Altamente sensible y rápido de detección de fluorescencia con un analizador portátil de FRET

Resumen

Este protocolo describe la cuantificación rápida y altamente sensible de Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) datos de sensor utilizando un analizador de FRET portátil a medida. El dispositivo se utilizó para detectar la maltosa dentro de un rango de temperatura crítico que maximiza la sensibilidad de detección, lo que permite la evaluación práctica y eficiente de contenido de azúcar.

Resumen

Las recientes mejoras en la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) sensores han permitido su uso para detectar varias moléculas pequeñas, incluyendo iones y aminoácidos. Sin embargo, la intensidad de señal débil innata de sensores FRET es un reto importante que impide su aplicación en diversos campos y hace que el uso de los caros, de alta gama fluorómetros necesario. Anteriormente, hemos construido un analizador de FRET de alto rendimiento rentable que puede medir específicamente la relación de dos bandas de longitud de onda de emisión (530 y 480 nm) para lograr una alta sensibilidad de detección. Más recientemente, se descubrió que los sensores FRET con las proteínas de unión periplásmicas bacterianas detectar ligandos con una sensibilidad máxima en el rango de temperatura crítica de 50 - 55 ° C. Este informe describe un protocolo para evaluar el contenido de azúcar en muestras de bebidas disponibles en el mercado utilizando nuestro analizador de FRET portátil con un sensor FRET-temperatura específica. Nuestros resultados mostraron que el precalentamiento adicionalproceso del sensor FRET aumenta significativamente la señal de relación de FRET, para permitir la medición más precisa de contenido de azúcar. El analizador y el sensor FRET medida se han aplicado con éxito para cuantificar el contenido de azúcar en tres tipos de bebidas comerciales. Anticipamos que mejora aún más la reducción del tamaño y el rendimiento de los equipos va a facilitar el uso de analizadores portátiles en entornos en los equipos de gama alta no está disponible.

Introducción

Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) se ha utilizado ampliamente como un sensor biométrico para detectar moléculas pequeñas tales como azúcares, iones de calcio, y los aminoácidos ^1-4. biosensores FRET contienen proteínas fluorescentes, proteínas fluorescentes cian (CFP), y proteínas fluorescentes amarillas (YFPs), que están condensados ​​a ambos extremos de proteínas de unión periplásmicas (PBP). Los azúcares se unen a las PBP ubicadas en el medio del sensor FRET, causando cambios estructurales en el sensor que posteriormente altera la orientación y distancia de transición de dipolo de las dos proteínas fluorescentes en cada extremo de....

Protocolo

1. Preparación de biosensor

1. Construir el plásmido pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6, siguiendo el protocolo establecido ^{previamente-2.}
2. Inocular 5 ml de caldo de Luria (LB) con una única colonia de una cepa de Escherichia coli DE3 y se incuba a 37 ° C durante 16 horas con agitación.
3. Transferencia de 1 ml de la cultura O / N en un matraz de 500 ml que contiene 100 ml de LB y se incuba a 37 ° C en una incubadora con agitación hasta que la densidad óptica a 600 nm (OD ₆₀₀₎ alcanza 0,5 (aproximadamente 3 horas).
4. Recoger las células en un tubo cónico de 50 ml mediante centrifugación a 1000 xg durante 20 mi....

Resultados

Para llevar a cabo el análisis cuantitativo de contenido de azúcar utilizando el analizador de FRET, es necesario construir una curva ajustada la estimación de la concentración de azúcar blanco a partir de la relación de FRET observada. Sea r definir la relación de la intensidad de emisión de CFP en 480 nm y la intensidad de emisión de YFP genera en 530 nm (Ec. 1).

Discusión

Este protocolo permite la cuantificación rápida y eficiente del contenido de azúcar en las muestras de bebidas, utilizando un analizador de FRET a medida ⁷ a una temperatura óptima para sensores FRET. El analizador se ha diseñado con un LED ultravioleta de bajo costo banda de 405 nm recientemente desarrollado como fuente de luz y dos fotodetectores con un fotodiodo de silicio. Este dispositivo es más rentable que otros fluorómetros comparables. El dispositivo mostró alta sensibilidad de detección, especialmen.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
LB	BD	#244620
isopropilo β-D-tiogalactósido (IPTG)	Sigma	I6758
Ampicilina	Sigma	A9518
Tri-HCl	Bioneer	C-9006-1
PMSF	Sigma	78830
EDTA	Bioneer	C-9007
DTT	Sigma	D0632
NaCl	Junsei	19015-0350
solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Gibco	70011-044	0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% Na2HPO4, 0,024% KH2OP4, pH 7,4
SOC			2% triptona, 0,5% extracto de levadura, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Recurso de glucosa
Q	Amersham Biosciences	17-1177-01	6 &veces; Columna de cromatografía de intercambio aniónico de 30 mm
HisTrap HP1	Amersham Biosciences	29-0510-21
Cubeta de cuarzo	Sigma	Z802875
AKÄ KTAFPLC	Amersham Biosciences	18-1900-26	una cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC)
Cary Eclipse	VarianInc		un espectrofotómetro de fluorescencia
VICTOR	PerkinElmer	2030-0050	un lector de placas multietiqueta
E. coli JM109 (DE3)	Promega		Celdas electrocompetentes
A (Bebida)	Corea Yakult Co. (Corea)	Birak	Bebidas fermentadas
B (Bebida)	Lotte Foods (Corea)	Epro	Refresco
C (Bebida)	Lotte Foods (Corea)	Getoray	Bebida deportiva