Este artículo presenta un protocolo para la producción de nanopartículas basadas en proteínas que cambia la superficie hidrofóbica a hidrófila. La nanopartícula producida es un ensamblaje de copolímeros diblock de gliadina-cianoacrilato. El recubrimiento por pulverización con la nanopartícula producida cambia la superficie del material objetivo a una superficie hidrófila.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Un protocolo para la producción de nanopartículas gliadina-cianoacrilato para el recubrimiento hidrofílico
En este artículo
Resumen
Resumen
Este artículo presenta un protocolo para la producción de nanopartículas a base de proteínas que cambia la superficie hidrófoba a hidrófila mediante un simple revestimiento por pulverización. Estas nanopartículas son producidas por la reacción de polimerización de cianoacrilato de alquilo en la superficie de moléculas (gliadina) de proteínas de cereales. Alquil cianoacrilato es un monómero que se polimeriza al instante a TA cuando se aplica a la superficie de los materiales. Su reacción de polimerización se inicia por las trazas de especies débilmente básicos o nucleófilos en la superficie, incluyendo la humedad. Una vez polimerizado, los cianoacrilatos de alquilo polimerizados muestran una fuerte afinidad con los materiales objeto porque grupos nitrilo se encuentran en la cadena principal de poli (cianoacrilato de alquilo). Las proteínas también funcionan como iniciador para esta polimerización, ya que contienen grupos amina que pueden iniciar la polimerización de cianoacrilato. Si la proteína agregada se utiliza como un iniciador, agregado proteico está rodeado por el hidrófobopoli (cianoacrilato de alquilo) cadenas después de la reacción de polimerización de cianoacrilato de alquilo. Mediante el control de la condición experimental, se producen partículas en el rango nanométrico. Las nanopartículas producidas adsorben fácilmente a la superficie de la mayoría de materiales incluyendo vidrio, metales, plásticos, madera, cuero, y telas. Cuando la superficie de un material se pulveriza con la suspensión de nanopartículas producida y se enjuagó con agua, la estructura micelar de nanopartículas cambia su conformación, y las proteínas hidrófilas están expuestos al aire. Como resultado, la superficie recubierta con nanopartículas cambia a hidrófilo.
Introducción
El objetivo de este artículo es mostrar el protocolo para la preparación de suspensión de nanopartículas que modifica la propiedad humectante de los materiales mediante una simple pulverización. La suspensión de nanopartículas presentada está hecha de cianoacrilato de alquilo1 y una proteína de cereal, gliadina2,3. Durante el proceso de fabricación, se forman agregados de proteínas en etanolacuoso 4. La reacción posterior con el monómero (cianoacrilato de alquilo) produce la nanopartícula que está compuesta por un núcleo de proteína rodeado por cadenas poliméricas lineales [poli(cianoacrilato de alquil)]5.
Los poli(cianoacrilato de alquilo) son biodegradables y se han utilizado para la producción de nanopartículas mediante polimerización en emulsión6. Esta reacción es iniciada espontáneamente por los grupos hidroxilo disociados del agua o por otros grupos nucleofílicos en el medio de reacción7. En el caso de la reacción presentada en este artículo, los grupos amina en la superficie de los agregados de proteínas inician la reacción de polimerización de los monómeros de alquil cianoacrilato5,8. Como resultado de esta reacción, se forman nanopartículas en el medio de reacción. El núcleo de la nanopartícula son agregados de proteínas y la capa externa son cadenas de poli(cianoacrilato de alquilo) (PACA). La nanopartícula preparada tiene una fuerte afinidad con la mayoría de los materiales (más precisamente, cualquier material al que PACA pueda adsorberse) y se adhiere a su superficie para formar una capa delgada a escala nanométrica. Un simple recubrimiento en aerosol convierte instantáneamente la superficie de los materiales en hidrófila.
La gliadina es una de las principales fracciones del gluten, que se encuentra en los endospermos del trigo. Las gliadinas son principalmente proteínas monoméricas con pesos moleculares de alrededor de 28.000 a 55.000. Los enlaces no covalentes, como los enlaces de hidrógeno, los enlaces iónicos y los enlaces hidrofóbicos, son responsables de la agregación de gliadinas2. Aunque la gliadina se elige como reactivo en este artículo, muchas otras proteínas también se pueden usar para el mismo propósito. Sin embargo, la condición de reacción debe modificarse en consecuencia, ya que la condición para inducir la agregación depende del tipo de proteína que se empleará8. En comparación con otras proteínas, la gliadina está más disponible, la purificación es simple y el costo de producción es bajo. Aunque se elige el cianoacrilato de etilo (ECA) como monómero para la reacción presentada, también se pueden utilizar otros cianoacrilatos de alquilo para la misma reacción. La razón para elegir ECA es que está fácilmente disponible a bajo costo.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Desengrasante gliadina Comercial
- Medir 150 ml de acetona con un cilindro graduado y se vierte en 250 ml matraz Erlenmeyer.
- Mientras se agita con una barra magnética en un agitador magnético a temperatura ambiente, añadir 30 g de polvo de gliadina comercial. Sellar la abertura del matraz con papel de aluminio, y mantener en agitación O / N en la campana.
- Filtrado de la solución con un papel de filtro.
- Se lava el filtrado con acetona fresca (ca. 50 ml). Dejar reposar durante 10 minutos para permitir que la acetona se drene.
- Transferir el filtrado junto con el papel de filtro por debajo de un plato grande tal como un plato cuadrado de cultivo celular. Cubrir todo el plato con un papel de filtro grande para frenar la evaporación de la acetona residual.
- Permitir el filtrado se seque por completo en la campana O / N. Almacenar la gliadina desgrasada en un recipiente hermético a temperatura ambiente.
2. Preparación de la gliadina purificada
- Medir 150 ml de water con un cilindro graduado y se vierte en 1.000 ml matraz Erlenmeyer.
- Medir 350 ml de etanol absoluto con un cilindro de desastre y se vierte en el mismo 1.000 ml Erlenmeyer. Agitar vigorosamente (800 - 1.000 rpm) con una barra magnética hasta que se genera ninguna burbuja de la mezcla de solución.
- Mientras se agita, añadir 20 g de polvo de gliadina desgrasada comercial. Añadir gliadina en pequeñas cantidades a la vez para evitar la formación de grumos que contiene aire en el medio. Mantener en agitación O / N.
- Transferir toda la solución a un cilindro lío 1000 ml. Dejar reposar durante dos días. Durante este tiempo, las impurezas se precipitan en la parte inferior del cilindro.
- Transferir el sobrenadante a un evaporador rotatorio con una pipeta, y eliminar el etanol a partir del sobrenadante tanto como sea posible. Como se reduce el porcentaje de etanol, gliadina aparecerá en la solución como agregado.
- Congelar la solución que contiene agregados de gliadina por inmersión / rotación en metanol/ Mezcla de hielo seco y se seca por congelación a -70 ° C bajo vacío. Antes de la liofilización, asegúrese de que toda la solución se congela sin ningún tipo de líquido.
NOTA: La gliadina liofilizado se forma un sólido poroso. - Aplastar a la gliadina liofilizado con mortero y mortero, y se muelen con un molinillo de café para obtener una fina potencia (<0,5 mm). Transferir el producto en un recipiente hermético y se almacena a temperatura ambiente.
3. Polimerización Reacción de la CEPA con gliadina
- Colocar un vial de centelleo (volumen es de alrededor de 20 ml) en un equilibrio, y la tara de pesaje. Añadir 3,2 g de agua destilada y 6,8 g de etanol absoluto en el vial scitillation.
- Mueva el vial de centelleo en un agitador magnético, se puso una barra de giro magnético (20 x 3 mm) en el vial y agitar vigorosamente (800 - 1000 rpm) hasta que ninguna burbuja de aire se genera a partir de la mezcla acuosa de etanol.
- Añadir 40 l de HCl 4 N en el vial mientras se agita. Se añaden 20 mg de gliadina en el vial mientras STI Rring, y seguir revolviendo hasta que el polvo se haya disuelto completamente gliadina en la mezcla acuosa de etanol.
- Después de asegurarse que la solución gliadina es claro para los ojos desnudos, añada lentamente 80 - 100 l de la CEPA, mientras que la velocidad de agitación sigue siendo de 800 - 1.000 rpm.
- Bajar la velocidad de agitación a 500 rpm, y continuar agitando durante 1 hora. A medida que avanza la reacción, observar la turbidez lo que indica que la reacción de polimerización está en curso.
- Cuando se termina la reacción, transferir la solución en tubos de centrífuga, y equilibrar el peso de los tubos. Centrifugar el producto de reacción a 10.000 xg durante 20 min. Durante este tiempo, precipitados y nanopartículas de productos secundarios permanecen en el sobrenadante. El componente principal de producto secundario es homopolímero de PACA.
- Después de la centrífuga, la transferencia de la suspensión de nanopartículas producida (sobrenadante) con una pipeta a un vial de centelleo (o cualquier recipiente hermético), y almacenarla a temperatura ambiente.
- Preparar 10 g de etanol acuoso al 68% en peso mezclando 3,2 g de agua y 6,8 g de etanol absoluto en 20 ml vial de centelleo y se agita hasta que se genera ninguna burbuja de la mezcla de solución.
- Añadir 40 l de HCl 4 N a la mezcla de solución mientras se agita. Añadir 50 l de suspensión de nanopartículas a la solución de etanol preparada mientras se agita.
- Medir el tamaño de nanopartícula con Dynamic Light Scattering (DLS) mediante el uso de la solución de muestra preparada anteriormente y seguir las instrucciones del fabricante.
NOTA: El tamaño del producto final tiene que ser menor que 200 nm. Si es mayor que 200 nm, el producto no será estable durante un período prolongado de tiempo. nanopartículas más grandes se producen cuando el empleado CEPA no es fresco.
5. El examen del producto
- Preparar una placa de vidrio tal como un espejo de mano. Lavar la superficie de la placa de cristal con agua de jabón. Rinse la superficie de la placa de vidrio con un chorro de agua. Se seca la superficie limpiada o uso sin secado para el siguiente paso.
- Rociar la suspensión de nanopartículas obtenido en 3.6) en una parte de la placa de vidrio, y enjuagar la superficie con agua corriente inmediata.
- Rociar agua pura en la superficie de la placa de vidrio. Observar la capa de agua asimiento superficie recubierta (pulverizó con la suspensión de nanopartículas), mientras que la superficie no protegida es clara.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Las nanopartículas se pueden preparar en diversas condiciones de reacción. Formas de gliadina se agregan en una amplia gama de contenido de etanol 5. Sin embargo, el tamaño de los agregados debe ser lo más pequeño posible, ya que una capa adicional (es decir., La CEPA polimerizado) se añadirá a este agregado y este proceso hará que el tamaño final más grande. Si el tamaño final de partícula es demasiado grande, la partícula será inestable y fácilmente ser precipitado....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Hay varios pasos críticos en la producción de la suspensión de nanopartículas. Si la gliadina purificada contiene impurezas, la reacción con ECA producirá productos secundarios. Aunque estos productos no deseados se pueden eliminar del medio de reacción durante la etapa de centrifugación, reduce el rendimiento del producto principal. Si la solución de gliadina preparada durante el paso experimental 2.3) no muestra una separación clara entre el sobrenadante y el precipitado después de dos días, la solución debe permanecer...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
La mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación o respaldo por parte del Departamento de Agricultura de EE. UU. El USDA es un proveedor y empleador que ofrece igualdad de oportunidades.
Agradecimientos
Gracias al Sr. Jason Adkins para la asistencia técnica de expertos.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Monómero de cianoacrilato de etilo (ECA) | K& R International (Laguna Niguel, CA) | I-1605 | Se puede utilizar cualquier ECA puro. |
| Gliadin | MGP Ingredients, Inc (Atchison, KS) | El regalo de la empresa | Gliadin se puede comprar en Sigma-Aldrich (cat #: G3375-25G). En lugar de gliadina, cualquier comercial Se puede utilizar gluten. |
| HCl | Cualquiera | Se puede utilizar cualquier producto químico de grado reactivo. | |
| Acetona | Cualquiera | Se puede utilizar cualquier producto químico de grado reactivo. | |
| Metanol | Cualquiera | Se puede utilizar cualquier producto químico de grado reactivo. | |
| Etanol (100%) | Cualquiera | Se puede utilizar cualquier producto químico de grado reactivo. | |
| Papel de filtro | Cualquiera | Se puede utilizar cualquier grado de papel de filtro de más de 10 cm. | |
| Plato cuadrado de cultivo celular | Cualquiera | Se puede utilizar cualquier plato de más de 20 x 20 cm. | |
| Molinillo de café | Cualquiera | Se puede utilizar cualquier molinillo de café. | |
| Evaporador rotativo | Cualquiera | Se puede utilizar cualquier evaporador rotativo. | |
| Liofilizador | Cualquiera | Cualquier liofilizador que pueda alcanzar -70 & grados; Se puede utilizar C. | |
| Centrífuga | Cualquiera | Se puede utilizar cualquier centrífuga que pueda aplicar 1.000 x g. | |
| Agitador magnético | Cualquiera | Se puede utilizar cualquier agitador magnético que pueda girar la barra de giro a 1.000 rpm. | |
| Dispersión dinámica de luz (DLS) | analizador de potencial NanoBrook Omni Zeta | DLS de Brookhaven Instruments Corporation de cualquier empresa. | |
| Microscopio electrónico de barrido (SEM) | Carl Zeiss Inc. | Se puede utilizar cualquier SEM. | |
| Ángulo de contacto dinámico (DCA) | Thermo Cahn | Se puede utilizar cualquier DCA. |
Referencias
- Vauthier, C., Dubernet, C., Fattal, E., Pinto-Alphandary, H., Couvreur, P. Poly(alkylcyanoacrylates) as biodegradable materials for biomedical applications. Adv. Drug Deliver. Rev. 55, 519-548 (2003).
- Wieser, H. Chemistry of gluten proteins. Food Microbiol. 24, 115-119 (2007).
- Bietz, J. A., Wall, J. S. Identity of high molecular weight gliadin and ethanol soluble glutenin subunits of wheat: Relation to gluten structure. Cereal Chem. 57, 415-421 (1980).
- Kim, S. Production of composites by using gliadin as a bonding material. J. Cereal Sci. 54, 168-172 (2011).
- Kim, S., Kim, Y. Production of gliadin-poly(ethyl cyanoacrylate) nanoparticles for hydrophilic coating. J. Nanopart. Res. 16, 1-10 (2014).
- Behan, N., Birkinshaw, C., Clarke, N. Poly n-butyl cyanoacrylate nanoparticles: a mechanistic study of polymerisation and particle formation. Biomaterials. 22, 1335-1344 (2001).
- Nicolas, J., Couvreur, P. Synthesis of poly(alkyl cyanoacrylate)-based colloidal nanomedicines. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 1, 111-127 (2009).
- Kim, S., Evans, K., Biswas, A. Production of BSA-poly(ethyl cyanoacrylate) nanoparticles as a coating material that improves wetting property. Colloid Surface. B. 107, 68-75 (2013).
- Lander, L. M., Siewierski, L. M., Brittain, W. J., Vogler, E. A. A systematic comparison of contact angle methods. Langmuir. 9, 2237-2239 (1993).
- Davies, J., Nunnerley, C. S., Brisley, A. C., Edwards, J. C., Finlayson, S. D. Use of Dynamic Contact Angle Profile Analysis in Studying the Kinetics of Protein Removal from Steel Glass, Polytetrafluoroethylene, Polypropylene, Ethylenepropylene Rubber, and Silicone Surfaces. J. Colloid Interf. Sci. 182, 437-443 (1996).
- Giolando, D. M. Nano-crystals of titanium dioxide in aluminum oxide: A transparent self-cleaning coating applicable to solar energy. Sol. Energy. 97, 195-199 (2013).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
