faceta pero están alineados con siete direcciones diferentes. Mientras que los fotorreceptores exteriores R1-R6 are más sensible a la luz azul-verde, sensibilidades espectrales de las células internas R7 y R8, que están por encima de la otra y apuntan a la misma dirección, exhiben tres subtipos distintivos: pálido, amarillo y área del borde dorsal (DRA) ^{12- 15.}

Figura 1. Organización funcional del ojo de Drosophila. (A) Los dos primeros ganglios de la óptica, la retina y la lámina, se resaltan en gris en el interior del ojo de la mosca. Fotorreceptores de la retina R1-R6 y lámina grandes células monopolares (LMC: L1-L3) son de fácil acceso en vivo a las grabaciones de microelectrodos convencionales fuerte. El electrodo esquemática destaca la ruta normal a grabar de R1-R6 en la retina. Uno de los caminos para grabar desde LMC en la lámina es cambiar de forma paralela al electrodo de la izquierda. (B) Lamina es una matriz de órgano retinotopicallyzados cartuchos, cada uno de los cuales está lleno de neuronas que procesa la información a partir de una pequeña área específica en el espacio visual. Debido a la superposición neural, seis fotorreceptores de diferentes ommatidia vecinos envían sus axones (R1-R6) a la misma cartucho de lámina, formando sinapsis de salida histaminérgicos a L1-L3 y una célula amacrine (Am). (C) La difusión de la información neural entre terminales de los axones R1-R6 y las interneuronas visuales (incluyendo L4, L5, Lawf, C2, C3 y T1), en el interior de un cartucho de lámina es complejo. (D) R1-R6 fotorreceptor axones reciben evaluaciones sinápticas de las células monopolar L2 y L4. (B) y (C) modificado de Rivera-alba et al ^2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El ojo de Drosophila es del tipo neuronal superposición ^16. Esto significa tsombrero de las señales neurales de ocho fotorreceptores pertenecientes a siete ommatidia vecina, que se ven en el mismo punto en el espacio, se agrupan juntos en un cartucho neural en los próximos dos neuropils: la lámina y la médula. Mientras que los seis fotorreceptores exteriores del proyecto R1-R6 sus terminales de los axones neuronales en columnas a la lámina (Figura 1), las células R7 y R8 pasar por alto esta capa y hacen contactos sinápticos con su columna de médula ^17-19 correspondiente. Estos cableados exactas producen el sustrato neural para el mapeo retinotopic de la mosca de la visión temprano, después de lo cual cada lámina (Figuras 1A-C) y la columna médula (cartucho) representa un único punto en el espacio.

Las entradas directas de fotorreceptores R1-R6 son recibidas por las células monopolares grandes (LMC: L1, L2 y L3) y la célula amacrinas (AM) en la lámina ^1,2,20. De estos, L1 y L2 son las células más grandes, que median en las principales vías de información (Figura 1D), WHIch responden a dentro y fuera de los bordes en movimiento, y por lo tanto constituyen la base de cálculo del detector de movimiento ^21,22. Experimentos sobre el comportamiento sugiere que, en contraste intermedia, las dos vías facilitan la percepción del movimiento de direcciones opuestas: back-to-front en L1 y de adelante hacia atrás en células L2 ^23,24. Conectividad implica, además, que las neuronas L4 pueden jugar un papel crítico en la comunicación lateral entre los cartuchos vecinos ^25,26. sinapsis recíprocas se encontraron entre las células L2 y L4, situados en la misma y dos cartuchos adyacentes. Aguas abajo, cada célula L2 y sus tres células L4 asociados proyectan sus axones a un objetivo común, la neurona Tm2 en la médula, donde se cree que las aportaciones de los cartuchos de vecinos para ser integrado para el procesamiento de movimiento de delante a atrás ^27. Aunque las neuronas L1 reciben el aporte de personas del mismo cartucho de L2 a través de las dos uniones comunicantes y las sinapsis, que no están conectados directamente a los cartuchos de lámina L4s y por lo tanto adyacentes.

1,2 L1 (Figura 1D). Mientras que las conexiones del mismo cartucho son selectivamente de L2 a R1 y R2 y de L4 a R5, todos los fotorreceptores R1-R6 reciben retroalimentación sináptica de L4 de uno o ambos cartuchos de vecinos. Además, existen fuertes conexiones sinápticas de AM a R1, R2, R4 y R5, y células gliales también están conectados sinápticamente a la red y por lo tanto pueden participar en el procesamiento de imágenes neural ^6. Por último, axonal gap-uniones, que une la vecina R1-R6 y R6 y R7 entre / R8 fotorreceptores en la lámina, contribuyen a la representación de la información asimétrica y el procesamiento de cada cartucho ^14,20,28.

Grabaciones de tensión intracelulares de fotorreceptores individuales y las interneuronas visuales en casi intacto Drosophila proporcionan una alta r-señal-ruidoación de datos con una resolución sub-milisegundo ^3,5,7-10,29, que es necesaria para dar sentido a los cálculos neuronales rápidas entre las neuronas conectadas. Este nivel de precisión no es posible mediante técnicas de imagen ópticos actuales, que son significativamente más ruidoso y por lo general operan a las 10 - una resolución de 100 ms. Por otra parte, debido a que los electrodos tienen puntas muy pequeñas y afiladas, el método no está restringido a los cuerpos de las células, pero puede proporcionar grabaciones directas de las estructuras nerviosas activas pequeñas; tales como árboles dendríticas los LMC 'o axones fotorreceptoras, las cuales no se puede acceder por consejos mucho más grandes de los electrodos de patch-clamp. Es importante destacar que el método también es estructuralmente menos invasivo y perjudicial que la mayoría de las aplicaciones de patch-clamp, y así afecta a menos de muestreo medio y la información intracelular de las células estudiadas. Por lo tanto, las técnicas de microelectrodos afilados convencionales han contribuido, y siguen contribuyendo, descubrimientos fundamentales y la visión original en Infor neuronalprocesamiento de la escala en el momento adecuado; mejorar nuestra comprensión mecanicista de la visión ^3-10.

En este artículo se explica cómo en registros intracelulares in vivo de Drosophila fotorreceptores y LMC R1-R6 se llevan a cabo en el laboratorio Juusola. Este protocolo describe cómo construir una plataforma de electrofisiología adecuado, preparar la marcha, y realizar las grabaciones. Se presenta algunos datos representativos, y algunos problemas comunes y las posibles soluciones se discuten que se pueden encontrar cuando se utiliza este método.

Protocolo

El siguiente protocolo cumple con todas las pautas de cuidado de animales de la Universidad de Sheffield y la Universidad Normal de Beijing.

1. Reactivos y la Preparación de

1. Grabación y configuración de la luz Equipo de Estimulación
   1. Elija por lo menos un área de grabación de 2,5 x 2,5 m para la realización de experimentos electrofisiológicos en una habitación que tiene aire acondicionado con humedad regulado y medios para proporcionar condiciones de grabación oscuros. Asegúrese de que esta zona es lo suficientemente grande como para caber cómodamente a: (i) 1 x 1 m mesa de vibración-aislamiento que alberga el equipo de perforación [vuela estimulación y aparatos de grabación], microscopio estereoscópico y una fuente de luz fría con dos cuellos de ganso, todos encerrados dentro de una grandes> 180 cm de altura jaula de Faraday; (Ii) un bastidor de equipo de 38U para alojar un ordenador personal con un monitor de pantalla plana LCD, amplificador de microelectrodos, los conductores del LED, filtros, unidades de control de temperatura, osciloscopios y otros instrumentos eléctricos necesarios; y (iii) unapequeño escritorio y una silla para el investigador.
   2. Coloque la plataforma lejos de fuentes de ruido eléctrico y mecánico, tales como refrigeradores, centrífugas y elevadores. Use protectores de sobretensión separadas para proteger los dispositivos eléctricos del equipo de perforación de los picos de tensión que se producen en la red eléctrica. Lo ideal es conectar la plataforma a su propia fuente de alimentación ininterrumpida (UPS batería) para minimizar el ruido.
   3. Construir una mosca titular cónica de latón y plástico negro (Figura 2). Perforar un agujero pequeño estrechamiento a través de la unidad de latón con su estrechamiento del borde externo a ~ 0,8 mm de diámetro (que se corresponda ancho tórax de una mosca típica).
      Nota: Este agujero debe disminuir gradualmente hacia la punta de la mosca-soporte de manera que una más grande que la media de Drosophila, que se proyecta desde abajo por el flujo de aire, que se atascan a profundidad del hombro en el borde superior.
   4. Diseño y construcción de un aparato de registro de estimulación y mecánicamente robusta, pero preciso, volar (Figura 3). Construir a cabo of aluminio o latón (metales de alta conductividad) una plataforma poste preparación mosca y alrededor de él un sistema Cardan-brazo, con rodamientos de bolas incrustadas, para proporcionar x suaves y precisos, y-posicionamiento y el bloqueo del estímulo luminoso.
      Nota: Este diseño compuesto integrado minimiza las vibraciones mecánicas, que de otro modo podrían desprender la punta del electrodo de registro hacia fuera de la célula estudiada. Se puede incorporar además un sistema de control de temperatura de bucle cerrado basado en elemento Peltier, que permite a los investigadores a utilizar construcciones genéticas sensibles a la temperatura, tales como shibire ^TS, para la evaluación de los cálculos de circuitos sinápticos ^9,30. Anodizar el aparato o pintarlo de negro para minimizar la dispersión de estímulo luminoso.
      1. Fijar la estimulación de la mosca y aparatos de grabación en placa de la mesa antivibraciones; por ejemplo, por M6-pernos, el uso de sus orificios de los tornillos métricos. Use un tablero negro o cubrirlo con tela de color negro para minimizar la dispersión de la luz durante los experimentos.
      2. Position y bloqueo (utilizando un tornillo de bloqueo) una plataforma poste preparación mosca ajustable verticalmente en el centro de un sistema Cardan-brazo. Coloque la mosca-preparación (dentro de la mosca titular, consulte el paso 2) en la plataforma poste de modo que la fuente de luz unido a la Cardan-brazo apunta radialmente hacia la cabeza de la marcha. Asegúrese de que el centro de los ojos de la mosca está exactamente en el punto de intersección (0, 0) de x- la de Cardan-brazo y ejes Y, ya que esto permite x precisos, y-posicionamiento del estímulo luminoso a cualquier punto dentro de la mosca de campo visual.
         Nota: Esta funcionalidad es necesaria para el mapeo de las propiedades de respuesta de las células individuales a posiciones específicas de los ojos; por ejemplo, en la búsqueda de pruebas electrofisiológicas para las adaptaciones estructurales, tales como zonas brillantes o agudas, que mostrarían una mayor sensibilidad o resolución, respectivamente ^31.
   5. Montar el microscopio estereoscópico mosca detrás de la estimulación y aparatos de grabación en la mesa anti-vibración paraque proporciona una visualización de alta magnificación cómoda del ojo de la mosca.
   6. Montar la fuente de luz fría en la parte superior del microscopio con doble cabezal semi-rígidos guías de luz de cuello de cisne de la fuente de luz apuntando hacia abajo hacia el soporte preparación mosca. Puede mover libremente dos iluminación del haz hace que sea más fácil visualizar la punta del electrodo de registro cuando se conduce a través de una pequeña abertura en el ojo de la mosca.
   7. Adjuntar un x, y, conjunto z-micromanipulador apropiado (grueso y fino) para el electrodo de registro y la cabeza-etapa en la mesa de anti-vibración, en el lado derecho del aparato de estimulación de la mosca y la grabación, usando M6-pernos o magnético se levanta.
      Nota: En el laboratorio Juusola, diferentes plataformas están equipadas con diferentes manipuladores; para más detalles ver la Tabla de Materiales y Reactivos. Todo esto proporciona registros intracelulares de alta calidad.
   8. Montar un pequeño manual micromanipulador de 3 ejes para el soporte del electrodo de referencia en la f regulable en alturaplataforma poste preparación ly. Oriente el electrodo de referencia de manera que apunte hacia la preparación mosca.
   9. Construir una jaula de Faraday independiente luz blindado de acero-paneles alrededor de la mesa antivibraciones, que rodea al aparato de estimulación mosca y grabación, para evitar las perturbaciones electromagnéticas externas. Deje la parte delantera de la jaula abierta, proporcionando acceso para el transporte de la preparación de la mosca para los experimentos. Coloque cortinas negras de tela (que tienen cobre o de aluminio de malla implantados dentro de ellos para la puesta a tierra) en la parte frontal para proteger el ruido y la luz. Pintar el interior de la jaula de negro para minimizar la dispersión de la luz y el perno los pies de la jaula en el suelo para evitar vibraciones.
   10. Conectar el voltaje y corrientes de salida del amplificador de alta impedancia microelectrodo intracelular a las entradas de dos filtros de paso bajo de Bessel separados (o similar) utilizando cables BNC. Del mismo modo, conecte las salidas de los filtros en los canales apropiados de los blo-conector DCCKS / tablas del sistema de adquisición de datos (tarjetas DA / AD). Conectar la tarjeta DA / AD (s) en un ordenador personal a través de cables especializados, de acuerdo con los manuales de los proveedores.
   11. Instalar el software de adquisición adecuado para el sistema de adquisición de datos de elección en el ordenador personal. Asegúrese de que los conductores de adquisición de datos son compatibles con el sistema operativo en el ordenador personal.
   12. Planta eléctricamente la estimulación de la mosca y aparatos de grabación, jaula de Faraday, malla de cobre (dentro de las cortinas), microscopio, micromanipulador, fuente de luz fría, estante 38U equipo con todos sus instrumentos (el amplificador intracelular, filtros, unidad de control de la temperatura, la PC y el monitor LCD etc.) en un único punto central de tierra mediante el uso de alambre de tierra del equipo y M6 engarzado extremos del anillo de puesta a tierra. Utilice un multímetro eléctrico para probar que todas las partes están en la misma planta.
       Nota: Para lograr las mejores condiciones de grabación de bajo ruido posible, las configuraciones de puesta a tierra suelen variar lado a otrom una puesta a punto a otro.
       1. Si es necesario, conecte el punto común de tierra aún más a la tierra del edificio, y / o central de tierra del amplificador de microelectrodos. Después de probar el sistema en pleno funcionamiento durante los experimentos electrofisiológicos reales, estar preparado para cambiar la configuración de conexión a tierra, según sea necesario para minimizar el ruido en las grabaciones.
   13. Configurar el software de la amplificación (1 - 10 veces), el filtrado de la señal (generalmente filtros de paso bajo regulado a 500 Hz, lo que es adecuado tanto para los datos de R1-R6 y LMC), y la frecuencia de muestreo (por lo menos 1 KHz). Asegúrese de que los ajustes obedecen Nyquist-Shannon teorema de muestreo de ^32; por ejemplo, cuando la adquisición de datos que es baja se pasa filtrada a 500 Hz, utilizar una frecuencia de muestreo de 1 kHz o superior para minimizar los efectos de aliasing.
       1. A medida que las respuestas de tensión característicos de fotorreceptores R1-R6 son 40 - 65 mV, y las de los países de ideas afines 20 - 45 mV, establece la amplificación y la visualización de las escalas en consecuencia para permitir a alta resolución sampling y visualización de datos.

Figura 2. cónico Fly-titular de la mosca titular está hecho de dos piezas:. La unidad de latón cónica central y su capa de plástico negro. El agujero central dentro de la unidad de latón se estrecha hasta un diámetro pequeño que apenas permite la marcha a través. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Descripción general del Rig electrofisiológico. La puesta a punto contiene una jaula independiente luz blindado de Faraday, la mesa antivibraciones, el aparato de estimulación y registro de la mosca, y cortinas de tela negro con cobre o aluminio-malla en el interior de toma de tierra. los complementostrumento bastidor está conectado eléctricamente a la misma planta central con todo el equipo dentro de la jaula de Faraday. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. La fabricación de microelectrodos
   1. Tire del microelectrodo de referencia a partir de borosilicato filamented (diámetro exterior: 1,0 mm; diámetro interior 0,6 mm) o de cristal de cuarzo (diámetro exterior: 1,0 mm; diámetro interior de 0,5, 0,6 o 0,7 mm) tubería usando un instrumento extractor de pipeta. Tratar de lograr una reducción gradual corto.
      Nota: Los ajustes exactos del programa de pipeta extractor varían de un instrumento a otro; más detalles en la Tabla de Materiales y regentes. El tamaño de poro en la punta no es crucial, ya que la punta del electrodo de referencia se romperá antes de ser insertado en la preparación de la mosca.
   2. Tire del microelectrodo grabación de borosilicato filamented (diámetro externo: 1,0 mm; diámetro interior 0,6 mm) o de vidrio de cuarzo (diámetro exterior: 1,0 mm; diámetro interior 0,5, 0,6 o 0,7 mm) tubería usando un instrumento de pipeta extractor. Trate de conseguir una larga (10 - 15 mm) cónica fina gradual.
   3. Inspeccionar con un microscopio de luz que los electrodos de registro muestran estrechamiento correcta. Montar el electrodo sobre un portaobjetos de vidrio con adhesivo moldeable y utilizar objetivo 40X de aire para inspeccionar su punta.
      Nota: Una buena electrodo se estrecha suavemente hasta su forma invisible punta pequeña, alrededor de los cuales más oscuro paralelo continuo y patrones de interferencia más ligeros pueden ser vistos. Algunas configuraciones del extractor generan electrodos de alta resistencia, que no pueden producir penetraciones celulares exitosos debido a que sus extremidades se asemejan a "trompetas". Por lo tanto, la inspección visual de los electrodos es importante.
   4. Coloque los electrodos en posición horizontal sobre una gran placa de Petri con plastilina (o adhesivo moldeable similar) para su custodia y el transporte a la plataforma de electrofisiología. Asegúrese de que la puntas de los electrodos de unavolver siempre en el aire y no tocar accidentalmente nada.
   5. Copias de llenar los electrodos de registro y de referencia justo antes del experimento con la solución de sal apropiada. Use una pequeña jeringa de 5 ml conectada a un filtro de partículas pequeño con una punta de plástico fina (como un microloader).
      1. Para fotorreceptores experimentos, llenar el electrodo de registro hasta completa (se forma una gotita en su extremo grande) con 3 M KCl ya que esta solución reduce al mínimo el efecto del potencial de unión líquida a la tensión de grabado.
      2. Para la investigación de los países de ideas afines histaminérgicos, que responden a la entrada sináptica de fotorreceptores R1-R6 por los cambios de cloruro-conductancia, llenar los electrodos de registro con 3 M acetato de potasio y KCl 0,5 mM, ya que esta solución tiene menos efecto sobre la batería de cloruro de la célula. Llenar el electrodo de referencia con mosca Ringer, que contiene en mM: NaCl 120, KCl 5, 10 TES (C ₆ H ₁₅ NO ₆ S), 1,5 _{CaCl2, MgCl2} 4, y 30 de la sacarosa
   6. Prueba de la resistencia de un electrodo de registro recién tirado en el sistema de grabación.
      1. Asegúrese de que los cables de plata dentro del electrodo titulares están uniformemente recubiertas con cloruro de plata (que aparece de color púrpura-gris - no plateada brillante) para minimizar los artefactos de grabación (como la deriva en el potencial de unión). Si no es así, reemplazarlos con cables debidamente clorurada.
      2. Si es necesario, chloridize nuevos hilos de plata. Limpiar cuidadosamente los cables (haciendo pasar rápidamente a través de una llama) para que éstos aparecen plata brillante en color. Evitar tocar con los dedos, con el fin de depositar en una capa uniforme de AgCl. Remojar los cables en lejía total de hogares fuerza durante 15 - 30 minutos hasta que aparecen de color púrpura-gris. Alternativamente, electroplate cada cable (por lo que es positivo con respecto a una solución que contiene 3 M KCl y pasar una corriente a través de él a una velocidad de 1 mA / cm ² de área de superficie) para 10 a 15 seg hasta recubierto adecuadamente.
      Conectar la grabación de nuevo lleno de electrodos de referencia y de sus electrodos titulares. Coloque baño de solución de Ringer un pequeño sobre la plataforma poste preparación mosca regulable en altura. Conducir las puntas de los electrodos en la solución de Ringer y medir la resistencia de la punta del electrodo de registro.
      Nota: Este paso sólo es necesario cuando se prueban las propiedades de resistencia de los electrodos, que se extraen de un nuevo lote de tubos de vidrio, o cuando la optimización de los programas de instrumentos de microelectrodos extractor a través de iteración.
   7. Antes de realizar las mediciones de resistencia, lea las instrucciones en el manual del usuario del fabricante del amplificador para la configuración de medición adecuados. Para un buen electrodo de registro, tener una resistencia punta de ~ 100 - 220 mO.

2. Preparación de Drosophila

1. Recoger 5 - 10 días de edad moscas (después de la eclosión) y colocarlos en un tubo limpio mosca que contiene standard alimentos. Es posible conseguir buenas grabaciones de más joven vuela demasiado, incluso de los "recién nacidos"; pero debido a sus ojos más suaves, el corte de una abertura de la córnea para el electrodo de registro es más difícil.
2. Construir un tubo de captura de mosca y una preparación mosca de pie (Figura 4). Ver Figura 4 para la idea general de cómo estas herramientas hechos a sí mismos fueron puestos juntos.
   1. Para hacer un tubo de captura de mosca, cortar la punta de fondo cónico de 50 ml tubo de centrífuga de plástico. A continuación, insertar y pegar el extremo grande de la punta de la pipeta 1 ml de esta nueva apertura.
   2. Por último, cortar el extremo pequeño de la pipeta a un tamaño que permite fácilmente una mosca para caminar a través. Consulte a un taller mecánico para montar una pequeña etapa de preparación de la mosca que permite la rotación de 2 ejes y el bloqueo de la marcha-titular a diferentes posiciones.

figure 4. Herramientas e idea necesaria para hacer la preparación de la mosca. Fly tubo de captura se hace pegando una punta de pipeta de plástico de 1 ml a un tubo de plástico de centrífuga de 50 ml. A medida soporte preparación mosca permite de libre rotación y bloqueo de la mosca titular en una posición preferida para preparar la marcha. La mosca es fijado por la cera de abejas, cera de eléctrica mediante el calentador. La vaselina es aplicada por un pequeño aplicador realizado mediante la conexión de un cabello tipo de espesor sobre un mango. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Se recoge una mosca para el experimento en una punta de pipeta de 1 ml, que apenas permite un elevado al pasar a través. Una el tubo de cazar moscas, con la punta de la pipeta en él, al tubo de mosca. En la captura de una mosca, aprovechar su tendencia inherente a subir hacia arriba (antigravitaxis) en la punta de la pipeta. Preferiblemente, seleccione el máximo femenina, ya que el tamaño importas en electrofisiología.
   Nota: Cuanto más grande sea la marcha, cuanto más grande es sus células y mejores serán las posibilidades de registros intracelulares de alta calidad. moscas pequeñas (tanto hembras como machos) también pueden proporcionar excelentes grabaciones, pero la preparación es más difícil de hacer. Una vez que la mosca está atrapada en una punta de pipeta grande, no olvide cerrar el tubo de mosca para detener otras moscas escapen.
4. Conectar una jeringa de 100 ml con un tubo de plástico flexible para la abertura más grande de la punta de la pipeta - con la mosca todavía en ella.
5. Coloque el extremo más estrecho en la punta de la pipeta grande, que se amplía sólo para que un Drosophila través, a la abertura en la parte inferior de la marcha-soporte y apretar un pequeño volumen de aire de la jeringa para expulsar la mosca en la marcha titular .
   1. Mira a través de la lupa binocular y administrar con cuidado más aire que la cabeza de la marcha sobresale desde el extremo cónico de la mosca titular. Asegúrese de que la mosca está firmemente atrapado desde el tórax hasta la pequeña opeNing en la parte superior de la mosca titular.
6. Utilizar un calentador de cera para fijar la marcha con la cera de abejas de sus "hombros" a la marcha-soporte. Ajustar la temperatura del calentador de cera para ser tan bajo como sea posible todavía limpiamente la fusión de la cera.
   Nota: Cuando la temperatura es correcta, la cera aparece transparente. Demasiado alto de una temperatura que hace que la cera "quemar"; demasiado baja mantiene la rigidez de cera. Al fijar la marcha, ser precisa y breve ya que la exposición prolongada al calor puede dañarlo. El uso de pegamento dental de fotocurado no se recomienda aquí que su aplicación es demasiado lento.

Figura 5. Preparación de la mosca para experimentos in vivo. Izquierdo, la cabeza A 's Drosophila se encuentre en posición vertical en la mosca de titular y se fija a partir de su trompa, ojo derecho y los hombros a la mosca-soporte con calentarseeswax. Derecha, una pequeña abertura se corta en la parte más gruesa del ojo, justo por encima del ecuador y sólo unos pocos ommatidia lejos de la cutícula hacia atrás, usando un filo de la navaja afilada. Un trozo de córnea se retira con suavidad y el agujero se sella con vaselina para evitar que el ojo se seque. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Inmovilizar la cabeza de la marcha. Aplicar la cera de abejas a la trompa (Figura 5) y la esquina del ojo derecho, evitando la córnea, y fijar la cabeza de estos puntos a la marcha-soporte.
8. Producir un micro-cuchillo. Sujetar una hoja de afeitar no de acero inoxidable con dos soportes de lamas / interruptores (ambos con agarre plana) y el crack una pequeña franja de su borde afilado. Para la salud y la seguridad, el uso de gafas de protección para los ojos (a pesar de que es muy poco probable que las piezas podrían rebotar cuando se quebró la maquinilla de afeitar). Idealmente,producir un borde de gran nitidez que se asemeja a una aguja. Asegúrese de que este "aguja" está firmemente unido al soporte de lama, pero tenga cuidado de evitar cualquier autolesión!
9. Utilizando el micro-cuchillo, preparar un pequeño tamaño de la abertura de unos pocos ommatidia en el ojo izquierdo de la marcha - en alrededor de 4 - 5 ommatidia de la cutícula dorsal justo por encima del ecuador del ojo para dar el paso para el microelectrodo de grabación. Llevar a cabo bajo un microscopio estereoscópico, visualización de la preparación con una gran ampliación.
   Nota: Debido a que el ojo de la mosca siente elástico y resistente a la palpación, el agujero es mejor corte con un -knife "aguja". La técnica de corte es bastante difícil, así que presta mucha atención a la demostración de vídeo. Mantener la marcha titular en ciertas orientaciones (en el stand preparación mosca) puede hacer más fácil la disección. Inicialmente, la microcirugía puede sentir difícil de aprender, pero una vez cometido, la adaptación neuronal mejora gradualmente 3D-percepción y la destreza del investigador.
10. Retire con cuidado el pequeño trozo de córnea de la abertura que se acaba de cortar, dejando al descubierto la retina debajo. Rápidamente cubrir el agujero en el ojo con una pequeña gota de vaselina usando el pelo fino del aplicador vaselina.
    Nota: La jalea de petróleo sirve para múltiples funciones aquí. Previene la deshidratación del tejido y la coagulación de la hemolinfa que rompería el electrodo de registro insertado. Recubre también por cierto, la microelectrodos, reduciendo su capacitancia intramural. Esto puede mejorar la respuesta de frecuencia del sistema de grabación, y por lo que la resolución temporal de las señales neuronales registradas. Evitar que se corra la vaselina por encima del resto del ojo, ya que difumina la óptica.

3. Grabación de R1-R6 fotorreceptores o LMC

1. Siempre estar conectado a tierra cuando se opera el amplificador de microelectrodos (por ejemplo, al tocar la superficie metálica de la jaula de Faraday o mesa antivibraciones), ya que esto impide que uno entregue de forma accidentaling una carga estática a la cabeza etapas, lo que podría dañar los circuitos.
2. Iluminar la plataforma poste preparación mosca desde arriba por dos guías de luz de cuello de ganso (Figura 6 A) (con la fuente de luz fría dentro de la jaula de Faraday), de modo que la mosca-soporte puede ser colocado en el poste en la posición preferida bajo control visual de cerca .

Figura 6. Colocación de la mosca de su titular y los Electrodos para los experimentos (AB) La mosca titular se coloca en la plataforma de grabación que también proporciona control de la temperatura a través de un elemento Peltier (A: plataforma redonda blanca en el centro).. El Cardan-brazo permite un posicionamiento exacto del estímulo de luz a la misma distancia (a través de x, y-rotación) alrededor de la marcha, con la fuente de luz (un extremo haz de fibra óptica líquido o cuarzo) apuntando directamente a su ojo. En muchos de our plataformas, estimulación de la luz es generada por los LED (con los actuales conductores lineales) o por un monocromador. Por lo tanto, sus estímulos llevan un determinado contenido espectral (banda de paso obligatorio), seleccionado entre 300 - 740 nm y cubren 4 - 6 log rango unidad de intensidad (como atenuada por los filtros de densidad neutra separadas). (C) Dos microelectrodos, controlada por micromanipulador separados, están situados en la cabeza de la mosca: el electrodo de referencia (arriba) a través de la ocelos; el electrodo de registro (a la izquierda) a través de la pequeña abertura en el ojo izquierdo. (D) Para la obtención de un número máximo de grabaciones fotorreceptoras, el microelectrodo de grabación es impulsado en el agujero, paralelo al eje proboscis-ocelo. Cuando penetra la punta del electrodo y los sellos a un fotorreceptor, la fuente de luz puede girar libremente está fijado a la posición en la que la célula produce la respuesta máxima tensión a un estímulo de luz dada. Este punto en el espacio se encuentra en el centro de campo receptivo de la célula. Si el agujero is cerca de la cutícula, las penetraciones de LMC pueden además ser alcanzados con este mismo ángulo electrodo (izquierda). Si el agujero está más lejos de la cutícula, otro ángulo de aproximación de electrodo útil para obtener grabaciones de LMC también se muestra (a la derecha). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Montar la mosca titular (con la mosca en ella!) En la plataforma poste preparación mosca. Gire el fly-soporte de manera que el ojo izquierdo de la marcha está directamente frente al investigador (Figura 6B).
4. Insertar el electrodo de referencia contundente suavemente a través Occelli de la mosca en la cápsula de la cabeza utilizando una pequeña micromanipulador gruesa mientras se observa la preparación a través del microscopio estereoscópico (Figura 6C). No empuje el electrodo demasiado profundo, ya que esto puede dañar el cerebro de la mosca.
   1. Alternativamente, insertar el electrodo de referencia en la parte posterior del tórax. Siempre, asegúrese de que la mosca aparece cubierto de brezos (mueve sus antenas) y sus ojos están intactos; no dañado accidentalmente. Si la preparación se ve menos de inmaculada, preparar una nueva mosca para los experimentos.
5. Conducir el microelectrodo grabación afilado en el ojo izquierdo a través de la vaselina cubiertos pequeña abertura preparado con anterioridad. Utilice una gran ampliación en el microscopio estereoscópico y mueva las guías de luz y el plano focal de modo que la localización de la punta del electrodo se hace evidente en 3D por sus patrones de reflectancia.
   Nota: La Figura 6D muestra cómo la cabeza de la marcha se debe colocar de forma ligeramente diferente (con respecto al ángulo de la microelectrodo grabación entra en el ojo) de los fotorreceptores y grabaciones de LMC. Conducir el electrodo en el ojo sin romper que es la fase más difícil del experimento. Si la punta del electrodo no alcanza la pequeña abertura en el ojo, golpeando la córnea, por lo general se rompe.
6. Encienda el amplificador de microelectrodosUna vez que ambos electrodos están firmemente dentro de la preparación, en contacto eléctrico con los fluidos corporales de la mosca.
7. Apague la fuente de luz fría (dentro de la jaula de Faraday) y desconecte de la red eléctrica. Conectar el enchufe a tierra central para minimizar planta de ciclo inducido ruido eléctrico, y mover las guías de luz de cuello de ganso de distancia para que el sistema Cardan-brazo se puede mover libremente alrededor de la marcha. Apagar las luces de la habitación para asegurarse de que la preparación de la mosca se encuentra ahora en una oscuridad relativa.
8. Mida la resistencia del electrodo de registro en el ojo (como se indica en el manual de usuario del amplificador). Utilizar electrodos única grabación en la que la resistencia son 100 - 250 mO.
   Nota: Es prácticamente imposible de conseguir registros intracelulares de alta calidad por <70 mO electrodo. Si la resistencia es <80 mO, es probable que la punta del electrodo se rompe. En este caso, apague el amplificador y cambiar el electrodo de registro.
   1. Una vez que el electrodoy se sustituye en el ojo, encender el amplificador para medir su resistencia. A veces, la punta del electrodo puede ser bloqueada por algunos detritus medida que entra en el tejido. Esto puede remediarse mediante el uso de funciones de moda capacitiva y pulso de corriente del amplificador que normalmente clara por resonancia rápida o repulsión.
9. Ajuste el amplificador de corriente de pinza (CC) o el modo de grabación de puente. Descartar cualquier tipo de diferencia de tensión arbitraria entre los electrodos de registro y de referencia, ya que ambos ahora descansan en el espacio extracelular interconectados eléctricamente, estableciendo el desplazamiento de señal (tensión de grabación) a cero. Siga las señales compensar los cambios usando lectura de la pantalla del amplificador o una pantalla de osciloscopio.
10. Espere 2-3 minutos para el ojo de la mosca a oscuro-adaptación.
11. Conducir la punta del electrodo de registro gradualmente más profundo en el ojo con pequeños pasos micrones 0,1 a 1. Hacer esto con un eje x piezo-paso a paso de un micromanipulador o B a control remotoy girar suavemente el botón de resolución fina de un manipulador manual.
12. Estimular el ojo de la mosca con la breve (1 - 10 ms) destellos de luz como el electrodo de registro se está promoviendo en el tejido.
    Nota: Si el electrodo de registro se coloca en la retina y el ojo funciona normalmente, cada destello de luz hará que una breve y pequeña caída en el voltaje (0,2 a 5 mV hiperpolarización), llamado el electrorretinograma (ERG). Este cambio en el potencial del campo del espacio extracelular es causada por la respuesta colectiva de las células de la retina 'a la luz. Sin embargo, una vez que la punta del electrodo entra en la lámina, cerrando en los países de ideas afines, el ERG se invierte, que muestra las respuestas de despolarización.
13. Mover la fuente de luz alrededor del ojo de la mosca utilizando el sistema Cardan-brazo y encontrar la posición en la que la luz evoca la mayor respuesta del ERG.
    Nota: Esta posición marca el área pequeña en el espacio visual donde los fotorreceptores (o LMC), que se encuentran al lado de la punta del electrodo de registro, Probar su entrada de luz.
14. Penetrar en una célula con el electrodo de registro.
    Nota: La penetración puede ocurrir espontáneamente, o cuando el electrodo es micro dio un paso hacia adelante. Puede facilitarse aún más golpeando suavemente el sistema micromanipulador o utilizando el zumbido funciones del amplificador; estas acciones resuenan la punta del electrodo en el tejido. Cuando el electrodo empala la membrana de los fotorreceptores, entra en su espacio intracelular, la diferencia de tensión entre la grabación y electrodo de referencia cae de repente de 0 mV a -65 mV ~ (entre -55 y -75 mV); mientras que durante las penetraciones de LMC, esta caída es típicamente menor (entre -30 y -50 mV). Estas diferencias de voltaje representan los potenciales de reposo negativos de las células dadas. Dependiendo de la calidad del electrodo de registro (su nitidez) y el proceso celular penetró, la lectura de voltaje del electrodo de registro puede estabilizar rápidamente o gradualmente a la potencial de reposo, como la membrana celularsellos a la capa exterior del electrodo. Pero si la penetración es sólo parcial o pobre, el electrodo normalmente se desliza fuera de la célula con la escalada potencial grabado de nuevo hacia cero.
15. Localizar el centro del campo receptivo de la célula penetrado cuando el electrodo aparece debidamente sellado, mostrando el potencial de membrana estable (potencial de reposo oscuro). Mueva el estímulo de luz intermitente alrededor del ojo de la mosca, utilizando el sistema Cardan-brazo, para encontrar el punto en el espacio visual, en el que el flash de la luz evoca respuesta de tensión máxima de la célula. Bloquear el Cardan-brazo cuando el estímulo luminoso se enfrenta directamente (en puntos) del centro del campo receptivo.
    Nota: En la oscuridad, los fotorreceptores de Drosophila responden a pulsos de luz intensa con 40 - 65 mV respuestas de voltaje de despolarización ^{de 4,5,} mientras que las grabaciones de LMC estables muestran 20 a 45 mV respuestas de hiperpolarización ^9,10,14. glia penetraciones pueden ser muy frecuente, indicado por <-80 mV potenciales de reposo y mucho más lentoy más pequeño (~ 5 mV) saturado despolarizaciones inducidas por la luz. Fotorreceptores de Drosophila con diferentes pigmentaciones oculares, como el blanco de ojos ⁷ y cinabrio, muestran tamaños de respuesta comparables con el de tipo salvaje.
16. Uso del modo del amplificador de corriente-clamp (CC), compensar la capacitancia del electrodo de registro por inyección de pequeñas 0,1 nA y breve (100-200 ms) impulsos de corriente en la célula estudiada para minimizar los artefactos de grabación durante su carga de la membrana.
    Nota: Este procedimiento importante es explicado en detalle en el manual del usuario del amplificador, y debe ser practicado con un modelo de célula eléctrica antes de los experimentos reales.
17. respuestas de tensión registro a pulsos de luz y otros estímulos de interés, que tiene diferentes calidades estadísticos o físicos (tales como las series temporales intensidad de la luz naturalista o patrones aleatorios de contraste). Prueba, por ejemplo, cómo las respuestas registradas cambian con el color oscuro o adaptación.
    Nota: Una precisión posible liGHT-adaptar la célula estudiada por la luz continua de la intensidad preseleccionada mediante la adición de filtros de densidad neutra en la trayectoria de la luz ^4,5. Alternativamente, para prolongado-adaptación a la oscuridad apagar el estímulo de luz durante un tiempo preestablecido. Debido a la estabilidad mecánica del sistema de registro, la alta calidad de los electrodos de registro y la integridad de la preparación, las condiciones de grabación estables pueden a veces durar muchas horas. Por lo tanto, en un buen día, es posible recoger una gran cantidad de datos en diferentes condiciones de adaptación por parte de una sola célula. Cuando el electrodo se desliza fuera de la célula, las respuestas registradas disminuyen y la tensión media comienza a acercarse a cero.
18. Avanzar cuidadosamente el electrodo de registro con el control fino del eje x de la micromanipulador hasta que el electrodo hace contacto y penetra en la siguiente celda (este suele ser el vecino neural más cercano). No mueva el electrodo a lo largo de Y o Z-eje que estas maniobras podrían hacer que el electrodo de "plough el tejido "de lado, dañando las estructuras del ojo!
    Nota: Con un buen electrodo y una preparación saludable, se puede registrar las respuestas de alta calidad de muchos fotorreceptores (pero rara vez de muchos países de ideas afines) en la misma mosca durante un período de varias horas; de vez en cuando, durante toda la jornada laboral (> 8 h) sin deterioro de la señal clara.
19. Guarde los archivos de datos periódicamente con información de identificación, como la fecha, el genotipo y el tipo de célula registrada. Debido a la gran cantidad de datos que pueden ser recogidos en una sesión de grabación con éxito, mantener buenos registros escritos en un laboratorio-libro para el análisis de los datos futuros.

Resultados

El método de grabación de microelectrodos agudo, tal como fue adaptada aquí por el ojo de Drosophila, se puede utilizar para cuantificar de manera fiable el muestreo y el procesamiento neuronal de información en las células de la retina y la lámina, y la comunicación entre ellos ^{4,5,7,8,10,33.} Al usarlo para estudiar la codificación en diferentes poblaciones de tipo salvaje, mutantes o cepas de moscas de la ingeniería genética, el método ha demostrado su valor; no sólo en la cuantificación de los efectos de una mutación, la temperatura, la dieta o de expresión seleccionado ^{3,4,6,9,10,14,30,34,} sino también en la revelación de razones mecanicistas para alterados comportamientos visuales ^14,34. El método también es fácilmente aplicable a otras preparaciones de insectos ^35,36, potenciando los estudios de visión neuroethological. A continuación, mostramos algunos ejemplos de sus aplicaciones exitosas.

Figura 7. VoltajeRespuestas de una mosca de la fruta R1-R6 fotorreceptor a un pulso de luz a los 20 y 25 ^° C. Debido a las penetraciones de microelectrodos afilados son a menudo muy estable, es posible registrar las respuestas de tensión de la misma fotorreceptor R1-R6 a un estímulo de luz dada en diferentes temperaturas ambiente por el calentamiento o enfriamiento de la mosca. En nuestros montajes, la mosca titular se coloca en un sistema de control de temperatura de cerca de bucle basado elemento Peltier. Esto nos permite cambiar la temperatura de la cabeza de la marcha en cuestión de segundos. Una temperatura más alta acelera las respuestas de tensión y de forma característica reduce el potencial de reposo de los fotorreceptores R1-R6 (como se indica por las flechas rojas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Estudiar el efecto de la temperatura sobre la salida de fotorreceptores

° C (Figura 7). Cuantificada antes de ^4,9, el calentamiento reduce el potencial de reposo de un fotorreceptor en la oscuridad, y acelera sus respuestas tensión.

Figura 8. Rendimiento de Señalización de una mosca de la fruta R1-R6 fotorreceptor mejora con la intensidad de la luz (A) de salida de fotorreceptores se atenúen (abajo) y brillante. (Encima; 10.000 veces una luz más brillante) repiten series temporales intensidad de la luz naturalista registrado por la misma microelectrodoen la misma célula a 20 ^o C. Las respuestas al estímulo luminoso son más grandes, ya que integran más muestras, respuestas elementales (protuberancias) a fotones individuales ^4,5,7,8. (B) 20 respuestas de voltaje consecutivos de un segundo de larga se superponen. Se tomaron las respuestas individuales (gris claro) después de que las tendencias adaptativas (flecha en A) había retrocedido (recuadro de puntos en A). Los medios de respuesta correspondientes (las señales) son las huellas más oscuros. La diferencia entre la señal y las respuestas individuales es el ruido. (C) Las células de rendimiento de señalización se cuantificó por las grabaciones de 'relaciones de señal a ruido (SNR) mediante los métodos estándar ^4,5,7,8. Salida de los fotorreceptores tiene alrededor de 64 Hz más amplia gama de señalización fiable en la estimulación luminosa ( '≥1 _brillante, hasta 84 Hz que en el dim (SNR SNR)' _Dim ≥1, hasta 20 Hz), con signal-a-ruido mejora en gran medida; de SNR _Dim ^MAX = 87 a SNR _brillante ^MAX = 1,868. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El estudio de adaptación y codificación neuronal repetitiva por estimulación

La invasividad del método, haciendo relativamente poco daño en las estructuras de la retina y la lámina, lo hace ideal para el estudio del rendimiento de señalización de las células individuales a diferentes estímulos de luz en su estado fisiológico natural cerca in vivo. La figura 8 muestra las respuestas de tensión de un R1- R6 fotorreceptor a un estímulo serie oscuro y brillante repetida naturalista tiempo intensidad de la ^luz, a 20 ^° C, mientras que la figura 9 ° C. Las grabaciones pre y postsinápticos se realizaron por separado a partir de dos diferentes moscas porque registros intracelulares simultáneos de dos microelectrodos afilados de la misma mosca, una en la retina y el otro en la lámina, son demasiado difíciles de ser viable ^30.

Figura 9. Respuestas de tensión de una mosca de la fruta R1-R6 fotorreceptores y LMC a las repetidas naturalista estimulación a 25 ^° C (A) R1-R6 (gris) y LMC (negro) salidas registradas por diferentes microelectrodos de diferentes moscas. (B) 20 pre-luz totalmente adaptada consecutiva (arriba) y las respuestas postsinápticas (a continuación) para el mismo patrón de estímulo naturalista con las respuestas individuales, se muestra en gris claro unad los correspondientes medios de respuesta (las señales) como las huellas oscuras. La diferencia entre la señal y las respuestas individuales es el ruido. (C) Las células de rendimiento de señalización se cuantificó por las grabaciones de 'relaciones de señal a ruido (SNR). LMC tiene salida de aproximadamente 10 Hz más amplia gama de señalización fiable (SNR _'LMC ≥1, hasta 104 Hz) de salida R1-R6 (SNR' _R ≥1, hasta 94 Hz). Ambas relaciones señal-ruido son altos (SNR _LMC ^MAX = 142, SNR _R ^MAX = 752), y como el ruido de la grabación fue baja, sus diferencias reflejan diferencias de codificación reales entre las células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Después del inicio del estímulo, las grabaciones típicaLy muestre la adaptación rápida tendencias que se desaparecen en gran parte dentro de 5-6 seg. A partir de entonces, las células producen respuestas muy consistentes a cada 1 seg presentación larga de estímulo (cada recuadro de puntos encierra 20 de estos). La repetibilidad de las respuestas se hace evidente cuando estos se superponen (Figura 8B y en la Figura 9B). Las respuestas individuales son las huellas grises delgadas, y su significan el grueso trazo más oscuro. La respuesta media se toma como la señal neural, mientras que el ruido neural es la diferencia entre la media y cada ^4,5,9,37,38 respuesta individual. Las respectivas relaciones de señal a ruido en el dominio de frecuencia (Figura 8C y la Figura 9C) se obtuvieron por Fourier-transformación de los fragmentos de datos de señal y ruido en espectros de potencia, y dividiendo el espectro de potencia media de la señal con el correspondiente espectro de potencia de ruido media ^{4, 5,9,37,38.} Característicamente, las máximas relaciones señal a ruido of las salidas neuronales registrados a la estimulación naturalista son altas (100 - 1000), y en las preparaciones más estables con ruido de grabación muy baja puede alcanzar valores >> 1000 (por ejemplo, la Figura 8C.). Nótese también que el calentamiento se expande el ancho de banda de las células de señalización fiable ⁴ (SNR _'brillante ≥ 1); por ejemplo, la diferencia relativa entre los dos R1-R6S en las figuras 8 y 9, respectivamente, es de 10 Hz (84 a 20 ^° C y 94 Hz a 25 ^o C).

Uno puede estimar más velocidad de transferencia de información a partir de su relación señal-ruido de cada célula mediante el uso de la ecuación de Shannon ^32, o mediante el cálculo de la diferencia entre la entropía y la entropía de ruido tasas de las respuestas 'a través del método de extrapolación de triple ^39. Más detalles acerca de los análisis teóricos de la información, así como su uso y limitacioness específicamente con este método se dan en las publicaciones anteriores ^7,8,39.

Figura 10. Respuestas de tensión de una mosca del asesino R1-R6 fotorreceptores y LMC a las repetidas naturalista estimulación a 19 ^° C (A) R1-R6 (gris) y LMC (negro) resultados registrados por el mismo microelectrodo de la misma mosca; postsináptico primera y más tarde presináptica, como el electrodo se avanzó en el ojo. (B) 20 pre consecutiva (arriba) y postsinápticos (abajo) respuesta (trazas de color gris claro) para el mismo patrón de estímulo naturalista fueron capturados después de la adaptación inicial (recuadro de puntos en A). Sus medios son las señales (los trazos más oscuros en la parte superior), mientras que sus respectivas diferencias con respecto a las respuestas individuales dan el ruido. (C) El correspondiente SignaRatios-l-ruido (SNR) se calcularon como en las figuras 8C y 9C. LMC tiene salida sobre un rango más amplio de 100 Hz de señalización fiable (SNR _'LMC ^MAX ≥1, hasta 234 Hz) de salida R1-R6 (SNR' _{R ^MAX} ≥1, hasta 134 Hz). Ambas relaciones señal-ruido son altos (SNR _LMC ^MAX = 137, SNR _R ^MAX = 627), y como la misma microelectrodo se utilizó en las grabaciones, sus diferencias reflejan diferencias reales en las salidas neurales pre- y postsinápticos. Estos resultados implican que el sistema de grabación tenía bajo nivel de ruido, y su influencia en los análisis fue marginal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Estudios Vision Neuroethological

El método también se puede utilizar para registrar las respuestas pre y postsinápticos de tensión de los ojos compuestos de diferentes especies de insectos ^7,8,35,36 (Figura 10), lo que permite estudios comparativos neuroethological de procesamiento de la información visual. Para el sistema de grabación presentada, la única adaptación requerida es de preparación de los nuevos titulares, cada uno con una abertura de dimensiones adecuadas para las especies estudiadas. Estas grabaciones son ejemplares de un asesino de mosca hembra (Coenosia attenuata). Ellos muestran respuestas de tensión intracelulares de un fotorreceptor R1-R6 y LMC a la estimulación repetitiva luz idéntica, tal como se utiliza para los homólogos de Drosophila en la Figura 9, pero a 19 ^o C. En este caso, tanto los datos pre y postsinápticos se registraron de la misma mosca; uno después del otro, con el mismo electrodo de registro (lleno de 3 M KCl) primero avanzando a través de la lámina lateral antes de entraring la retina frontal. En comparación con los datos de Drosophila a 25 ^° C, los datos Coenosia - incluso a la temperatura más fría - muestra las respuestas con dinámicas más rápidas; ampliar la gama de señalización fiable (relación señal a ruido >> 1) sobre un rango de frecuencias más amplio. Tales adaptaciones funcionales en la codificación neuronal de estímulos naturalistas están en consonancia con el estilo de vida depredador Coenosia 's ^36, que requieren alta precisión la información espacio-temporal para lograr comportamientos de caza aéreas rápidas.

Discusión

Hemos presentado los pasos clave básicos de cómo usar microelectrodos convencionales afilados para registrar respuestas intracelulares de fotorreceptores R1-R6 y LMC en ojos de mosca intactos. Este método se ha optimizado, junto con herramientas de hardware y software a medida, durante los últimos 18 años para proporcionar grabaciones de alta calidad y larga duración para responder a una amplia gama de preguntas experimentales. Al invertir tiempo y recursos para construir configuraciones experimentales robustas y precisas, y para producir microelectrodos con propiedades eléctricas favorables, las grabaciones de alta calidad pueden convertirse en la norma en cualquier laboratorio que trabaje en neurofisiología visual de Drosophila . Si bien los sistemas de grabación y estimulación de luz bien diseñados son importantes para la ejecución rápida de diferentes paradigmas experimentales, hay tres pasos de procedimiento que son aún más críticos para lograr grabaciones exitosas: (i) hacer la preparación de la mosca con un daño ocular mínimo, (ii) tirar de microelectrodos con las propiedades eléctricas correctas y (iii) introducir el electrodo de grabación en el ojo sin romper su punta. En última instancia, para registrar datos significativos, el investigador debe comprender la base física de la electrofisiología y cómo fabricar microelectrodos adecuados para los tipos de células objetivo.

Por lo tanto, las limitaciones de esta técnica vienen marcadas principalmente por la paciencia, la experiencia y la capacidad técnica del investigador. Debido a que esta técnica puede llevar mucho tiempo dominarla para las células pequeñas de Drosophila , es aconsejable que los electrofisiólogos en formación practiquen primero con ojos de insectos más grandes, como la mosca³⁶ o la langosta³⁵, utilizando el mismo equipo. Una vez que la realización de grabaciones intracelulares de alta calidad desde los fotorreceptores e interneuronas más grandes se convierte en rutina, es hora de pasar al ojo de Drosophila . Otra limitación de la técnica se refiere a la identificación celular. Las células de Drosophila penetradas se pueden cargar electroforéticamente con colorantes, incluido el amarillo de Lucifer o la neurobiotina. Sin embargo, debido al pequeño tamaño de la punta de los microelectrodos, la electroforesis funciona de manera menos eficiente que con electrodos de menor resistencia, como los electrodos de parche. Además, los microelectrodos rellenos de colorante tienen propiedades eléctricas menos favorables, lo que hace que sea mucho más difícil registrar respuestas de alta calidad con ellos de los fotorreceptores de Drosophila y las LMC.

Un problema técnico que ocurre a veces es una señal de entrada inestable o una falta total de ella. Esto a menudo se asocia con que la señal de voltaje se desvía constantemente o es más alta / más baja que el rango de grabación del amplificador. En la mayoría de las ocasiones, este comportamiento se debe a que el electrodo de registro está bloqueado (o su punta es demasiado fina, con una resistencia o capacitancia intramuros demasiado alta, para realizar correctamente cambios rápidos de señal). Aunque se puede intentar desbloquear la punta zumbando la capacitancia del electrodo, lo que a veces funciona, a menudo la situación se resuelve mejor simplemente cambiando el electrodo de registro. Esto puede requerir ajustes de parámetros en el instrumento extractor de microelectrodos para reducir la resistencia de la punta de los nuevos electrodos. La punta del electrodo también puede bloquearse en las preparaciones, para las cuales tomó demasiado tiempo cubrir el orificio corneal con vaselina. El contacto prolongado con el aire puede secar el tejido de la retina recién expuesto, convirtiendo su capa superficial en una sustancia similar al pegamento. Si este es el caso, el investigador generalmente ve una mancha roja de tejido atascada en el electrodo de registro al sacarlo del ojo. La única solución aquí es hacer una nueva preparación. La vaselina puede proporcionar muchos beneficios para los registros electrofisiológicos: (i) previene la coagulación de la hemolinfa que podría romper la punta del electrodo; (ii) recubre la punta del electrodo reduciendo su capacitancia intramural, lo que reduce la constante de tiempo del electrodo y, por lo tanto, tiene el potencial de mejorar la resolución temporal de las señales neuronales registradas^40,41; (iii) mantiene limpia la punta del electrodo, facilitando las penetraciones; y después de la penetración, (iv) incluso puede ayudar a sellar la punta del electrodo a la membrana celular⁴².

La señal puede ser inestable o perderse cuando el cable de cloruro de plata del portaelectrodos se rompe o se descloriza; en cuyo caso simplemente reemplace o reclorice el cable viejo. La señal faltante también puede deberse a que uno (o ambos) de los portaelectrodos no está conectado de forma segura a sus conectores. Sin embargo, es extremadamente inusual que un equipo no funcione correctamente. Si la señal es indetectable y se han agotado todas las demás posibilidades, pruebe que cada parte del aparato de grabación, incluidos el cabezal y el amplificador, los filtros de paso bajo y los convertidores AD/DA, estén conectados correctamente y funcionen normalmente. Una forma de lograr esto es reemplazar cada instrumento por otro de una plataforma que se sabe que funciona normalmente. Alternativamente, use un generador de señales para verificar el rendimiento de los componentes electrónicos uno por uno.

Pero quizás el problema técnico más común al que se enfrenta el electrofisiólogo es el de registrar el ruido. En términos generales, el ruido de registro es la actividad eléctrica observada distinta de la respuesta neuronal directa a un estímulo dado. Debido a que la preparación de la mosca, cuando se hace correctamente, es muy estable, el ruido observado (más allá de la variable natural de las respuestas) con mayor frecuencia resulta de bucles de tierra en el equipo de grabación, o se capta de dispositivos eléctricos cercanos. Dicho ruido es típicamente un zumbido de red de 50/60 Hz y sus armónicos; pero a veces compuesto de formas de onda más complejas. Para averiguar el origen del ruido, retire el soporte de preparación de moscas de la configuración, conecte los electrodos de grabación y referencia a través de una gota de Ringer de mosca (o colóquelos en un pequeño baño de solución de Ringer; consulte el paso 1.2.6) y grabe la señal en modo CC o puente. Si se observa ruido en la señal grabada, esto probablemente significa que el ruido es externo a la preparación de la mosca.

Otra buena prueba para identificar el origen del ruido es reemplazar los portaelectrodos con un modelo de celda eléctrica conectado al amplificador. En una configuración idealmente configurada y conectada a tierra, la señal grabada ahora debería estar prácticamente libre de ruido, mostrando solo ruido de bits estocástico del convertidor AD (¡en el mejor de los casos ni siquiera eso!). Si el ruido aún está presente, vuelva a verificar que todo el equipo de la plataforma esté correctamente conectado a tierra. Un enfoque conveniente para detectar bucles de tierra es: (i) desconectar todos los cables de conexión a tierra de todas las partes dentro de la plataforma; ii) asegurarse de que, después de hacer esto, cada parte esté realmente aislada del suelo, por medio de un ohmímetro; (iii) conecte las partes, una por una, a la tierra central directamente, no a través de ninguna otra parte de la plataforma. Intente también cambiar las configuraciones del equipo. Por ejemplo, a veces alejar la computadora y el monitor de la plataforma puede reducir el ruido; Sin embargo, en otras ocasiones, mover la computadora dentro del bastidor del equipo reduce el ruido. También vale la pena desenchufar el equipo cercano para ver si se reduce el ruido o proteger los componentes adicionales. Además, intente desenchufar o reemplazar diferentes componentes del equipo de grabación, especialmente los cables BNC (que pueden tener conexiones a tierra defectuosas). Si solo se observa ruido de bits cuando se usa el modelo de celda, la fuente de ruido inicial son los electrodos o la preparación de la mosca en sí. Por ejemplo, podría ser que el electrodo de referencia esté tocando inadvertidamente un nervio motor o fibras musculares activas dentro de la cápsula de la cabeza (o perturbando los músculos de vuelo en el tórax, si se coloca allí). Por lo general, es más sencillo preparar una nueva mosca para la grabación, teniendo cuidado de minimizar el daño a la mosca. Pero si el ruido persiste y es de banda ancha, es probable que los electrodos no sean óptimos para los experimentos; demasiado agudo / fino (por lo tanto, demasiado ruidoso) o simplemente incorrecto para el propósito; Incluso hemos visto electrodos de cuarzo que actúan como antenas, ¡captando débiles señales de transmisión! Aunque la iteración de la configuración de los parámetros del instrumento extractor para generar los microelectrodos correctos para grabaciones consistentes de alta calidad de tipos de celdas específicos puede requerir mucho esfuerzo, vale la pena. Una vez que los electrodos de grabación están bien adaptados para los experimentos, pueden proporcionar grabaciones duraderas de excelente calidad.

Las técnicas de registro de microelectrodos afilados se pueden aplicar de manera similar para estudiar el procesamiento de información neuronal en multitud de preparaciones, incluidas diferentes capas de procesamiento en los ojos y el cerebro de los insectos^43,44. Debido a que las puntas de los microelectrodos se pueden hacer muy finas, generalmente dañan las células estudiadas menos que la mayoría de las aplicaciones de pinzas de parche. Es importante destacar que los modernos amplificadores de microelectrodos de muestreo y retención permiten un buen control de las propiedades eléctricas de las puntas^40,45-47. Por lo tanto, cuando se aplica correctamente, esta técnica puede proporcionar datos confiables de preparaciones in vivo^3,5,7-10,44 o in vitro⁴⁸ con una alta relación señal-ruido a una resolución inferior a un milisegundo. Tal precisión sería imposible con las técnicas de imagen óptica actuales, que son más ruidosas y lentas. Además, el método se puede utilizar para caracterizar las propiedades de la membrana eléctrica de las celdas pequeñas tanto en configuraciones de pinza de corriente como de voltaje^{5,29,33,36,40-42,49}, proporcionando datos valiosos para los enfoques de modelado biofísico y empírico^{7,8,11,33,49-54} que vinculan los experimentos con la teoría.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio estereoscópico con zoom para la preparación de moscas	Olympus	SZX12 DFPLFL1.6x PF oculares: WHN30x-H/22	Capaz de un aumento de ~150X con una larga distancia de trabajo; soporte de montaje de mesa de acero pesado a medida
Microscopio estereoscópico en la configuración intracelular	·   Olympus	Olympus SZX7; oculares: WHN30x-H/22	Se necesitan oculares 30X para ver bien los reflejos de la punta del electrodo cuando se introduce a través del pequeño orificio corneal en el ojo
Microscopio Nikon	Nikon SMZ645; oculares: C-W30x/7
Mesa antivibración	Melles Griot	Con orificios métricos M6 en la placa	de pruebasNuestros equipos a medida tienen un gran agujero perforado a través de la gruesa placa de pruebas que deja entrar el poste de la plataforma de preparación de moscas (alberga un disipador de calor de cobre con electrónica) desde abajo
Micromanipuladores Newport
	Narishige	Narishige NMN-21	En nuestras configuraciones intracelulares, se utilizan diferentes sistemas de micromanipuladores para introducir los electrodos de registro de Shap en el ojo de la mosca. Todos los manipuladores enumerados están proporcionando con éxito grabaciones estables y duraderas de los fotorreceptores de Drosophila y las LMC.
Huxley Bertram	Huxley eje xyz con control
Sensapex	Sensapex triple eje
Mä rzhä M	ä del usuario; rzhä usuario DC-3K con paso piezoeléctrico de eje x adicional y controlador
Soportes magnéticos	Cualquier base magnética con interruptor de encendido/apagado servirá		Por ejemplo, para manejar cables dentro de la jaula de Faraday
Portaelectrodos Aparato	Harvard	ESP/W-F10N
Alambre de plata	World Precision Instruments	AGW1510	0,3 - 0,5 mm de diámetro; necesita ser clorado para los portaelectrodos
Fuente de luz de fibra óptica	Muchos diferentes, incluidos
	Tecnología		ultrafina Para entregar el estímulo de luz LED al sistema de brazo cardán. Utilizamos guías de luz líquida y de cuarzo (que van desde UV hasta IR)
Thorn Labs
Fly Cathing Tube		P80-50P 50ml Cent. Tube PP., Paquete de 100 Piezas	Corte la parte inferior cónica del tubo de centrífuga de plástico de 50 ml y pegue una punta de pipeta de 1 ml en él.
Sistema de adquisición digital	National Instruments
Amplificador de microelectrodo de pinza de corriente/voltaje de un solo electrodo	npi SEC-10LX	http://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.html	¡Rendimiento excepcional!
Estándar de etapa de cabeza	(+/- 150 nA)	npi SEC-10LX
	OptoLED de 2 canales (Cairn Research Ltd., Reino Unido)		Muchos de nuestros sistemas de estímulo son construidos internamente
de adquisición y análisis diseñado y construido
	Muchas empresas para elegir		Biosyst; Sistema basado en Matlab escrito a medida para el trabajo experimental y teórico en el laboratorio de Juusola
Computadora personal o Mac			Asegúrese de que la PC o Mac sea compatible con el sistema de adquisición de datos y el software
Sistema de brazo cardán	Diseñado y construido		Proporciona un posicionamiento preciso x, y, z de los estímulos luminosos Sistema de
control de temperatura Peltier	diseño y construcción
	propia Blindaje		electromagnético contra el ruido
Capilares de vidrio de borosilicato filamentado	Diámetro exterior: 1 mm
	Sutter Instrument Company	Modelo P-2000 láser Tirador de micropipetas aplanadas/marrones	Para electrodos de referencia de borosilicato, utilice el programa preestablecido #11 (electrodos de parche): Calor = 350; Filamento = 4; Velocidad 36; Retraso = 200).1.2.1). Para los electrodos de registro de borosilicato, use el programa preestablecido # 12 (esto generalmente extrae buenos objetos punzantes convencionales   para registros de fotorreceptores): Calor = 355; Filamento = 4; Velocidad 50; Retraso = 225; Tirón = 150. En el caso de las grabaciones de LMC, que requieren electrodos con puntas más finas, es necesario ajustar estos valores. Para la extracción de capilares de cuarzo, el manual P-2000 sugiere programas para microelectrodos de punta fina. Estos programas' Los parámetros preestablecidos sirven como puntos de partida útiles para modificaciones sistemáticas con el fin de generar electrodos con buen éxito de penetración y bajo ruido de grabación.
Solución de timbre extracelular para el electrodo	de referencia Productos químicos de Fisher Scientific	10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, sacarosa	Consulte la receta en la sección de protocolo
Solución de KCl de 3 M para llenar el microelectrodo de registro filamentado	Sales de Fisher Scientific 10010310	, KCl
Vaselin
VaselinaHojas de afeitar de acero no inoxidable Portacuchillas
/rompedor Fine	Science Tools By Dumont	10053-09	9 cm
Blu-tack	Bostik		Alternativamente, use arcilla para moldear
Pinzas	Fine Science Tools By Dumont	11252-00	#5SF (puntas súper finas)